Ctbs蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用，CTBS是啮齿类动物精子上特有的精卵结合受体，CTBS蛋白仅在啮齿类动物的精子上具有特异性表达，在人的精子上并不表达该蛋白，且CTBS抗体能抑制小鼠的精卵结合。所筛选到的精卵结合抑制剂为地喹氯铵，其半抑制常数＜100nM。本发明采用地喹氯铵作为鼠类的生育控制药物进行使用，能有效的控制啮齿类动物的精卵结合，达到控制鼠类的种群数量，实现无需农药即可控制鼠害目的，且其天敌食用该药物却不会产生危害。
【专利说明】CTBS蛋白作为精卵结合受体的朝点在筛选精卵结合抑制剂中的应用
【技术领域】
本发明涉及一种CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用。
【背景技术】
地喹氯铵(Dequalinium chloride, CAS#522_51_0)，作为一种PKC抑制剂作为抗癌药物进行使用，其IC50为7-18 μ M，同时它也是一种选择性蜂毒明肽敏感型钾离子通道阻断齐U，其IC50为1.1μΜ[1，2’3，4]。近年来，地喹氯铵作为一种阳离子表面活性剂用于非抗生素类的抗菌药物(药名为“克菌定”)。最近，发现地喹氯铵还可在纳摩尔水平上抑制微生物来源的几丁质水解酶的活性气地喹氯铵对人体的毒性甚微，不影响人类的生殖，对眼和皮肤有刺激作用。对小鼠的致死量为:口服150-1000mg/kg体重，皮下注射70mg/kg体重，静脉注射1.9mg/kg体重；对兔子和狗的口服致死量为500mg/kg体重(MSDS)。
而二 -N-乙酰壳二糖酶，即D1-N-acetylchitobiase (简称CTBS)是几丁质水解酶的一种，在哺乳动物中，只在啮齿类和人类体内的肝脏有表达[6’7’8]。
物种的生殖隔离是一种普遍的自然现象，卵子透明带上的碳水化合物与精子上蛋白质的相互作用是其中的机制之一。有报道表明，寡糖Lewis X能结合到小鼠精子，并可特异地抑制小鼠的体外受精，提示其精子上识别Lewis X的蛋白可能参与了小鼠的生育隔离[9]，但仅是一种猜测。
鼠害是指鼠类对农业等生产造成的危害。鼠类属哺乳纲(Mam-malia)啮齿日(Rodentia)动物，共有1600多种。鼠类繁殖次数多，孕期短，产仔率高，性成熟快，数量能在短期内急剧增加；它的适应性很强，除南极大陆外，在世界各地的地面、地下、树上、水中都能生存，不论平原、高山、森林、草原以至沙漠地区都有其踪迹，常对农业等生产酿成巨大灾害。
因此急需提供一种能控制鼠类生育的药物，尤其是抑制鼠类的精卵结合的抑制剂，并且该抑制剂能在野外抑制鼠害且其天敌食用无害，无需采用农药对鼠害进行抑制。
本发明参考文献如下:
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【发明内容】
本发明的目的在于提供一种CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用，并筛选到一种能抑制鼠类的精卵结合的地喹氯铵抑制剂，该抑制剂可用于控制鼠类的种群数量，从而达到无需采用农药即可控制鼠害的效果，并且鼠类的天敌食用该药物无害。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案:
一种CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用。
上述的CTBS为二 -N-乙酰壳二糖酶，即D1-N-acetylchitobiase，简称为CTBS。
我们经研究发现CTBS是啮齿类动物精子上特有的精卵结合受体，CTBS仅在啮齿类动物的精子上表达，并且CTBS抗体可以抑制小鼠的体外授精，而在人的精子上并不表达这一蛋白。
经筛选获得的抑制剂地喹氯铵通过抑制小鼠的精卵结合可以有效地抑制小鼠的体外受精，而对人体的毒性作用甚微。经研究发现，所述地喹氯铵是所述鼠类的精卵结合中精子上特异性表达的受体蛋白CTBS抑制剂，CTBS是鼠类的精卵结合中必不可少的蛋白，因此将地喹氯铵作为鼠类的生育控制药物进行使用，并且地喹氯铵可以抑制小鼠的体外受精，所述抑制剂地喹氯铵与CTBS结合的亲和力强，抑制鼠类的精卵结合的活性高，实验表明其抑制精卵结合的半抑制常数< IOOnM ;进一步的，其半抑制常数是50nM。
因此，地喹氯铵作为鼠类的生育控制药物，可以用于控制鼠类的种群数量，从而达到控制鼠害的目的。
本发明采用CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点筛选精卵结合抑制剂，经筛选获得的地喹氯铵能有效的控制啮齿类动物的精卵结合，达到控制鼠类的种群数量，实现无需农药即可控制鼠害目的，且其天敌食用该药物却不会产生危害。
【专利附图】
【附图说明】
图1为地喹氯铵对小鼠体外受精的抑制图。
图2A为Lewis X受体的鉴定思路图。
图2B为利用Lewis X探针找到的小鼠精子蛋白图。
图2C为蛋白的质谱分析图谱。
图3为CTBS的抗体抑制Lewis X结合到小鼠精子的图片。
图4为Lewis X在小鼠精子上的结合位置与CTBS在小鼠精子的定位结果图片。
图5A为重组的人源CTBS与小鼠卵子透明带发生相互作用的示意图。
图5B为重组的人源CTBS与小鼠卵子透明带发生相互作用的明场和荧光照片。
图5C为CTBS抗体的乳胶颗粒富集到的RFP或RFP-CTBS蛋白免疫印迹分析。
图6为CTBS抗体对小鼠精子顶体反应的诱导效应图。
图7为不同浓度的CTBS抗体抑制小鼠的体外受精图。
图8为小鼠、大鼠和人精子裂解液的蛋白印记分析图。【具体实施方式】
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
实施例1:
我们经实验发现CTBS在啮齿类动物的精子上表达，并且CTBS抗体可以抑制小鼠的体外授精，而在人的精子上并不表达这一蛋白。其实验方法如下:
(一)小鼠精子上CTBS的发现:
利用路易斯寡糖XWPLewis X，简写为LeX)探针鉴定到了小鼠精子上的CTBS，并证明CTBS能结合到小鼠的卵子透明带。
(1)首先对LewisX受体进行鉴定,其鉴定流程如图2A所示,包括能识别Lewis X的类凝集素蛋白的鉴定流程和内源性的含有Lewis X修饰的蛋白鉴定流程。其原理是将牛血清白蛋白(BSA)表面修饰Lewis X制成拟糖蛋白LeX-BSA，并将该拟糖蛋白进一步修饰上紫外交联试剂[6_(生物素酰氨基)-2-(p-叠氮苯甲酰氨基)己酰氨基]乙基-1, 3 ' - 二硫代丙酸磺基琥拍酰亚胺酯(Sulfo-NHS-2-(6-[biotinamido]-2-(p_azido benzamido)-hexanoamido) ethyl-1, 3 1 -dithiopropionate,简称 Sulfo-SBED)作为LewisX探针。该探针经紫外交联到小鼠精子后形成Lewi s X探针-受体复合物，利用能识别Lewis X的四棱莲凝集素(Lotus tetragonolobus agglutinin,简称LTA)树脂来分离纯化精子细胞裂解液中的Lewis X探针-受体复合物。由于小鼠精子内可能含有内源性LewisX修饰的蛋白，设置了内源性的含有Lewis X修饰的蛋白鉴定流程作为对照来区分这类蛋白(对照组)。一般来说，两个流程鉴定到的差异蛋白即有可能是Lewis X的受体蛋白。
(2)利用LewisX探针找到的小鼠精子上的蛋白:
利用Lewis X探针找到小鼠精子蛋白，如图2B所示。将图2B中的差异条带1、2、3、4取下，用于蛋白的质谱鉴定，如图2C所示的质谱分析图，经分析，有可能与碳水化合物作用的蛋白身份如表1所示。
表1
【权利要求】
1.CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用，其特征在于，CTBS是啮齿类动物精子上特有的精卵结合受体，CTBS蛋白仅在啮齿类动物的精子上具有特异性表达，在人的精子上并不表达该蛋白，且CTBS抗体能抑制小鼠的精卵结合。
3.如权利要求1或2所述的CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用，其特征在于，所筛选到的精卵结合抑制剂为地喹氯铵；所述地喹氯铵是所述鼠类的精卵结合中精子上特异性表达的受体蛋白CTBS的抑制剂。
4.如权利要求3所述的CTBS蛋白作为精卵结合受体的靶点在筛选精卵结合抑制剂中的应用，其特征在于，所述地喹氯铵抑制鼠类精卵结合的半抑制常数< ΙΟΟηΜ。
【文档编号】G01N33/68GK103743910SQ201310739152
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】顾一骅, 徐文平, 施惠娟, 杨军 申请人:上海市计划生育科学研究所, 华东理工大学