天川颗粒产品特征指纹图谱构建方法
【专利摘要】一种天川颗粒产品指纹图谱的建立方法，包括制备供试品溶液；制备对照品溶液；并用高效液相色谱仪进行测定，得到天川颗粒的指纹图谱。径几十批次天川颗粒HPLC-UV指纹图谱的对比，确定其共有指纹特征，得到标准指纹图谱。具有有测定方法操作简便、精密度高、特征峰多、稳定性好、重现性好、准确可靠、易于掌握的特点等特点。注重药材指标性化学成分与制剂药效学研究结果的关联性和指纹图谱的整体面貌特征，为完整、准确评价天川颗粒的质量提供了新的控制标准，达到更科学的控制产品质量的目的。
【专利说明】天川颗粒产品特征指纹图谱构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用高效液相色谱方法建立天川颗粒的HPLC-UV标准特征指纹图谱，对天川颗粒的质量进行监控，属于药物分析【技术领域】。
【背景技术】
[0002]中风病是中老年人常见病、多发病，是老年人三大死因之一，具有发病、致残、死亡和复发率四高的特点，是威胁中老年人身体健康的主要疾病。近年来，全国、全世界发病率有增高趋势，心脑血管疾病已上升为死亡原因首位，全国每年大约有100万人罹患中风疾病，急性后期，往往遗留有诸多的后遗症，如偏瘫、痴呆、失语等，对病人及家庭和社会造成极大的痛苦和负担。遗留的后遗症，每年大约需治疗3?6个月。因此，在深入探讨风痰瘀血、痹阻脉络在中风病发病机理中的重要地位的基础上，拟平肝熄风、祛痰化瘀、活血通络之法，用天麻、川芎、怀牛膝和野葛根合理组方。根据《中药、天然药物注册分类及申报资料要求》的规定，开发成疗效可靠、服用方便、便于携带的天川颗粒。
[0003]研究表明，天麻具有抗惊厥，镇痛，改善微循环，抗缺血、缺氧和抗炎、增强机体免疫功能等作用。其主要提取物天麻素具有镇静、抗惊厥、抗癫痫、镇痛，增加脑血流量，改善椎基底动脉、小脑前下动脉、小脑后下动脉、迷路动脉及内耳供血不足，保护神经细胞，促进心肌细胞能量代谢的功能。葛根可以明显降低血压，减缓心率，降低心肌耗氧量，改善心肌代谢，抗心肌缺血，缩心肌梗死范围，可以显著扩张冠状动脉，改善微循环，还可以降低血脂和血糖。其提取物葛根素、葛根总黄酮等，可以明显扩张冠状血管，改善缺血区的心肌血供；可以抗血小板聚集，防治动脉粥样硬化，改善微循环，并通过影响细胞膜对K+、Na+、Ca+的通透性及影响儿茶酚胺释放，降低心肌兴奋性而发挥抗心律失常作用。
[0004] 申请人:对该天川颗粒，有一个在先申请，专利号CN200410036481.8 ;本申请是对该天川颗粒质量精制方法的进一步探索研究。
[0005]中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。中药指纹图谱能比较全面地反映中药中化学物质的种类和数量，是实现中药真实性、质量可控性和产品稳定性的可行模式，能更好地反映中药的内在品质。随着中药指纹图谱及化学模式识别技术的发展，指纹图谱技术已日益成为国内外广泛接受的中药质量评价模式。基于定量指纹图谱技术的中药质量控制模式是以传统中医药理论体系为基础的综合控制模式，体现了中医药整体治疗的特色。定量指纹图谱技术在原有指纹图谱的方法上赋予指纹图谱大量的定性、定量信息共同应用于中药质量控制，对指纹图谱中多个目标成分尤其是有效成分进行准确定量，使中药尤其中药复方制剂质量控制更加准确，能更真实反映中药复方制剂的质量状况和产品组成，产品的质量和稳定性更加可靠。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种天川颗粒指纹图谱的建立方法及标准特征指纹图谱。
[0007]本发明通过对天川颗粒高效液相色谱指纹图谱的研究，提供了一种较好的质量控制方法，使天川颗粒的质量控制更加完善和科学。
[0008]实现本发明目的的技术解决方案为:
[0009]1.研制一种天川颗粒产品指纹图谱的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步骤:
[0010](I)供试品溶液的制备:精密称取天川颗粒I?50g，加水10?500ml，超声20?45min溶解后，冷却后取少量上清液过0.45 μ m微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；
[0011](2)对照品溶液的制备:精密称取天麻素、对羟基苯甲醇、盐酸川芎嗪、对羟基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蜕皮甾酮、大豆苷元适量，分别用纯化水、纯化水、70%甲醇、纯化水、纯化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成浓度分别为lmg/ml的溶液,再吸取对照品溶液各适量，用纯化水稀释成浓度分别为0.05 μ g/ml的对照品溶液；
[0012](3)色谱条件:色谱柱为5μηι Fortis-C18, 250X4.6mm:流动相为0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脱方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 0.5 ?1.5ml/min ;柱温 25 ?35°C;检测波长:220nm ;进样量为10?100 μ I ;
[0013](4)供试品溶液的测定:精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，得到天川颗粒的HPLC-UV图谱。
[0014]按照本方法对10批供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，记录色谱图，得到10批天川颗粒的HPLC-UV图谱；并进行分析比较，得到由测定所得的指纹图谱中有21个共有峰，其中，以3号峰即天麻素峰为参照物峰，分别为:
[0015]峰1:相对保留时间0.4495,相对峰面积0.060% ；
[0016]峰2:相对保留时间0.568,相对峰面积0.060 ；
[0017]峰3 (天麻素):相对保留时间1.000,相对峰面积1.000 ；
[0018]峰4 (对羟基苯甲醇):相对保留时间1.602，相对峰面积0.184 ；
[0019]峰5 (盐酸川芎嗪):相对保留时间2.016，相对峰面积0.067 ；
[0020]峰6:相对保留时间2.246,相对峰面积0.116 ;
[0021]峰7:相对保留时间2.366，相对峰面积0.079 ；
[0022]峰8:相对保留时间2.407，相对峰面积0.379 ；
[0023]峰9 (对羟基苯甲醛):相对保留时间2.626，相对峰面积0.144 ；
[0024]峰10:相对保留时间2.665,相对峰面积0.718 ；
[0025]峰11:相对保留时间3.020,相对峰面积0.079 ；
[0026]峰12 (葛根素):相对保留时间3.227，相对峰面积1.839 ；
[0027]峰13:相对保留时间3.284±0.21，相对峰面积0.415 ；
[0028]峰14:相对保留时间3.373,相对峰面积0.545 ；
[0029]峰15:相对保留时间3.475,相对峰面积0.067 ；
[0030]峰16 (大豆苷):相对保留时间3.754，相对峰面积0.355 ；
[0031]峰17 (阿魏酸):相对保留时间3.923，相对峰面积0.074 ；
[0032]峰18:相对保留时间4.185,相对峰面积0.119 ；
[0033]峰19:相对保留时间4.252,相对峰面积0.254 ；
[0034]峰20 ( β -蜕皮甾酮):相对保留时间5.405，相对峰面积0.063 ；[0035]峰21 (大豆苷元):相对保留时间6.077，相对峰面积0.161 ；
[0036]这些共有特征峰构成了天川颗粒产品指纹特征，图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，相似度大于0.9 ;可以作为天川颗粒产品标准指纹图谱。
[0037]2、供试品天川颗粒Ig标准特征指纹图谱的建立
[0038](I)供试品溶液的制备:精S称取天川颗粒lg，加水IOml,超声20min溶解后,冷却后取少量上清液过0.45 μ m微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；
[0039](2)对照品溶液的制备:精密称取天麻素、对羟基苯甲醇、盐酸川芎嗪、对羟基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蜕皮甾酮、大豆苷元适量，分别用纯化水、纯化水、70%甲醇、纯化水、纯化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成浓度分别为lmg/ml的溶液,再吸取对照品溶液各适量，用纯化水稀释成浓度分别为0.05 μ g/ml的对照品溶液；
[0040](3)色谱条件:色谱柱为5μηι Fortis-C18, 250X4.6mm:流动相为0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脱方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 0.5ml/min ;柱温 35°C ;检测波长:220nm ;进样量为20 μ I ；
[0041](4)供试品溶液的测定:精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，得到天川颗粒的HPLC-UV图谱。
[0042](5)标准特征指纹图谱的建立:
[0043]精密吸取10批供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，记录色谱图，得到10批天川颗粒的HPLC-UV图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的天川颗粒HPLC-UV标准特征指纹图谱。所得的天川颗粒HPLC-UV标准特征指纹图谱如说明书附图中的图2所示，以3号峰即天麻素峰为参照物峰，计算共有峰峰数为21个，其中，以3号峰即天麻素峰为参照物峰，相对保留时间和相对峰面积分别为:
[0044]峰1:相对保留时间0.455,相对峰面积0.064 ；
[0045]峰2:相对保留时间0.568,相对峰面积0.068 ；
[0046]峰3 (天麻素):相对保留时间1.000,相对峰面积1.000 ；
[0047]峰4 (对羟基苯甲醇):相对保留时间1.602，相对峰面积0.184 ；
[0048]峰5 (盐酸川芎嗪):相对保留时间2.016，相对峰面积0.057 ；
[0049]峰6:相对保留时间2.244,相对峰面积0.089 ；
[0050]峰7:相对保留时间2.360,相对峰面积0.062 ；
[0051]峰8:相对保留时间2.408,相对峰面积0.412 ；
[0052]峰9 (对羟基苯甲醛):相对保留时间2.627，相对峰面积0.107 ；
[0053]峰10:相对保留时间2.666，相对峰面积0.723 ；
[0054]峰11:相对保留时间3.022,相对峰面积0.072 ；
[0055]峰12 (葛根素):相对保留时间3.229，相对峰面积1.820 ；
[0056]峰13:相对保留时间3.287，相对峰面积0.471 ;
[0057]峰14:相对保留时间3.375，相对峰面积0.554 ；
[0058]峰15:相对保留时间3.477,相对峰面积0.068 ；
[0059]峰16 (大豆苷):相对保留时间3.756，相对峰面积0.356 ；
[0060]峰17 (阿魏酸):相对保留时间3.926，相对峰面积0.069 ；[0061]峰18:相对保留时间4.188，相对峰面积0.125 ；
[0062]峰19:相对保留时间4.255，相对峰面积0.287 ；
[0063]峰20 ( β -蜕皮甾酮):相对保留时间5.406，相对峰面积0.058 ；
[0064]峰21 (大豆苷元):相对保留时间6.080，相对峰面积0.158 ;
[0065]这些共有特征峰构成了天川颗粒产品指纹特征，图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，相似度大于0.9 ;可以作为天川颗粒产品标准指纹图谱。
[0066]3、供试品天川颗粒IOg标准特征指纹图谱的建立:
[0067](I)供试品溶液的制备:精密称取天川颗粒10g，加水50ml，超声45min溶解后，冷却后取少量上清液过0.45 μ m微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；
[0068](2)对照品溶液的制备:精密称取天麻素、对羟基苯甲醇、盐酸川芎嗪、对羟基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蜕皮甾酮、大豆苷元适量，分别用纯化水、纯化水、70%甲醇、纯化水、纯化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成浓度分别为lmg/ml的溶液,再吸取对照品溶液各适量，用纯化水稀释成浓度分别为0.05 μ g/ml的对照品溶液；
[0069](3)色谱条件:色谱柱为5μηι Fortis-C18, 250X4.6mm:流动相为0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脱方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 1.0ml/min ;柱温 30°C ;检测波长:220nm ;进样量为10 μ I ；
[0070](4)供试品溶液的测定:精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，得到天川颗粒的HPLC-UV图谱。
[0071](5)标准特征指纹图谱的建立:
[0072]精密吸取10批供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，记录色谱图，得到10批天川颗粒的HPLC-UV图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的天川颗粒HPLC-UV标准特征指纹图谱。所得的天川颗粒HPLC-UV标准特征指纹图谱以3号峰即天麻素峰为参照物峰，计算共有峰峰数为21个，其中，以3号峰即天麻素峰为参照物峰，相对保留时间和相对峰面积分别为:
[0073]峰1:相对保留时间0.450,相对峰面积0.060 ；
[0074]峰2:相对保留时间0.568,相对峰面积0.060 ；
[0075]峰3 (天麻素):相对保留时间1.000,相对峰面积1.000 ；
[0076]峰4 (对羟基苯甲醇):相对保留时间1.602，相对峰面积0.184 ；
[0077]峰5 (盐酸川芎嗪):相对保留时间2.016，相对峰面积0.067 ；
[0078]峰6:相对保留时间2.246,相对峰面积0.116 ;
[0079]峰7:相对保留时间2.366，相对峰面积0.079 ；
[0080]峰8:相对保留时间2.407，相对峰面积0.379 ；
[0081]峰9 (对羟基苯甲醛):相对保留时间2.626，相对峰面积0.144 ；
[0082]峰10:相对保留时间2.665,相对峰面积0.718 ；
[0083]峰11:相对保留时间3.020,相对峰面积0.079 ；
[0084]峰12 (葛根素):相对保留时间3.227，相对峰面积1.839 ；
[0085]峰13:相对保留时间3.284,相对峰面积0.415 ；
[0086]峰14:相对保留时间3.373,相对峰面积0.545 ；[0087]峰15:相对保留时间3.475，相对峰面积0.067 ；
[0088]峰16 (大豆苷):相对保留时间3.754，相对峰面积0.355 ；
[0089]峰17 (阿魏酸):相对保留时间3.923，相对峰面积0.074 ；
[0090]峰18:相对保留时间4.185,相对峰面积0.119 ；
[0091]峰19:相对保留时间4.252,相对峰面积0.254 ；
[0092]峰20 ( β -蜕皮甾酮):相对保留时间5.405，相对峰面积0.063 ；
[0093]峰21 (大豆苷元):相对保留时间6.077，相对峰面积0.161。
[0094]这些共有特征峰构成了天川颗粒产品指纹特征，图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，相似度大于0.9 ;可以作为天川颗粒产品标准指纹图谱。
[0095]4、供试品天川颗粒50g标准特征指纹图谱的建立:
[0096](I)供试品溶液的制备:精密称取天川颗粒50g，加水500ml，超声30min溶解后，冷却后取少量上清液过0.45 μ m微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；
[0097](2)对照品溶液的制备:精密称取天麻素、对羟基苯甲醇、盐酸川芎嗪、对羟基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蜕皮甾酮、大豆苷元适量，分别用纯化水、纯化水、70%甲醇、纯化水、纯化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成浓度分别为lmg/ml的溶液,再吸取对照品溶液各适量，用纯化水稀释成浓度分别为0.05 μ g/ml的对照品溶液；
[0098](3)色谱条件:色谱柱为5μηι Fortis-C18, 250X4.6mm:流动相为0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脱方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 1.5ml/min ;柱温 25°C ;检测波长:220nm ;进样量为100 μ I ；
[0099](4)供试品溶液的测定:精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，得到天川颗粒的HPLC-UV图谱。
[0100](5)标准特征指纹图谱的建立:
[0101]精密吸取10批供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，记录色谱图，得到10批天川颗粒的HPLC-UV图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的天川颗粒HPLC-UV标准特征指纹图谱。所得的天川颗粒HPLC-UV标准特征指纹图谱以3号峰即天麻素峰为参照物峰，计算共有峰峰数为21个，其中，以3号峰即天麻素峰为参照物峰，相对保留时间和相对峰面积分别为:
[0102]峰1:相对保留时间0.456,相对峰面积0.038 ；
[0103]峰2:相对保留时间0.568,相对峰面积0.054 ；
[0104]峰3 (天麻素):相对保留时间1.000,相对峰面积1.000 ；
[0105]峰4 (对羟基苯甲醇):相对保留时间1.602，相对峰面积0.182 ；
[0106]峰5 (盐酸川芎嗪):相对保留时间2.015，相对峰面积0.074 ；
[0107]峰6:相对保留时间2.247，相对峰面积0.134 ;
[0108]峰7:相对保留时间2.365,相对峰面积0.085 ；
[0109]峰8:相对保留时间2.406,相对峰面积0.356 ；
[0110]峰9 (对羟基苯甲醛):相对保留时间2.624，相对峰面积0.169 ；
[0111]峰10:相对保留时间2.664,相对峰面积0.715 ；
[0112]峰11:相对保留时间3.018,相对峰面积0.083 ；[0113]峰12 (葛根素):相对保留时间3.225，相对峰面积1.852 ；
[0114]峰13:相对保留时间3.282，相对峰面积0.377 ；
[0115]峰14:相对保留时间3.371，相对峰面积0.540 ；
[0116]峰15:相对保留时间3.473,相对峰面积0.066 ；
[0117]峰16 (大豆苷):相对保留时间3.751，相对峰面积0.355 ；
[0118]峰17 (阿魏酸):相对保留时间3.920，相对峰面积0.078 ；
[0119]峰18:相对保留时间4.182,相对峰面积0.115 ；
[0120]峰19:相对保留时间4.249,相对峰面积0.231 ；
[0121]峰20 ( β -蜕皮甾酮):相对保留时间5.403，相对峰面积0.067 ；
[0122]峰21 (大豆苷元):相对保留时间6.075，相对峰面积0.164 ；
[0123]这些共有特征峰构成了天川颗粒产品指纹特征，图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，相似度大于0.9 ;可以作为天川颗粒产品标准指纹图谱。
[0124]本发明与现有技术相比，其显著优点是:
[0125](I)本发明特征峰的选择更注重药材指标性化学成分与制剂药效学研究结果的关联性和指纹图谱的整体面貌特征，避免了因只测定其中一个或两个化学成分而判断制剂整体质量的片面性，减少人为处理产品质量达标的可能性。为完整、准确评价制剂的质量提供了新的控制标准，从而能更好的控制制剂的质量；
[0126](2)本发明基于指纹图谱用多指标成分(包括9个已知成分)控制产品质量，保证了产品质量的长期稳定性，疗效的安全性和可靠性；
[0127](3)本发明具有测定方法操作简便、精密度高、稳定性好、重现性好、易于掌握的特
占.[0128](4)本发明提供了一种天川颗粒的检测方法，在相同测定条件下所获得的天川颗粒成品的特征指纹图谱的特征指纹图谱重合性好，测定重复性好，达到更科学的控制制剂的目的。
[0129]下面结合附图对本发明作进一步详细阐述。
【专利附图】
【附图说明】
[0130]图1本发明提供的供试品天川颗粒Ig的标准特征指纹图谱，图中从左至右分别标出了其共有特征峰I至21号；
[0131]图2本发明提供的供试品天川颗粒IOg的标准特征指纹图谱，图中从左至右分别标出了其共有特征峰I至21号；
[0132]图3本发明提供的供试品天川颗粒50g的标准特征指纹图谱，图中从左至右分别标出了其共有特征峰I至21号；
[0133]图4本发明提供的10批天川颗粒Ig的HPLC-UV图谱；
[0134]图5本发明提供的10批天川颗粒IOg的HPLC-UV图谱；
[0135]图6本发明提供的10批天川颗粒50g的HPLC-UV图谱。
【具体实施方式】
[0136]以下结合实施例对本发明进一步阐述:[0137]实施例1供试品天川颗粒Ig标准特征指纹图谱的建立
[0138]1、仪器与试药
[0139]岛津LC-20A高效液相色谱仪，包括LC-20AT四元梯度泵、D⑶-20A5在线脱气机、CT0-10AS柱温箱、SIL-20A自动进样器、LCsolution工作站；98-1_Β型电子调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司);Fff-100高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。
[0140]甲醇(色谱纯，美国TEDIA公司)，磷酸(分析纯，天津市巴斯夫化工有限公司)，自制纯化水。
[0141]天麻素、对羟基苯甲醇、盐酸川芎嗪、对羟基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、β -蜕皮留酮、大豆苷元对照品均购自中国药品生物制品检定所。
[0142]2、标准特征指纹图谱的建立
[0143](I)供试品溶液的制备:取天川颗粒lg，精密称定，加水10ml，超声20min，溶解后，放冷，取少量过0.45 μ m微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；
[0144](2)对照品溶液的制备:精密称取天麻素、对羟基苯甲醇、盐酸川芎嗪、对羟基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、β_蜕皮留酮、大豆苷元适量，置20ml量瓶中，用纯化水溶解并定容至刻度，再精密吸取Iml置IOml量瓶中，用纯化水定容至刻度，0.45 μ m微孔滤膜过滤，取续滤液作为对照品溶液。
[0145](3)色谱条件:色谱柱为5μηι Fortis-C18, 250X4.6mm:流动相为0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脱方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 0.5ml/min ;柱温 35°C ;检测波长:220nm ;进样量为20 μ I。
[0146](4)供试品溶液的测定:精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，得到天川颗粒的HPLC-UV图谱。
[0147](5)标准特征指纹图谱的建立:精密吸取10批供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，记录色谱图，得到10批天川颗粒的HPLC-UV图谱。通过比较分析10批天川颗粒的HPLC-UV图谱，进行相似度评价，共确定21个共有峰，以3号峰即天麻素峰为参照物峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，分别为:
[0148]峰1:相对保留时间0.455,相对峰面积0.064 ；
[0149]峰2:相对保留时间0.568,相对峰面积0.068 ；
[0150]峰3 (天麻素):相对保留时间1.000,相对峰面积1.000 ；
[0151]峰4 (对羟基苯甲醇):相对保留时间1.602，相对峰面积0.184 ；
[0152]峰5 (盐酸川芎嗪):相对保留时间2.016，相对峰面积0.061 ；
[0153]峰6:相对保留时间2.244,相对峰面积0.109 ；
[0154]峰7:相对保留时间2.360,相对峰面积0.072 ；
[0155]峰8:相对保留时间2.408,相对峰面积0.382 ；
[0156]峰9 (对羟基苯甲醛):相对保留时间2.627，相对峰面积0.137 ;
[0157]峰10:相对保留时间2.666，相对峰面积0.723 ；
[0158]峰11:相对保留时间3.022，相对峰面积0.072 ；
[0159]峰12 (葛根素):相对保留时间3.229，相对峰面积1.830 ；[0160]峰13:相对保留时间3.287，相对峰面积0.417 ；
[0161]峰14:相对保留时间3.375，相对峰面积0.554 ；
[0162]峰15:相对保留时间3.477，相对峰面积0.068 ；
[0163]峰16 (大豆苷):相对保留时间3.756，相对峰面积0.356 ；
[0164]峰17 (阿魏酸):相对保留时间3.926，相对峰面积0.069 ；
[0165]峰18:相对保留时间4.188,相对峰面积0.125 ；
[0166]峰19:相对保留时间4.255,相对峰面积0.257 ；
[0167]峰20 ( β -蜕皮甾酮):相对保留时间5.406，相对峰面积0.058 ；
[0168]峰21 (大豆苷元):相对保留时间6.080，相对峰面积0.158。
[0169]这些共有特征峰构成了天川颗粒产品指纹特征，图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，相似度大于0.9 ;可以作为天川颗粒产品标准指纹图谱。
[0170]3、相似度评价
[0171]采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件(2008版)对图谱进行评价，相似度评价结果见表1。
[0172]表1 10批制剂HPLC-UV图谱相似度评价结果
[0173]
【权利要求】
1.一种天川颗粒产品指纹图谱的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步骤: (1)供试品溶液的制备:精密称取天川颗粒I~50g，加水10~500ml，超声20~45min溶解后，冷却后取少量上清液过0.45 μ m微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液； (2)对照品溶液的制备:精密称取天麻素、对羟基苯甲醇、盐酸川芎嗪、对羟基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蜕皮甾酮、大豆苷元适量，分别用纯化水、纯化水、70%甲醇、纯化水、纯化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成浓度分别为lmg/ml的溶液,再吸取对照品溶液各适量，用纯化水稀释成浓度分别为0.05 μ g/ml的对照品溶液； (3)色谱条件:色谱柱为5μmFortis-C18, 250 X 4.6mm:流动相为0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脱方式 Omin → 15min → 17min — 57min → 70min → 90min → 95min,甲醇 5% → 10% →20% → 40% → 60% → 70% → 100% ;流速 0.5 ~1.5ml/min ;柱温 25 ~35°C;检测波长:220nm ;进样量为10~100 μ l ; (4)供试品溶液的测定:精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，得到天川颗粒的HPLC-UV图谱。
2.按照权利要求1所述的天川颗粒指纹图谱的建立方法，其特征是按照本方法对10批供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，记录色谱图，得到10批天川颗粒的HPLC-UV图谱；并进行分析比较，得到由测定所得的指纹图谱中有21个共有峰，其中，以3号峰即天麻素峰为参照物峰，分别为: 峰1:相对保留时间0.4495,相对峰面积0.060% ； 峰2:相对保留时间0.568，相对峰面积0.060 ； 峰3天麻素:相对保留时间1.000，相对峰面积1.000 ； 峰4对羟基苯甲醇:相对保留时间1.602，相对峰面积0.184 ； 峰5盐酸川芎嗪:相对保留时间2.016，相对峰面积0.067 ； 峰6:相对保留时间2.246，相对峰面积0.116 ； 峰7:相对保留时间2.366，相对峰面积0.079 ； 峰8:相对保留时间2.407min，相对峰面积0.379 ； 峰9对羟基苯甲醛:相对保留时间2.626min，相对峰面积0.144 ； 峰10:相对保留时间2.665，相对峰面积0.718 ； 峰11:相对保留时间3.020,相对峰面积0.079 ； 峰12葛根素:相对保留时间3.227，相对峰面积1.839 ； 峰13:相对保留时间3.284±0.21,相对峰面积0.415 ； 峰14:相对保留时间3.373,相对峰面积0.545 ； 峰15:相对保留时间3.475，相对峰面积0.067 ； 峰16大豆苷:相对保留时间3.754，相对峰面积0.355 ； 峰17阿魏酸:相对保留时间3.923，相对峰面积0.074 ； 峰18:相对保留时间4.18,相对峰面积0.119 ； 峰19:相对保留时间4.252,相对峰面积0.254 ； 峰20 β -脱皮甾酮:相对保留时间5.405，相对峰面积0.063 ； 峰21大豆苷元:相对保留时间6.077，相对峰面积0.161 ； 这些共有特征峰构成了天川颗粒指纹特征，图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，相似度大于0.9 ;是天川颗粒标准指纹图谱。
3.一种天川颗粒产品指纹图谱的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步骤: (1)供试品溶液的制备:精S称取天川颗粒lg，加水IOml,超声20min溶解后,冷却后取少量上清液过0.45 μ m微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液； (2)对照品溶液的制备:精密称取天麻素、对羟基苯甲醇、盐酸川芎嗪、对羟基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蜕皮甾酮、大豆苷元适量，分别用纯化水、纯化水、70%甲醇、纯化水、纯化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成浓度分别为lmg/ml的溶液,再吸取对照品溶液各适量，用纯化水稀释成浓度分别为0.05 μ g/ml的对照品溶液； (3)色谱条件:色谱柱为5μπιFortis-C18, 250 X 4.6mm:流动相为0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脱方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 0.5ml/min ;柱温 35°C ;检测波长:220nm ;进样量为20 μ I ； (4)供试品溶液的测定:精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，得到天川颗粒的HPLC-UV图谱。
4.按照权利要求3所述的天川颗粒指纹图谱的建立方法，其特征是按照本方法对10批供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，记录色谱图，得到10批天川颗粒的HPLC-UV图谱；并进行分析比较，得到由测定所得的指纹图谱中有21个共有峰，其中，以3号峰即天麻素峰为参照物峰，分别为: 峰1:相对保留时间0.455,相对峰面积0.064 ； 峰2:相对保留时间0.568，相对峰面积0.068 ； 峰3天麻素:相对保留时间1.000，相对峰面积1.000 ； 峰4对羟基苯甲醇:相对保留时间1.602，相对峰面积0.184 ； 峰5盐酸川芎嗪:相对保留时间2.016，相对峰面积0.057 ； 峰6:相对保留时间2.244,相对峰面积0.089 ； 峰7:相对保留时间2.360，相对峰面积0.062 ； 峰8:相对保留时间2.408,相对峰面积0.412 ； 峰9对羟基苯甲醛:相对保留时间2.627，相对峰面积0.107 ； 峰10:相对保留时间2.666，相对峰面积0.723 ； 峰11:相对保留时间3.022，相对峰面积0.072 ； 峰12葛根素:相对保留时间3.229，相对峰面积1.820 ； 峰13:相对保留时间3.287，相对峰面积0.471 ； 峰14:相对保留时间3.375,相对峰面积0.554 ； 峰15:相对保留时间3.477，相对峰面积0.068 ； 峰16大豆苷:相对保留时间3.756，相对峰面积0.356 ； 峰17阿魏酸:相对保留时间3.926，相对峰面积0.069 ； 峰18:相对保留时间4.188,相对峰面积0.125 ； 峰19:相对保留时间4.255,相对峰面积0.287 ； 峰20 β -蜕皮留酮:相对保留时间5.406，相对峰面积0.058 ； 峰21大豆苷元:相对保留时间6.080，相对峰面积0.158 ；这些共有特征峰构成了天川颗粒产品指纹特征，图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，相似度大于0.9 ;是天川颗粒标准指纹图谱。
5.一种天川颗粒产品指纹图谱的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步骤: (1)供试品溶液的制备:精密称取天川颗粒10g，加水50ml，超声45min溶解后，冷却后取少量上清液过0.45 μ m微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液； (2)对照品溶液的制备:精密称取天麻素、对羟基苯甲醇、盐酸川芎嗪、对羟基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蜕皮甾酮、大豆苷元适量，分别用纯化水、纯化水、70%甲醇、纯化水、纯化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成浓度分别为lmg/ml的溶液,再吸取对照品溶液各适量，用纯化水稀释成浓度分别为0.05 μ g/ml的对照品溶液； (3)色谱条件:色谱柱为5μπιFortis-C18, 250 X 4.6mm:流动相为0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脱方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 1.0ml/min ;柱温 30°C ;检测波长:220nm ;进样量为 10 μ I ； (4)供试品溶液的测定:精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，得到天川颗粒的HPLC-UV图谱。
6.按照权利要求5所述的天川颗粒指纹图谱的建立方法，其特征是按照本方法对10批供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，记录色谱图，得到10批天川颗粒的HPLC-UV图谱；并进行分析比较，得到由测定所得的指纹图谱中有21个共有峰，其中，以3号峰即天麻素峰为参照物峰，分别为: 峰1:相对保留时间0.450,相对峰面积0.060 ； 峰2:相对保留时间0.568,相对峰面积0.060 ； 峰3天麻素:相对保留时间1.000，相对峰面积1.000 ； 峰4对羟基苯甲醇:相对保留时间1.602，相对峰面积0.184 ； 峰5盐酸川芎嗪:相对保留时间2.016，相对峰面积0.067 ； 峰6:相对保留时间2.246,相对峰面积0.116 ； 峰7:相对保留时间2.366，相对峰面积0.079 ； 峰8:相对保留时间2.407，相对峰面积0.379 ； 峰9对羟基苯甲醛:相对保留时间2.626，相对峰面积0.144 ； 峰10:相对保留时间2.665，相对峰面积0.718 ； 峰11:相对保留时间3.020,相对峰面积0.079 ； 峰12葛根素:相对保留时间3.227，相对峰面积1.839 ； 峰13:相对保留时间3.284,相对峰面积0.415 ； 峰14:相对保留时间3.373,相对峰面积0.545 ； 峰15:相对保留时间3.475，相对峰面积0.067 ； 峰16大豆苷:相对保留时间3.754，相对峰面积0.355 ； 峰17阿魏酸:相对保留时间3.923，相对峰面积0.074 ； 峰18:相对保留时间4.185,相对峰面积0.119 ； 峰19:相对保留时间4.252,相对峰面积0.254 ； 峰20 β -脱皮甾酮:相对保留时间5.405，相对峰面积0.063 ；峰21大豆苷元:相对保留时间6.077，相对峰面积0.161 ； 这些共有特征峰构成了天川颗粒产品指纹特征，图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，相似度大于0.9 ;是天川颗粒标准指纹图谱。
7.一种天川颗粒产品指纹图谱的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步骤: (1)供试品溶液的制备:精密称取天川颗粒50g，加水500ml，超声30min溶解后，冷却后取少量上清液过0.45 μ m微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液； (2)对照品溶液的制备:精密称取天麻素、对羟基苯甲醇、盐酸川芎嗪、对羟基苯甲醛、葛根素、大豆苷、阿魏酸、蜕皮甾酮、大豆苷元适量，分别用纯化水、纯化水、70%甲醇、纯化水、纯化水、甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇溶解成浓度分别为lmg/ml的溶液,再吸取对照品溶液各适量，用纯化水稀释成浓度分别为0.05 μ g/ml的对照品溶液； (3)色谱条件:色谱柱为5μπιFortis-C18, 250 X 4.6mm:流动相为0.085%磷酸水溶液-甲醇；米用梯度洗脱方式 Omin — 15min — 17min — 57min — 70min — 90min — 95min,甲醇 5% — 10% — 20% — 40% — 60% — 70% — 100% ;流速 1.5ml/min ;柱温 25°C ;检测波长:220nm ;进样量为100 μ I ； (4)供试品溶液的测定:精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，得到天川颗粒的HPLC-UV图谱。
8.按照权利要求7所述的天川颗粒指纹图谱的建立方法，其特征是按照本方法对10批供试品溶液和对照品溶 液，注入液相色谱仪，以高效液相色谱法测定，记录色谱图，得到10批天川颗粒的HPLC-UV图谱；并进行分析比较，得到由测定所得的指纹图谱中有21个共有峰，其中，以3号峰即天麻素峰为参照物峰，分别为: 峰1:相对保留时间0.456,相对峰面积0.038 ； 峰2:相对保留时间0.568,相对峰面积0.054 ； 峰3天麻素:相对保留时间1.000，相对峰面积1.000 ； 峰4对羟基苯甲醇:相对保留时间1.602，相对峰面积0.182 ； 峰5盐酸川芎嗪:相对保留时间2.015，相对峰面积0.074 ； 峰6:相对保留时间2.247，相对峰面积0.134 ； 峰7:相对保留时间2.365，相对峰面积0.085 ； 峰8:相对保留时间2.406,相对峰面积0.356 ； 峰9对羟基苯甲醛:相对保留时间2.624，相对峰面积0.169 ； 峰10:相对保留时间2.664,相对峰面积0.715 ； 峰11:相对保留时间3.018,相对峰面积0.083 ； 峰12葛根素:相对保留时间3.225，相对峰面积1.852 ； 峰13:相对保留时间3.282，相对峰面积0.377 ； 峰14:相对保留时间3.371,相对峰面积0.540 ； 峰15:相对保留时间3.473,相对峰面积0.066 ； 峰16大豆苷:相对保留时间3.751，相对峰面积0.355 ； 峰17阿魏酸:相对保留时间3.920，相对峰面积0.078 ； 峰18:相对保留时间4.182,相对峰面积0.115 ； 峰19:相对保留时间4.249,相对峰面积0.231 ；峰20 β -脱皮甾酮:相对保留时间5.403，相对峰面积0.067 ； 峰21大豆苷元:相对保留时间6.075，相对峰面积0.164 ； 这些共有特征峰构成了天川颗粒产品指纹特征，图谱经《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件计算，相似度 大于0.9 ;是天川颗粒标准指纹图谱。
【文档编号】G01N30/02GK103760272SQ201410040109
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月27日 优先权日:2014年1月27日
【发明者】郑家晴, 李洁, 王艳敏, 于黎鑫, 于宗贵, 朱宝萌 申请人:山东齐都药业有限公司