一种检测人巨细胞病毒pp65抗原的elisa方法

一种检测人巨细胞病毒pp65抗原的elisa方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测人巨细胞病毒（HCMV）PP65抗原的ELISA方法，它是一种检测HCMV活动性感染指标的临床检测方法。本发明主要是解决现有HCMV活动性感染检测方法存在的敏感性或特异性低、费时费力、操作繁琐和使用不便的问题。本发明采用的技术方案是：一种检测人巨细胞病毒PP65抗原的ELISA方法，其包括下列步骤：1）制备检测试剂盒：所述检测试剂盒包括：包被有大鼠抗重组PP65322-561多克隆抗体（pAb）的酶标板、兔抗重组PP65322-561pAb、标准品、HRP-羊抗兔IgG、PBST洗涤液、底物显色液、终止液和封板膜；2）制备待测标本；3）检测人巨细胞病毒PP65抗原。本发明具有较好的特异性、敏感性、稳定性和可重复性，易于规模化和标准化操作等优点。
【专利说明】—种检测人巨细胞病毒PP65抗原的ELISA方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测人巨细胞病毒(HCMV)PP65抗原的ELISA方法，它是一种检测HCMV活动性感染指标的临床检测方法。
【背景技术】
[0002]人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)属疱疫病毒科0属双链DNA病毒。HCMV可通过口腔、生殖道、胎盘、授乳以及输血或器官移植等多途径传播。人群感染HCMV的显著特点是感染率高，正常成人HCMV抗体阳性率为76.7% - 95.8%，我国也是HCMV感染高度流行国家之一。然而正常人初次感染此病毒多无明显症状，病毒也不能彻底清除，而是潜伏体内。当机体免疫功能低下时，潜伏病毒开始复制并大量增殖，继发活动性感染并表现多种临床症状。临床活动性HCMV感染多见于孕妇，新生儿、输血患者、恶性肿瘤和艾滋病患者以及器官移植等使用免疫抑制剂的患者。孕妇活动性感染可通过胎盘、产道或授乳传给胎儿，导致流产，死胎，胎儿形态畸形，器官功能障碍。先天感染的新生儿出生时可伴有黄疸、瘀斑、脉络膜视网膜炎、小头畸形等，而无症状的部分新生儿，随着发育才逐渐被发现听觉、视力低下，智力发育迟缓，运动障碍等。在恶性肿瘤、艾滋病、器官移植等免疫功能减弱或受抑制的患者HCMV的活动性感染常并发间质性肺炎、视网膜炎、食管炎、结肠炎和脑膜脑炎等多器官脏器损害的各种临床综合征，是患者致死或移植术失败的重要原因。因此，早期快速检测HCMV活动性感染以便及时抗病毒药物治疗或及时终止妊娠是降低HCMV危害的重要措施之一。
[0003]目前，临床检测HCMV活动性感染常用的检测方法是--①ELISA检测HCMV特异抗体IgM的方法:优点是简便、快速、廉价、易于标准化和规模化操作。但因IgM产生早而消失快、仅感染早期可检测到，所以IgM检测HCMV活动性感染敏感性低，而且由于免疫功能低下者不能充分产生IgM，所以特异性也不够理想。②FQ-PCR检测HCMV核酸的方法:通过定量HCMV DNA判断是否为活动性感染，目前已代替因敏感性过高而被淘汰的普通PCR，尽管如此，由于定量标准不统一，需要配套的特殊设备，敏感性高而特异性较低等因素，FQ-PCR也不是最完美的检测方法。③荧光免疫组化或酶免疫组化检测HCMV PP65抗原的方法:PP65在不同HCMV病毒株中高度保守。HCMV —旦复制出被膜磷蛋白PP65就说明病毒完成复制、产生大量子代病毒并将导致临床疾病的发作，即HCMV的活动性感染。PP65在被膜蛋白中占95%以上，在受感染者外周白细胞中检出率极高，所以PP65是检测HCMV活动性感染既敏感又特异的指标。但是PP65抗原主要存在于白细胞核内，检测PP65抗原需要将白细胞固定在玻片上进行荧光免疫组化或酶免疫组化，显微镜下观察计数PP65抗原阳性细胞，不仅需要配备荧光显微镜或者 配套输出设备和有经验的镜检人员，而且操作繁琐，每个样本需要一个玻片固定检测，难以规模化检测。为此，国内个别医院已将荧光免疫组化法改进为流式细胞术检测，但是仍然离不开流式细胞仪和有经验流式细胞术操作分析人员，难以普及到基层医院，也难以规模化批量检测。
【发明内容】

[0004]本发明的目的是解决现有HCMV活动性感染检测方法存在的敏感性或特异性低、费时费力、操作繁琐和使用不便的问题，提供一种简便、快速、准确、费用低廉、易于普及和标准化的检测人巨细胞病毒PP65抗原的ELISA方法。
[0005]为解决上述问题，本发明采用的技术方案是:
[0006]一种检测人巨细胞病毒PP65抗原的ELISA方法，其包括下列步骤:
[0007]I)制备检测试剂盒
[0008]所述检测试剂盒包括:包被有大鼠抗重组PP6 5 322_561多克隆抗体(pAb)的酶标板、兔抗重组PP6 5 322_561pAb、标准品、HRP-羊抗兔IgG、PBST洗涤液、底物显色液、终止液和封板膜；
[0009]①所述大鼠抗重组PP65pAb的酶标板的制备:
[0010]a)大鼠抗重组PP65pAb的制备:
[0011]免疫前大鼠断尾采血，分离血清，作为免疫血清效价检测的阴性对照；取70-170 u g重组PP65抗原与等体积弗氏完全佐剂混合，振荡混匀制成乳化剂，皮下及皮内多位点免疫大鼠；免疫后14-21天，取70-130 Ug重组PP65抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合，振荡混匀制成乳化剂，第二次皮下及皮内多位点免疫大鼠；第二次免疫后21-30天，与第二次方法一样再次加强免疫；第三次免疫后第10天，采血分离血清，ELISA检测抗体效价,证明免疫成功后,心脏采血获取免疫血清,饱和硫酸铵沉淀法纯化免疫血清,得到所需大鼠抗重组PP65的pAb ；
[0012]b)包被酶标板:
[0013]包被液稀释大鼠抗重组PP65pAb为1: 2000，每孔50 y I加入酶标板中，4°C包被过夜；弃去孔内的包被液，PBST洗2次，拍干，加封闭液每孔100 yl，置37°C封闭2h，PBST洗3次，拍干；
[0014]②所述兔抗重组PP65pAb的制备:
[0015]免疫前兔耳缘静脉采血，分离血清，作为免疫血清效价检测的阴性对照；取100-300 u g重组PP65抗原与等体积弗氏完全佐剂混合，振荡混匀制成乳化剂，皮下及皮内多位点免疫兔子；免疫后14-28天，取90-170 Ug重组PP65抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合，振荡混匀制成乳化剂，第二次皮下及皮内多位点免疫兔子；第二次免疫后28-42天，与第二次方法一样再次加强免疫；第三次免疫后第10-20天，采血分离血清，ELISA检测抗体效价，证明免疫成功后,心脏采血获取免疫血清,饱和硫酸铵沉淀法纯化免疫血清,得到所需兔抗重组HCMVPP65的pAb ；
[0016]③所述标准品为封闭液对倍稀释重组PP65抗原从640ng/ml至10ng/ml共7个标准浓度梯度，即 640ng/ml、320ng/ml、160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml 和 10ng/ml ；
[0017]2)制备待测标本
[0018]取待测新鲜抗凝血2_3ml，溶解破坏红细胞，150-250 U I生理盐水悬浮白细胞，或调白细胞浓度为io5/mi左右，冰浴环境下超声裂解白细胞释放核内抗原，或反复冻融裂解法释放核内抗原，离心取上清即为制备的待测标本；
[0019]3)检测人巨细胞病毒PP65抗原
[0020]a)将标准品各浓度PP65抗原和待测标本每孔50 U I加入酶标板中，37°C孵育lh，PBST洗涤5次，拍干；
[0021]10加兔抗重组？?65?413，每孔50111，371:孵育lh，PBST洗涤5次，拍干；
[0022]c)加HRP-羊抗兔IgG，每孔50 U 1，37°C孵育lh, PBST洗涤5次，拍干；
[0023]d)加底物显色液，每孔100 U 1，室温避光显色15min ；
[0024]e)加终止液，每孔50 U 1，酶标仪检测并记录0D450值，根据标准曲线，计算待测样本的PP65抗原含量。
[0025]所述大鼠抗重组PP65pAb和兔抗重组PP65pAb还能用针对重组PP65322_561抗原的任意两种多克隆抗体搭配或者与单克隆抗体搭配。
[0026]所述HRP-羊抗兔IgG还可以是碱性磷酸酶或生物素标记的羊抗兔IgG。
[0027]多克隆抗体(pAb)包含针对多种抗原表位的抗体成份，检测抗原的敏感性较单克隆抗体高，但容易发生非特异交叉反应，本发明采用多次反复免疫动物以获取高效价PAb(1:400000的兔pAb和1:20000的大鼠pAb)，并用免疫动物可能接触到的环境微生物(大肠杆菌、变形杆菌、葡萄球菌、链球菌)抗原与所得PAb反应，克服了其容易出现交叉反应的缺点。通过比较兔和大鼠PAb包被酶标板的检出特异性，选择了大鼠pAb为包被抗体，兔pAb为检测一抗。通过对单纯疱疹病毒I型和II型感染患者的白细胞抗原的检测，排除了本发明非特异结合单纯疱疹病毒抗原的可能，更肯定了试剂的特异性。
[0028]将101份临床疑似HCMV感染患者的血清分别用FQ-PCR试剂(中山医科大学达安基因中心)和IgM试剂(意大利DIA.PRO公司)检测，同时用本发明检测患者外周白细胞PP65抗原。三种检测方法检出的阳性例数分别是26例、18例和25例。检测结果的比较分别见表1和表2。
[0029]表1FQ-PCR检测HCMV-DNA与本发明检测HCMV-PP65抗原检测结果比较
【权利要求】
1.一种检测人巨细胞病毒PP65抗原的ELISA方法，其特征是:包括下列步骤: 1)制备检测试剂盒 所述检测试剂盒包括:包被有大鼠抗重组PP6 5 322_561多克隆抗体(pAb)的酶标板、兔抗重组PP6 5 322_561pAb、标准品、HRP-羊抗兔IgG、PBST洗涤液、底物显色液、终止液和封板膜； ①所述大鼠抗重组PP65pAb的酶标板的制备: a)大鼠抗重组PP65pAb的制备: 免疫前大鼠断尾采血，分离血清，作为免疫血清效价检测的阴性对照；取70-170 y g重组PP65抗原与等体积弗氏完全佐剂混合，振荡混匀制成乳化剂，皮下及皮内多位点免疫大鼠；免疫后14-21天，取70-130 ii g重组PP65抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合，振荡混匀制成乳化剂，第二次皮下及皮内多位点免疫大鼠；第二次免疫后21-30天，与第二次方法一样再次加强免疫；第三次免疫后第10天，采血分离血清，ELISA检测抗体效价，证明免疫成功后，心脏采血获取免疫血清，饱和硫酸铵沉淀法纯化免疫血清，得到所需大鼠抗重组PP65的 pAb ； b)包被酶标板: 包被液稀释大鼠抗重组PP65pAb为1: 2000，每孔50 ill加入酶标板中，4°C包被过夜；弃去孔内的包被液，PBST洗2次，拍干，加封闭液每孔100 yl，置37°C封闭2h，PBST洗3次，拍干; ②所述兔抗重组PP65pAb的制备: 免疫前兔耳缘静脉采血，分离血清，作为免疫血清效价检测的阴性对照；取100-300 ii g重组PP65抗原与等体积弗氏完全佐剂混合，振荡混匀制成乳化剂，皮下及皮内多位点免疫兔子；免疫后14-28天，取90-170 Ug重组PP65抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合，振荡混匀制成乳化剂，第二次皮下及皮内多位点免疫兔子；第二次免疫后28-42天，与第二次方法一样再次加强免疫；第三次免疫后第10-20天，采血分离血清，ELISA检测抗体效价，证明免疫成功后,心脏采血获取免疫血清,饱和硫酸铵沉淀法纯化免疫血清,得到所需兔抗重组HCMVPP65的pAb ； ③所述标准品为封闭液对倍稀释重组PP65抗原从640ng/ml至10ng/ml共7个标准浓度梯度，即 640ng/ml、320ng/ml、160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml 和 10ng/ml ； 2)制备待测标本 取待测新鲜抗凝血2-3ml，溶解破坏红细胞，150-250 U I生理盐水悬浮白细胞，或调白细胞浓度为105/ml左右，冰浴环境下超声裂解白细胞释放核内抗原，或反复冻融裂解法释放核内抗原，离心取上清即为制备的待测标本； 3)检测人巨细胞病毒PP65抗原 a)将标准品各浓度PP65抗原和待测标本每孔50u I加入酶标板中，37°C孵育lh，PBST洗涤5次，拍干； b)加兔抗重组PP65pAb，每孔50iU，37°C孵育lh,PBST洗涤5次，拍干； c)加HRP-羊抗兔IgG，每孔50u 1，37°C孵育lh，PBST洗涤5次，拍干； d)加底物显色液，每孔100Ul，室温避光显色15min ； e)加终止液，每孔50u 1，酶标仪检测并记录0D450值，根据标准曲线，计算待测样本的PP65抗原含量。
2.根据权利要求1所述的检测人巨细胞病毒PP65抗原的ELISA方法，其特征是:所述大鼠抗重组PP65pAb和兔抗重组PP65pAb还能用针对重组PP6 5 322_561抗原的任意两种多克隆抗体搭配或者与单克隆抗体搭配。
3.根据权利 要求1所述的检测人巨细胞病毒PP65抗原的ELISA方法，其特征是:所述HRP-羊抗兔IgG还可以是碱性磷酸酶或生物素标记的羊抗兔IgG。
【文档编号】G01N33/535GK103760347SQ201410040889
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月28日 优先权日:2014年1月28日
【发明者】樊卫平, 孔令文, 罗旭光, 刘玲玲, 王亮 申请人:山西医科大学