同型半胱氨酸（Hcy）测定方法及测定试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种同型半胱氨酸浓度的测定方法，原理是氧化型Hcy被转化成游离Hcy，游离Hcy在CBS催化下和丝氨酸反应生成L-胱硫醚。L-胱硫醚在CBL催化下又生成Hcy、丙酮酸和NH3。该循环反应生成的丙酮酸可以用乳酸脱氢酶LDH和NADH检测到，NADH转变成NAD的速率与样品中Hcy含量成正比。在340nm处测定NADH+降低速率可以测得同型半胱氨酸的含量。本发明还提供一种高灵敏度同型半胱氨酸浓度的测定试剂盒。
【专利说明】同型半胱氨酸(Hcy )测定方法及测定试剂盒
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及医学检验测定【技术领域】，具体涉及一种同型半胱氨酸测定方法及测定试剂盒。
[0003]
【背景技术】
[0004]目前，测定血浆中同型半胱氨酸浓度的方法有很多，包括循环酶法、FPIA法、高效液相色谱法(HPLC )、酶联免疫分析法(EIA )等。
[0005]1.循环酶法。测定血清Hcy可用于全自动生化分析仪，其反应原理在膦氯化氢(TCEP)作用下氧化型Hcy转化为游离型Hcy与共价底物S-腺苷甲硫氨酸SAM催化反应形成甲硫氨酸与S-腺苷同型半胱氨酸SAH。SAH被SAH水解酶水解成腺苷和Hcy，形成的Hcy可以循环加入反应，从而放大了检测信号，腺苷立即水解为次黄嘌呤和氨，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下使NADH转化为NAD+，样本中的Hey浓度与NADH的变化成正比。测定主要影响因素为血氨，当血氨浓度<50umol / L时，Hey测定值与原始值的偏差〈10% ;当血氨>70umol / L时，测定值与原始值的偏差>10%。
[0006]2.FPIA法。测定原理是先用二硫苏糖醇将标本中结合态的Hcy还原成游离形式后，同时加入腺苷，在S-腺苷-L-同型半胱氨酸水解酶的作用下将Hcy转化为S-腺苷-L-同型半胱氨酸(SAH)，然后加入抗SAH单克隆抗体和荧光标记的SAH抗原，SAH与荧光标记抗原竞争结合抗SAH抗体，形成大分子的免疫复合物，最后测定其荧光偏振度。此方法要求血标本及时送至实验室，避免血细胞内Hcy的释放对测定结果的干扰。FPIA法测定Hcy具有较好的精密度，其批内CV为1.16%，批间CV为3.12%，均小于4%，与国外文献报道相近。说明方法可靠，血清与血浆结果之间具有良好的相关性。现有多种方法测定Hcy, FPIA法较适合实验室常规应用。
[0007]3、高效液相色谱法(HPLC ):是经典的参考方法，但其操作比较复杂，试验耗时比较长，试验数据变异比较大，在临床应用方面逐渐被酶联免疫分析法、荧光偏振分析法和酶法所取代。高效液相色谱法:先使用还原剂使血样中所有形式的同型半胱氨酸转变成还原形式，然后与荧光剂进行衍生生成同型半胧氨酸一荧光物质复合物，将衍生后的样品进行色谱分析。因色谱固定相对不同物质的吸附力不同，因此流动相将其洗脱下来的次序也不同，根据这一原理将样品中的不同物质分开，以荧光检测器检测洗脱下同型半胱氨酸一荧光物质复合物的荧光强度，将其与标准品/内标的比值进行比较和计算，就可以测定血总同型半胱氨酸的水平。 [0008]4、酶联免疫分析法(EIA ):是临床上测定同型半胧氨酸水平的常用方法，操作比较方便、快捷，重复性好，方法稳定可靠。其缺点是大部分操作还是手工操作，比较耗时。
[0009]CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶来测量样品中同型半胱氨酸含量； CNZ004 10016789.6利用同型半胱氨酸转甲基酶及腺昔同型半胱氨酸酶的循环扩增作用，再加上腺昔脱氨酶、嘿吟核营磷酸化酶、黄嘿吟氧化酶、过氧化物酶等，或腺营脱氨酶、谷氨酸脱氢酶等显色反应测定同型半胱氨酸含量；
CNZ00510053210.8利用L-蛋氨酸Y-裂解酶作用于同型半胱氨酸使之产生硫化氢后再与莹光化合物DMPDZHCI作用产生荧光，该方法使用全自动荧光分析仪测试，具有快速、准确、方便的优点。其基本分析原理:用基因重组酶将同型半胱氨酸分解，所形成之硫化氢产物再与荧光显色剂发生化学反应形成可测量的荧光化合物。
[0010]
【发明内容】
[0011]本发明的目的是:提供一种测定同型半胱氨酸浓度的方法，以及应用该方法配制而成的同型半胱氨酸测定试剂盒。具体技术方案如下:
一种同型半胱氨酸浓度的测定方法，包括以下步骤:
将待测样品与含有丝氨酸、胱硫醚β-合酶、胱硫醚β-裂解酶、乳酸脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，
丝氨睡+同型半胱氨-胱硫醚+Η:01-胱硫醚-同型半胱黃:酸-丙酮酸—NHi
丙酮酸+乳酸+ NAD';
检测主波长340nm的吸光度的下降速度，测算出同型半胱氨酸浓度大小。
[0012]检测仪器包括Hitachi7080,Olympus AU400, Beckman LX20, Abbott Aeroset ；Toshiba 120FR, Mindray BS-200, Dimension AR 自动生化分析仪等。
[0013]一种同型半胱氨酸测定试剂盒，它由下述试剂组成:
试剂1:
乳酸脱氢酶(LD)35KU/L ；
丝氨酸(SER)0.71-0.76 mmol/L ；
NADH0.42-0.47 mmol/1 ；
试剂2:
胱硫醚β -合成酶(CBS)18-20KU/L ；
胱硫醚β -分解酶(CBL)8-10KU/L ；
优选地，所述试剂盒由下述试剂组成:
试剂1:
乳酸脱氢酶(LD)35KU/L ；
丝氨酸(SER)0.73 mmol/L;
NADH0.45 mmol/1 ；
试剂2:
胱硫醚β -合成酶(CBS)18KU/L ；
胱硫醚β -分解酶(CBL)8KU/L ； 优选地，所述试剂盒由下述试剂组成:
试剂1:
乳酸脱氢酶(LD)35KU/L ；
丝氛酸(SER)0.76 mmol/L;
NADH0.47 mmol/1 ；
试剂2:
胱硫醚β -合成酶(CBS )20KU/L ；
胱硫醚β -分解酶(CBL)10KU/L ；
所述试剂盒还可以包括如下缓冲液=Tris-HCL缓冲液，或三乙醇胺缓冲液，或二乙醇胺缓冲液，或2-氨基-2甲基-1-丙醇AMP缓冲液，或甲基葡糖胺ALP缓冲液。
[0014]所述缓冲液优选为由12mmol/L pH8.3 Tris-HCL和KCL60mmol/L组成的缓冲液。
[0015]所述试剂盒还可以包括如下稳定剂:硫酸铵、甘油、甘露醇、维生素C、丙二醇、叠氮钠、乙二醇中的至少一种。
[0016]所述稳定剂优选为甘油和甘露醇的混合物，其中甘油:甘露醇=15:1。
[0017]所述还原型辅酶NADH 还可以是 NADPH、thio-NADH 或 thio_NADPH+。
[0018]所述的同型半胱氨酸测定试剂盒，所述试剂可以配成单剂、双剂或者三剂。
[0019]单剂:
乳酸脱氢酶(LD)30.33KU/L ；
丝氛酸(SER)0.66 mmol/L;
NADH0.41 mmol/1 ；
胱硫醚β -合成酶(CBS)2.67KU/L ；
胱硫醚β -分解酶(CBL)1.33KU/L。
[0020]
双剂:
试剂1:
乳酸脱氢酶(LD)35KU/L ；
丝氛酸(SER)0.76 mmol/L;
NADH0.47 mmol/1 ；
试剂2:
胱硫醚β -合成酶(CBS )20KU/L ；
胱硫醚β -分解酶(CBL)10KU/L。
[0021] 三剂
试剂 1:NADH0.47 mmol/1 ；
试剂2:
乳酸脱氢酶(LD)35KU/L ；
丝氛酸(SER)0.76 mmol/L;
试剂3:
胱硫醚β -合成酶(CBS )20KU/L ；
胱硫醚β -分解酶(CBL)10KU/L。[0022]所述的同型半胱氨酸测定试剂盒，可以是液体试剂盒。
[0023]本方法及试剂盒具有测定速度快、灵敏、准确度高、稳定性好的优点:
分析灵敏度:最低检出限≤0.Ιμηιο? /L;
分析特异性:回收率在90%_110%内；
线性范围:1.0-100.0 μ mo I /L, r ^ 0.9900;
准确性:相对偏差≤±4.0%;
批内精密度:CV≤4.0%;
批间精密度:CV≤5.0%;
因而可以得到切实的推广应用。该方法在普通紫外-可见光分析仪或者半自动、全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用。而且稳定性好，经_20°C、室温、37°C稳定性考察证明，本发明试剂盒稳定，样品检测专一性强，灵敏度高，储存时间长。
[0024]加入本发明所述稳定剂和缓冲液可以有效提高试剂盒稳定性。至少可以保持12小时内Hcy含量稳定，24小时内Hcy浓度增加尚不足4%。缓冲液选12mmol/L pH8.3Tris-HCL和KCL60mmol/L组成的缓冲液，稳定剂选甘油:甘露醇=15:1时，稳定性最好，可以保持15小时内Hcy含量稳定，30小时内Hcy浓度增加不超过5%。
[0025]
【具体实施方式】
[0026]现通过以下实施例来进一步描述本发明的有益效果，实施例仅用于例证的目的，不限制本发明的范围，同时本领域普通技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。
[0027]实施例1 (双剂)
按以下成分和用量配制同型半胱氨酸测定试剂盒:
试剂1:
乳酸脱氢酶(LD)35KU/L ；
丝氛酸(SER)0.76 mmol/L;
NADH0.47 mmol/1 ；
试剂2:
胱硫醚β -合成酶(CBS )20KU/L ；
胱硫醚β -分解酶(CBL)10KU/L。
[0028]所述试剂1、2还可以包括由12mmol/L pH8.3 Tris-HCL和KCL60mmol/L组成的缓冲液；甘油和甘露醇的混合物，其中甘油:甘露醇=15:1。所述缓冲液和稳定剂可以显著提高试剂盒的稳定性。
[0029]检测方法:
1.基本参数
方法:速率法样本/试剂:1/17
主波长:340nm反应温度:37°C
副波长:405nm反应时间:IOmin2、测定
空白样本校准
生理盐水/Η20(μ1) 16OO
样本(μL)O16O
校准品(μ I)OO16
试剂 Rl ( μ I)234234234
混匀，37 °C孵育1-5分钟
试剂 R2 ( μ I)363636
混匀，37°C孵育90秒后，连续监测1-3 min，计算ΛΑ/min
3、结果计算
【权利要求】
1.同型半胱氨酸浓度的测定方法，包括以下步骤: 将待测样品与含有丝氨酸、胱硫醚β-合酶、胱硫醚β-裂解酶、乳酸脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，
2.—种同型半胱氨酸测定试剂盒，其特征在于它由下述试剂组成:
3.一种同型半胱氨酸测定试剂盒，其特征在于它由下述试剂组成:
4.一种同型半胱氨酸测定试剂盒，其特征在于它由下述试剂组成:
5.根据权利要求2所述的同型半胱氨酸测定试剂盒，其特征在于:还可以包括如下缓冲液:Tris_HCL缓冲液,或二乙醇胺缓冲液,或二乙醇胺缓冲液,或2-氨基-2甲基-1-丙醇AMP缓冲液，或甲基葡糖胺ALP缓冲液。
6.根据权利要求3所述的同型半胱氨酸测定试剂盒，其特征在于:所述缓冲液为由12mmol/L pH8.3 Tris-HCL 和 KCL60mmol/L 组成的缓冲液。
7.根据权利要求2所述的同型半胱氨酸测定试剂盒，其特征在于:还可以包括如下稳定剂:硫酸铵、甘油、甘露醇、维生素C、丙二醇、叠氮钠和乙二醇中的至少一种。
8.根据权利要求5所述的同型半胱氨酸测定试剂盒，其特征在于:所述稳定剂为甘油和甘露醇的混合物，其中甘油:甘露醇=15:1。
9.权利要求2-4中任意一项所述同型半胱氨酸测定试剂盒，其特征在于:所述试剂配成单剂、双剂或者三剂。
10.权利要求2-4中任意一项所述同型半胱氨酸测定试剂盒，其特征在于:所述试剂盒为液体试剂盒。
【文档编号】G01N31/22GK103926248SQ201410190202
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年5月7日 优先权日:2014年5月7日
【发明者】邢力策, 陈青松, 林耀文 申请人:浙江夸克生物科技有限公司