一种基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的方法，属于分析化学【技术领域】。通过金硫键将巯基DNA连接到金纳米颗粒上，且这巯基DNA可与荧光染料修饰的腺苷核酸适配体杂交。在高盐溶液中由于荧光淬灭，检测体系无荧光或荧光强度很低且稳定存在的金纳米颗粒使溶液颜色为酒红色。腺苷的加入会导致核酸适配体结构的变化，使荧光染料修饰的腺苷适配体从金纳米颗粒上解离下来，荧光染料的荧光恢复。而此时的金纳米颗粒不能稳定存在，溶液颜色则由红色变蓝色。该方法通过检测体系的荧光强度和溶液颜色的变化，实现了对腺苷的定性和定量检测，具有灵敏度高，选择性好等优点。
【专利说明】一种基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学【技术领域】，涉及是一种构建基于荧光和比色双重检测体系测 定腺苷的生物传感器的构建。
【背景技术】
[0002] 核酸适配体（aptamer)是指从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲 和、高特异性地和靶标分子结合的单链寡核苷酸。它可以通过SELEX技术获得，其总的思路 是从通过组成化学原理设计合成的随机寡核苷酸（1〇 15_1〇18种核酸分子）中经多轮筛选和 指数富集最终获得目标核酸适配体。
[0003] 核酸本身特有的生化特性使核酸适配体在生物传感应用领域具有以下诸多优势： 1.靶分子范围广。小到ATP、氨基酸、金属离子等小分子物质，大到酶、生长因子等生物大分 子，甚至完整的病毒、细菌等都可以作为适配体筛选的靶物质。2.亲和力强。核酸适配体和 靶分子的结合强度高。3.特异性高。核酸适配体不仅能识别靶物质一个甲基或羟基等的细 微变化，还能够区分旋光异构体。4.制备、修饰方便快速。通过化学合成的方法可以在体外 快速灵活地合成所需要的各种核酸适配体序列，而且可以进行精确的位点修饰，如荧光标 记、生物素的标记。5.核酸适配体可通过生物分子进行剪裁，提高其亲和力。6.稳定性好， 便于长期保存和运输。核酸适配体的这些优势使其成为生物传感器的理想识别分子。
[0004] 腺苷被称为6-氨基-9- β -D-呋喃核糖基-9-H-嘌呤，是一种内源性核苷，在调控 机体各组织的生理活性和有机功能中发挥了重要的作用。比如它在调节平滑肌的收缩，神 经传递，血液流动，肾素释放等方面发挥了重要作用。目前检测腺苷的方法包括层析法，毛 细管电泳，高效液相色谱法等。这些方法一般需要对样品进行预处理，其中最常用的分离方 法是液液萃取，需要将样品与有机溶剂混合一定的时间，再对其进行萃取等后续处理。而这 种分离方法往往需要大量的样品和有毒试剂且耗时耗力，检测腺苷的灵敏度和检测限均比 较低，这些缺点在一定程度上限制了上述几种方法的应用。因此有必要发展一种克服以上 缺点还对腺苷有好选择性和灵敏度的检测体系。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种 基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的生物传感器。将荧光核酸适配体荧光素作为识别 分子，AuNPs作为荧光淬灭分子，提高了传感器的灵敏度和选择性，与传统的腺苷检测方法 相比，有更灵敏的检测效果，减小了最低检测浓度和检出限。
[0006] 一种基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的方法，其特征在于：
[0007] 1)、直径为5_40nm的金纳米颗粒（AuNPs)的合成；
[0008] 2)、将巯基单链DNA (ssDNA)修饰到AuNPs表面上构成ssDNA-AuNPs体系；
[0009] 3)、将：T修饰有荧光素的腺苷核酸适配体杂交到上述ssDNA-AuNPs构成 dsDNA-AuNPs 体系；
[0010] 4)、调节dsDNA-AuNPs体系的盐浓度并对其进行荧光检测及观察溶液颜色；
[0011] 5)、在dsDNA-AuNPs盐溶液体系中加入目标物腺苷，对其进行荧光检测及观察溶 液颜色变化。腺苷核酸适配体在腺苷的存在下，会伴随结构变化，从自由态转变成G-四聚 体。
[0012] 其中突光素作为突光信号分子，腺苷核酸适配体作为识别分子，AuNPs作为突光淬 灭分子，利用加入腺苷前后溶液荧光信号和颜色的差异，实现对目标物定性定量检测。
[0013] 步骤1)合成AuNPs的还原剂是柠檬酸钠，单宁酸，硼氢化钠，抗坏血酸或盐酸羟胺 等。
[0014] 步骤 3)涉及的荧光素有 FAM，Cy3, Cy5, ROX，TexasRed。
[0015] 腺苷核酸适配体序列为
[0016] 5 ' -TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCAGACTG-荧光素-3，，
[0017] 5 ' -TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCAGTCAG-荧光素-3，，
[0018] 5 ' -TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCAGTGGC-荧光素-3，，
[0019] 5 ' -TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCACGCAG-荧光素-3，。
[0020] 巯基 ssDNA 序列为 5' -SH-C6-CAGTCTGGACCC-3'，
[0021] 5，-SH-C6-CTGACTGGACCC-3，，5，-SH-C6-GCCACTGGACCC-3，，
[0022] 5' -SH-C6-CTGCGTGGACCC-3，。
[0023] 巯基ssDNA是通过金硫键作用连在AuNPs表面上的。
[0024] 步骤3) dsDNA-AuNPs是由所述的腺苷核酸适配体和巯基DNA在85-95°C，5-10min 的退火条件下杂交组成。
[0025] 步骤 4)调节盐浓度采用 NaCl，KC1，MgCl2, BaCl2 或 CaCl2。
[0026] 步骤5)加入腺苷的浓度范围在0_120uM。
[0027] 本发明与现有技术相比，具有如下显著优点：
[0028] 1)、利用金纳米颗粒极好的淬灭效应，显著地降低了体系的背景荧光，提高了检测 的灵敏度，减小了最低检测浓度和检出限。
[0029] 2)、引入核酸适配体，不仅能检测DNA、RNA等核酸类物质，还可以检测蛋白质、多 肽、金属离子、药物、病毒、细胞等，扩大了检测范围。
[0030] 3)、核酸荧光分子探针与目标物特异性高，有很好的选择性，是检测结果更加准 确。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1是本发明基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的生物传感器的示意图。
[0032] 图2是本发明合成13nm金纳米颗粒的透射电镜（TEM)照片。
[0033] 图3是本发明实施例1所构建的检测腺苷体系，荧光强度随不同浓度腺苷变化的 突光光谱图。
[0034] 图4是本发明实施例1所构建的检测腺苷体系，不同浓度腺苷对荧光强度的标准 曲线图。
[0035] 图5是是本发明实施例2所构建的检测腺苷体系，不同浓度腺苷对荧光强度的标 准曲线图。
[0036] 图6是本发明实施例3所构建的检测腺苷体系，不同浓度腺苷对荧光强度的标准 曲线图。
【具体实施方式】
[0037] 实施例对本发明作进一步说明，本发明的保护内容不限于以下实例。在不背离发 明构思的范围下，本领域技术人员能够想到的变化都包括在本发明中，并以权利要求书为 保护范围。
[0038] 实施例1
[0039] 具体操作步骤如下：
[0040] 1)、合成直径为13nm的金纳米颗粒；
[0041] 合成过程如下：将100mL蒸馏水和2mLl%氯金酸，加入到250mL三颈烧瓶中，并在 剧烈搅拌的条件下加热至沸腾。然后，迅速将新鲜配制的1 %柠檬酸钠溶液加入到上述沸腾 溶液中，反应15min后，继续搅拌使溶液冷却至室温，于4°C保存。
[0042] 2)、将巯基ssDNA修饰到AuNPs表面上构成ssDNA-AuNPs体系；
[0043] 将序列为 Y -SH-C6-CAGTCTGGACCC-3 ^ 的 DNA 配制成浓度 10uM，取 70ul 上述 DNA 溶液与200ul金纳米颗粒混合培养16h后，加2MNaCl使其最终浓度为0. 1M，陈化24h后， 用0. lMPBS(pH7. 4)离心洗3次后，得到的红色物质溶解在200ulTris-HCl (pH7. 4)缓冲溶 液中。
[0044] 3)、将：V修饰有FAM的腺苷核酸适配体杂交到上述ssDNA-AuNPs构成 dsDNA-AuNPs体系，对其进行荧光检测及观察溶液颜色；
[0045] 在腺苷核酸适配体3'修饰上FAM，其序列为：
[0046] 5' -TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCAGACTG-FAM-3，
[0047] 将其与步骤2)中制得的ssDNA-AuNPs按DNA摩尔比1 :1混合，在95°C水浴中，反 应5min，然后再缓慢降到室温。再将所得溶液离心洗涤3次后，沉淀溶解在0. 1MPBS (pH7. 4) 中。
[0048] 4)、调节dsDNA-AuNPs体系的盐浓度并对其进行荧光检测及观察溶液颜色；
[0049] 在上述dsDNA-AuNPs体系中缓慢加入lMMgCl2盐溶液，使其最终浓度为5mM。取上 述溶液于lcm的荧光比色皿中，在激发波长为494nm，发射波长为522nm处的荧光强度，并观 察到此时溶液颜色为红色。
[0050] 5)、在dsDNA-AuNPs盐溶液体系中加入目标物腺苷，对其进行荧光检测及观察溶 液颜色变化；
[0051] 在步骤4)所得溶液中分别加入0,10, 20, 30,40, 50,60uM的腺苷待测物，震荡lmin 后，在室温下放置30min。取上述溶液于lcm的荧光比色皿中，在激发波长为494nm，发射波 长为522nm处的荧光强度，并观察到此时溶液颜色为紫色。
[0052] 参见图3,在激发波长为494nm，发射波长为522nm处的荧光强度随不同浓度腺苷 (0-60uM)变化的荧光光谱图。
[0053] 参见图4,不同浓度腺苷对荧光强度的标准曲线图。
[0054] 实施例2
[0055] 具体操作步骤如下：
[0056] 1)、合成直径为5nm的金纳米颗粒；
[0057] 合成过程如下：将70mL蒸馏水和10mL0. 1%氯金酸，加入到250mL三颈烧瓶中，并 在剧烈搅拌的条件下加热至沸腾。然后，迅速将新鲜配制的4mLl %柠檬酸钠和5mLl %单宁 酸的混合溶液加到上述沸腾溶液中，反应lOmin后，继续搅拌使溶液冷却至室温，于4°C保 存。
[0058] 2)、将巯基ssDNA修饰到AuNPs表面上构成ssDNA-AuNPs体系；
[0059] 将序列为 Y -SH-C6-CTGACTGGACCC-3 ^ 的 DNA 配制成浓度 10uM，取 70ul 上述 DNA 溶液与200ul金纳米颗粒混合培养16h后，加 lMNaCl使其最终浓度为0. 1M，陈化24h后， 用0. lMPBS(pH7. 4)离心洗3次后，得到的红色物质溶解在200ulTris-HCl (pH7. 4)缓冲溶 液中。
[0060] 3)、将:V修饰有FAM的腺苷核酸适配体杂交到上述ssDNA-AuNPs构成 dsDNA-AuNPs体系，对其进行荧光检测及观察溶液颜色；
[0061] 在腺苷核酸适配体3'修饰上Cy3,其序列为：
[0062] 5，-TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCAGTCAG-Cy3-3，
[0063] 将其与步骤2)中制得的ssDNA-AuNPs按DNA摩尔比1 :1混合，在90°C水浴中，反 应8min，然后再缓慢降到室温。再将所得溶液离心洗涤3次后，沉淀溶解在0. 1MPBS (pH7. 4) 中。
[0064] 4)、调节dsDNA-AuNPs体系的盐浓度并对其进行荧光检测及观察溶液颜色；
[0065] 在上述dsDNA-AuNPs体系中缓慢加入2MNaCl盐溶液，使其最终浓度为7mM。取上 述溶液于lcm的荧光比色皿中，在激发波长为550nm，发射波长为570nm处的荧光强度，并观 察到此时溶液颜色为红色。
[0066] 5)、在dsDNA-AuNPs盐溶液体系中加入目标物腺苷，对其进行荧光检测及观察溶 液颜色变化；
[0067] 在步骤4)所得溶液中分别加入20, 30,40, 50,60, 70uM的腺苷待测物，震荡lmin 后，在室温下放置30min。取上述溶液于lcm的荧光比色皿中，在激发波长为550nm，发射波 长为570nm处的荧光强度，并观察到此时溶液颜色为紫色。
[0068] 参见图5,在激发波长为550nm，发射波长为570nm处的突光强度对不同浓度腺苷 (20-70uM)的标准曲线图。
[0069] 实施例3
[0070] 1)、合成直径为30nm的金纳米颗粒；
[0071] 合成过程如下：将1001^0.01%氯金酸，加入到25011^三颈烧瓶中，并在剧烈搅拌 的条件下加热至沸腾。然后，迅速将新鲜配制的lmLl%柠檬酸钠溶液加入到上述沸腾溶液 中，反应15min后，继续搅拌使溶液冷却至室温，于4°C保存。
[0072] 2)、将巯基ssDNA修饰到AuNPs表面上构成ssDNA-AuNPs体系；
[0073] 将序列为 5' -SH-C6-GCCACTGGACCC-3' 的 DNA 配制成浓度 10uM，取 70ul 上述 DNA 溶液与200ul金纳米颗粒混合培养24h后，每5min加 luLlMNaCl使其最终浓度为0. 1M，用 0. lMPBS(pH7. 4)离心洗3次后，得到的红色物质溶解在200ulTris-HCl (pH7. 4)缓冲溶液 中。
[0074] 3)、将：V修饰有FAM的腺苷核酸适配体杂交到上述ssDNA-AuNPs构成 dsDNA-AuNPs体系，对其进行荧光检测及观察溶液颜色；
[0075] 在腺苷核酸适配体3'修饰上Cy5,其序列为：
[0076] 5，-TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCAGTGGC-Cy5-3，
[0077] 将其与步骤2)中制得的ssDNA-AuNPs按DNA摩尔比1 :1混合，在95°C水浴中，反 应5min，然后再缓慢降到室温。再将所得溶液离心洗涤3次后，沉淀溶解在0. 1MPBS (pH7. 4) 中。
[0078] 4)、调节dsDNA-AuNPs体系的盐浓度并对其进行荧光检测及观察溶液颜色；
[0079] 在上述dsDNA-AuNPs体系中缓慢加入2MKC1盐溶液，使其最终浓度为8mM。取上述 溶液于lcm的荧光比色皿中，在激发波长为650nm，发射波长为670nm处的荧光强度，并观察 到此时溶液颜色为红色。
[0080] 5)、在dsDNA-AuNPs盐溶液体系中加入目标物腺苷，对其进行荧光检测及观察溶 液颜色变化；
[0081] 在步骤4)所得溶液中分别加入20,40,60,80,100,120uM的腺苷待测物，震荡lmin 后，在室温下放置30min。取上述溶液于lcm的荧光比色皿中，在激发波长为650nm，发射波 长为670nm处的荧光强度，并观察到此时溶液颜色为紫色。
[0082] 参见图6,在激发波长为550nm，发射波长为570nm处的荧光强度对不同浓度腺苷 (20-120uM)的标准曲线图。
【权利要求】
1. 一种基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的方法，其特征在于： 1) 、直径为5-40nm的金纳米颗粒（AuNPs)的合成； 2) 、将巯基单链DNA(ssDNA)修饰到AuNPs表面上构成ssDNA-AuNPs体系； 3) 、将3'修饰有荧光素的腺苷核酸适配体杂交到上述ssDNA-AuNPs构成dsDNA-AuNPs 体系； 4) 、调节dsDNA-AuNPs体系的盐浓度并对其进行荧光检测及观察溶液颜色； 5) 、在dsDNA-AuNPs盐溶液体系中加入目标物腺苷，对其进行荧光检测及观察溶液颜 色变化。
2. 根据权利要求1所述的一种基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的方法，其特征 在于，突光素作为突光信号分子，腺苷核酸适配体作为识别分子，AuNPs作为突光淬灭分子， 利用加入腺苷前后溶液荧光信号和颜色的差异，实现对目标物定性定量检测。
3. 根据权利要求1所述的一种基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的方法，其特征 在于，步骤1)合成AuNPs的还原剂是柠檬酸钠，单宁酸，硼氢化钠，抗坏血酸或盐酸羟胺。
4. 根据权利要求1的一种基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的方法，其特征在 于，步骤4)调节盐浓度采用NaCl，KC1，MgCl 2, BaCl2或CaCl2。
5. 根据权利要求1所述的一种基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的方法，其特征 在于，巯基ssDNA是通过金硫键作用连在AuNPs表面上的。
6. 根据权利要求1所述的一种基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的方法，其特征 在于，步骤3)涉及的荧光素有FAM，Cy3, Cy5, ROX，TexasRed。
7. 根据权利要求2所述的一种基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的方法，其特征 在于，腺苷核酸适配体序列为 5 ' -TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCAGACTG-荧光素-3'， 5' -TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCAGTCAG-荧光素-3,， 5 ' -TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCAGTGGC-荧光素-3'， 5 ' -TGGAAGGAGGCGTTATGAGGGGGTCCACGCAG-荧光素-3'。
8. 根据权利要求1所述的一种基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的方法，其特征 在于，巯基ssDNA序列为 5' -SH-C6-CAGTCTGGACCC-3; ,5' -SH-C6-CTGACTGGACCC-3;, 5' -SH-C6-GCCACTGGACCC-3^，5; -SH-C6-CTGCGTGGACCC-3^。
9. 根据权利要求1所述的一种基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的方法，其特征 在于，步骤3) dsDNA-AuNPs是由所述的腺苷核酸适配体和巯基DNA在85-95°C，5-10min的 退火条件下杂交组成。
10. 根据权利要求书1所述的一种基于荧光和比色双重检测体系测定腺苷的方法，其 特征在于，步骤5)加入腺苷的浓度范围在0-120uM。
【文档编号】G01N21/78GK104155273SQ201410384419
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月6日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】温永强, 赵娜, 桂万元, 王文谦, 焦翔宇, 李延生 申请人:北京科技大学