一种灰霉病的苗期诊断方法
【专利摘要】本发明提供一种灰霉病的苗期诊断方法，该方法包括：根据病情指数调查和分析，通过检测苗期叶片内的ROS和钙含量，确定了灰霉病感染的基准指标为：ROS染色比例为0.53，叶片内钙离子的含量为139.45μg/g；在实际诊断检测中，当ROS染色比例≥0.53和/或钙含量≥140μg/g时，灰霉病不会发生，当ROS染色比例＜0.53和/或钙含量＜140μg/g时，可以通过施肥措施调控叶片内钙离子的含量，该方法具有操作简单，重复性好，结果准确等特点。该方法实现了病害的苗期诊断方法，为提早采取有效预防措施提供了科学的依据和方法。
【专利说明】一种灰霉病的苗期诊断方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物病害防治【技术领域】，具体涉及一种对灰霉病的苗期诊断方法。
【背景技术】
[0002]灰霉病是由半知菌亚门灰葡萄孢属（BotrytiscinereaPers.)侵染所致，该病原 菌寄主广泛，可侵染茄科、葫芦科、蔷薇科、豆科等200余种植物。是一种毁灭性病害，设施 番茄尤为严重，由灰霉病所造成的产量损失一般在10%?20%，严重者可达60%以上，甚 至出现因灰霉病大发生、防治不及时而造成的番茄毁棚事件。
[0003]该病发生早期在作物叶片中会产生一系列的生理变动，随后可以侵染叶、茎、花等 器官；
[0004] 该病原菌繁殖速度快、变异频率高、易产生抗药性，同时缺乏抗性寄主资源，导致 该病害的防治十分困难。
[0005] 在植物与病原物相互作用的过程中，植物体内会产生一系列的防御反应，以抵抗 病原物的侵染，在此过程中也会产生许多抗性相关物质。当病原菌刺激植物细胞时，最早的 细胞反应之一包括钙离子通道的打开和随后钙离子涌入到细胞质，因此植物叶片的钙含量 会相应变化且升高，从而引起细胞内发生一系列的生理生化反应，继而引起局部和系统抗 性。同时植物体也会合成水杨酸（SA)，并被浸染点的细胞受体接受，引起浸染叶片的过敏反 应（HR)，植物免疫反应最明显的表现是HR，即在病原体侵染部位生成坏死性病斑，且该反 应通常与活性氧（R0S)的积累有密切关系。
[0006] 目前，国内外对灰霉病的苗期诊断方法研究不多，近几年来，利用植物生长和生理 生化指标进行间接鉴定的研究有很多报道，利用苗期生理指标评价植物的病害发生情况显 得尤为重要。但是，目前还没有统一的鉴定方法和评价体系。因此，为了能有效防治灰霉病 在的爆发，发明人进行了灰霉病的苗期诊断方法的研究。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提出一种对植物灰霉病的苗期诊断方法，由于当前灰霉病常常在 果实期爆发并对茄果类的产量造成重大影响，而在苗期对其进行苗期监控并采取有机农业 防治措施，能有效避免常规的化学药剂造成的用药不选择、用量不规范、方法不合理、防病 效果差、环境污染重等不良影响。该方法快速简便，成本低。而且容易操作，不需要昂贵的 设备。有利于推广应用。本发明所述的灰霉病的苗期诊断方法，其包括如下步骤：
[0008] (1)取待检植物苗期31天的第三、四叶位叶片，分别进行R0S的原位检测和钙含量 检测；
[0009] (2)灰霉病感染的评判指标为R0S染色比例彡0? 53,和/或钙含量彡140i!g/g。 即当R0S染色比例彡0. 53和/或钙含量彡140yg/g时，灰霉病不会发生，本发明提供的评 判指标R0S染色比例或钙含量，可以单一使用作为预测病害发生情况的依据，但是如果同 时满足R0S染色比例和钙含量的评判标准，则预测结果更为准确。
[0010] 由于钙是作物生长的必需大量元素，是影响作物抗性和抑制病害发生的最关键的 营养因子，是其他矿质元素不可比拟的；一定浓度的钙离子可以直接抑制病菌的生长；此 夕卜，Ca2+能显著提高H202含量，H202持续诱导病程相关基因的表达，使植物抗病性增强。因 此，本发明选择叶片的钙离子含量作为病害诊断指标。
[0011]R0S是活性氧的统称，其中最有效的成分就是过氧化氢（H202)，H202是动植物细胞 应答各种逆境产生的重要信号分子，H202含量增加可增强细胞壁，促进植物抗毒素产生，也 可直接杀死病原菌产生过敏性坏死（HR)，诱导抗病相关酶及病程相关蛋白基因PR1的表 达，产生抗病反应。因此，本发明选择叶片的R0S作为病害诊断指标。
[0012] 本发明上述技术方案中所述的方法，其中步骤（1)所述R0S的原位检测方法为：将 叶片浸泡在lmg/mL的DAB溶液中，25°C环境中光照8h后，取出浸泡过的叶片置于95%乙醇 中煮沸30min脱色，然后将叶片在95%乙醇中泡4h，测定叶片中出现棕色斑点的数量，计算 R0S染色比例。
[0013] 本发明上述技术方案中所述的方法，其中步骤（1)所述测定钙含量方法为：先称 取叶片样品干重，再经浓HN03和H202浸泡12h后用微波消解仪进行消解，得到的消解液用 高纯水定容至50mL容量瓶中，用原子吸收分光光度计测定钙含量。所述的测定钙含量方法 的更详细操作如下述实施例。
[0014] 本发明上述技术方案中所述的方法，其中步骤（1)所述待检植物为茄科、葫芦科、 豆科等多种蔬菜，尤其适用于番茄。
[0015] 本发明还公开一种灰霉病的苗期预防方法，其包括如下步骤：按照上文所述灰 霉病的苗期诊断方法对待检植物叶片进行诊断，当R0S染色比例> 0. 53和/或钙含量 彡140yg/g时，灰霉病不会发生；当R0S染色比例< 0. 53和/或钙含量< 140yg/g时，可 以通过施肥措施调控叶片内钙离子的含量。
[0016] 本发明选用R0S评价法，其目的是检测在病害侵染后引起植株细胞内部的生理变 化，由于病害的侵染，造成过氧化物增加，过氧化物对植株细胞造成损害，损害的程度经过 染色后可见，斑点数目是染色后细胞被危害的数目，数目多意味着危害重。
[0017] 虽然不同蔬菜对钙离子需求不同，但大多蔬菜在苗期对营养的需求没有大的差 异；本发明选择检测叶片内的钙离子浓度，其并不受土壤和施肥等外界因素影响，同时，本 申请选择番茄为例（番茄是最敏感的蔬菜），使得方法的建立更具代表性。测定叶片中的钙 含量，可以根据测定值的范围判定番茄灰霉病发生的病情指数，并采取补充钙的措施提高 植株的抗病性，起到苗期防治的效果。
[0018] 与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0019] 本发明率先提出灰霉病的苗期诊断方法，通过苗期诊断预测灰霉病的发生，并可 以通过调节钙离子浓度进行有效的预防。诊断材料容易获得，操作简单，具有重复性好，结 果准确等特点，有利于推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1不同钙浓度处理下番茄叶片R0S爆发的情况，其中：横坐标的六个时间点表 示所有番茄叶片接菌之后的时间；纵坐标的五个处理表示五个不同钙浓度的营养液，其中 0XCa2+ (Ca2+ 浓度为OmM)、1/5XCa2+ (Ca2+ 浓度为 0? 75mM)、1XCa2+ (Ca2+ 浓度为 3. 75mM)、 2XCa2+(Ca2+浓度为7. 5mM)和4XCa2+(Ca2+浓度为15mM)，从图中信息可知叶片上的棕色斑 点表示染色后细胞被危害的数目也就是病害侵染的严重程度。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例对本发明做详细说明：
[0022] 本发明中所使用的试验材料、试剂及试验方法如无特殊说明，均以常规途径获得 或以常规试验方法制备，其中：
[0023] 本发明实施例选择灰霉菌孢子悬浮液（浓度为106个/mL)为代表菌，其属于半知 菌亚门灰葡萄孢属，拉丁文名为BotrytiscinereaPers.，此菌种源于本实验室自行分离 的品种，分离时所用的染病番茄叶片采于中国农业大学上庄试验站，对菌种进行分离和鉴 定，通过观察菌落颜色和分生孢子梗、分生孢子、菌核的形态特征确定菌的种类为灰霉菌。
[0024] 番茄种子：品种为中杂105,购于中国农业科学院蔬菜研究所。中杂105为植株无 限生长型，生长势中等，中早熟。幼果无绿色果肩，成熟果实粉红色。果实圆形，果面光滑， 大小均匀一致，单果重180?220g。果实硬度高，耐贮运。商品果率高，品质优，口味酸甜适 中。抗番茄花叶病毒病（T0MV)、叶霉病和枯萎病。丰产性好，特别适合日光温室和大棚栽 培，是设施番茄的常见品种。
[0025]荷兰番茄专用配方营养液（单位：mg/L) :Ca(N03)2886，KN03303，KH2P04204，MgS0 4247,（NH4)2S0433,K2S04218,Fe-EDTA20,H3B032. 86,MnS042. 13,ZnS040. 22,CuS040 . 08，和 NH4M〇040. 02。1/2荷兰温室番茄专用配方营养液为上述物质含量的一半，0XCa2+(Ca2+浓度 为OmM，其中CO(NH2) 2 为 886mg/L，Ca(N03) 2 为Omg/L，其余都不变）、1/5XCa2+ (Ca2+ 浓度为 0? 75mM，其中CO(NH2) 2 为 443mg/L，Ca(N03) 2 为 443mg/L，其余都不变）、1XCa2+ (Ca2+ 浓度为 3. 75mM，为荷兰温室番茄专用配方营养液）、2XCa2+ (Ca2+浓度为7. 5mM，在荷兰温室番茄专 用配方营养液的基础上增施CaCl2为443mg/L)和4XCa2+(Ca2+浓度为15mM，在荷兰温室番 茄专用配方营养液的基础上增施CaCl2为886mg/L)。
[0026]DAB溶液：3, 3'-二氨基联苯胺（DAB)购于SIGMA公司，产品编号：D8001，CAS号 91-95-2,lmg/mLDAB溶液是将0. 01g的DAB溶于10mL蒸馏水中，一定要现配现用，此时溶 液的pH约为3. 8。
[0027] 实施例1
[0028] 1育苗培养
[0029] 将层积好的番爺种子播入营养钵（高12cmX直径12cm)中，砂基培养，每钵20株， 共5钵，培养条件为：26°C黑暗恒温环境；待幼苗长2片真叶时，喷施1/2荷兰温室番茄营养 液，每4d喷施一次，其间用清水补充。
[0030] 2不同生长条件处理
[0031] 幼苗长至8片真叶时，选均匀一致的幼苗移至1/2荷兰温室番茄营养液的水培盆 (长15cmX宽lOcmX高12cm)中，每盆植10株，共5盆，随机排列。气泵正常通气（20min/ h)，每7d更换一次营养液（即1/2荷兰温室番爺营养液，更换时原营养液全部倒掉再更换 新的营养液）。培养条件为：14h光照/d，光照强度150001X，昼温23°C/夜温18°C，昼夜 湿度65 % /80 %。培养28d后，根据研究需要，设定五个不同钙浓度的营养液，配方如上述 所示，分别是 〇XCa2+ (Ca2+ 浓度为OmM)、1/5XCa2+ (Ca2+ 浓度为 0. 75mM)、1XCa2+ (Ca2+ 浓度为 3. 75mM)、2XCa2+(Ca2+浓度为7. 5mM)和4XCa2+(Ca2+浓度为15mM)，培养条件和前期完全一 致。
[0032] 3病害处理
[0033] 利用上述五组不同钙浓度的营养液处理3d后，将五组番茄植株分别喷施灰霉菌 孢子悬浮液（浓度为1〇6个/mL)，暗处理18°C-天。剩下六天的培养条件为14h光照/d， 光照强度150001x，昼温20°C/夜温18°C，昼夜湿度均为100%。
[0034] 4病害调查与分级
[0035] 五组番茄植株在接菌7d后，根据以下分级标准调查发病情况，以后每隔2d(测定 包括6个时间点为接菌后0h、6h、12h、24h、48h、96h测定）调查一次病害情况，记录病情指 数。确立病害等级，依照分级标准对发病情况进行分级。
[0036] 番茄苗期灰霉病病情分级标准：0级：无病；1级：1/4以下叶片发病；2级：1/4? 1/2叶片发病；3级：1/2?3/4叶片发病；4级：3/4以上叶片发病或全株枯萎、倒苗。
[0037] 结果计算：病情指数=100XE(各级病叶数X各级代表值V(调查总叶 数X9)。
[0038] 5建立评价体系
[0039] 采用两种评价方法，建立一套适合灰霉病的苗期诊断和鉴定方法。通过病情指数 与R0S、叶片钙含量的定量关系确定苗期病害的诊断指标。
[0040] 1)R0S评价法
[0041] 培养至28天的植株经过五组不同钙浓度的营养液处理3d后，进行接菌处理，在接 菌之后的0,6,12, 24,48,96h取每个处理的叶片进行R0S的原位检测，观察并计算番茄叶片 中棕色（非黄色）斑点面积的大小，反映植物体对病害抵抗能力的强弱，根据染色比例判定 番茄灰霉病发生的病情指数，其中，R0S染色比例=(斑点面积/叶片总面积）X100%。
[0042] 上文所述的R0S的原位检测方法：将待检植株的第三、四叶位叶片浸泡在lmg/mL 的DAB溶液中，25°C环境中光照8h后，取出浸泡过的叶片置于95%乙醇中煮沸30min脱色， 然后将叶片在新鲜的95%乙醇中泡4h，测定叶片中出现棕色斑点的面积；
[0043] 2)钙含量评价法
[0044] 培养至28天的植株经过五组不同钙浓度的营养液处理3d后，进行接菌处理，在接 菌之后的0,6，12,24,48,961!取每个处理的叶片进行叶片中钙含量的测定，根据测定值的 范围判定番茄灰霉病发生的病情指数。
[0045] 上文所述的测定钙含量的方法：将待检植株的第三、四叶位叶片样品置于烘箱中， 在105°C下杀青30min，然后将温度调为80°C，连续烘48h。随后样品进行粉粹研磨，称取 干重后，样品转移至干净且干燥的消煮管底部。用移液管向消煮管内加入6mL优级纯的浓 HN03，摇匀后盖上盖子过夜。第二天消煮前，每个消煮管中加4mL优级纯的H202，摇匀后拧紧 管盖。随后用微波消解仪进行消解，得到的消解液用高纯水定容至50mL容量瓶中，用原子 吸收分光光度计测定叶片中的钙含量；
[0046] 6?鉴定结果
[0047]图1为不同钙浓度处理下番茄叶片R0S爆发的情况，其中：横坐标的六个时间点 表示所有番茄叶片接菌之后的时间；纵坐标的五个处理表示五个不同钙浓度的营养液，其 中 0XCa2+ (Ca2+ 浓度为OmM)、1/5XCa2+ (Ca2+ 浓度为 0? 75mM)、1XCa2+ (Ca2+ 浓度为 3. 75mM)、 2XCa2+(Ca2+浓度为7. 5mM)和4XCa2+(Ca2+浓度为15mM)，从图中信息可知叶片上的棕色斑 点表示染色后细胞被危害的数目也就是病害侵染的严重程度。
[0048] 表1不同钙浓度处理下番茄植株的病情指数
【权利要求】
1. 一种灰霉病的苗期诊断方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 取待检植物苗期31天的第三、四叶位叶片，分别进行ROS的原位检测和钙含量检 测； (2) 灰霉病感染的评判指标为ROS染色比例彡0. 53和/或钙含量彡140 y g/g。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述ROS的原位检测方法为：将 叶片样品浸泡在lmg/mL的DAB溶液中，25°C光照8h后，取出浸泡过的叶片样品置于95%乙 醇中煮沸30min脱色，然后将叶片样品在95%乙醇中泡4h，测定叶片样品中出现棕色斑点 的数量，计算R0S染色比例。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述测定钙含量方法为：先称取 叶片样品干重，再经浓HN03和H202浸泡12h后用微波消解仪进行消解，得到的消解液用高 纯水定容至50mL容量瓶中，用原子吸收分光光度计测定钙含量。
4. 一种灰霉病的苗期预防方法，其特征在于，包括如下步骤：按照权利要求1所述灰 霉病的苗期诊断方法对待检植物叶片进行诊断，当R0S染色比例> 0. 53和/或钙含量 彡140iig/g时，灰霉病不会发生；当R0S染色比例<0. 53和/或钙含量< 140iig/g时，通 过施肥措施调控叶片内钙离子的含量。
【文档编号】G01N33/48GK104330548SQ201410587556
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】余慧芸 申请人:中国农业大学