多肽、包含该多肽的检测器件和包含该器件的检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及多肽、包含多肽的检测器件、以及包含检测器件的诊断试剂盒。将本发明应用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断，能够取得令人满意的效果。
【专利说明】 多肽、包含该多肽的检测器件和包含该器件的检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测领域，特别是可用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断的多肽、包含该多肽的检测器件的检测试剂盒。
[0002]_
【背景技术】
[0003]肠道病毒71型(Human enterovirus 71)，简称EV71，是引起婴幼儿手足口病(hand-foot and mouth disease ;HFMD)主要病原体之一。人类肠病毒71型于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的。
[0004]EV71主要引起手足口病，还可引起无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹等多种神经系统疾病。手足口病和中枢神经系统感染是EV71感染而引起的两大常见临床症状。病毒从咽部或肠道侵入，在局部黏膜或淋巴组织中繁殖，并由局部排出，此时可引起局部症状。继而病毒又侵入局部淋巴结，并由此进入血液循环导致第一次病毒血症。病毒经血循环侵入网状内皮组织、深层淋巴结、肝、脾、骨髓等处大量繁殖并由此进入血液循环，引起第二次病毒血症。病毒可随血流进入全身各器官，如中枢神经系统、皮肤黏膜、心脏等处，进一步繁殖并引起病变。易感者感染EV71后，出现血管变态反应和组织炎症病变。当病毒累及中枢神经系统时，组织炎症较神经毒性作用更加强烈，中枢神经系统小血管内皮最易受到损害。细胞融合、血管炎性变、血栓形成可导致缺血和梗死。在脊髓索、脑干、间脑、大脑和小脑的局部组织中，除嗜神经性作用外，还存在广泛的血管周围和实质细胞炎症道病毒71型危害极大，目前急需简便快捷准确的仪器是实现对其的快速检测。
[0005]
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种多肽、包含该多肽的检测器件、以及包含该检测器件的检测试剂盒，它们对肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断有用的。本发明目的在于提供该多肽在制备可用于肠道病毒71型诊断的检测试剂盒中的用途。
[0007]S卩，本发明包含下述技术方案:
1.一种多肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，即:QVVTVMDDLCQNPDGKDMSL。
[0008]2.一种检测器件，其包括:
固体载体，以及
连接于该固体载体上的权利要求1所述的多肽。
[0009]3.根据权利要求2所述的检测器件，其中，所述固体载体是SJ改性硅胶。
[0010]4.根据权利要求2所述的检测器件，其用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断。
[0011]5.一种检测试剂盒，其包括权利要求2~4中任一项所述的检测器件。
[0012]6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断。
[0013]7.权利要求1所述的多肽在制备检测试剂盒中的用途。
[0014]8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述检测试剂盒用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断。
[0015]9.根据权利要求7所述的用途，其中，所述检测试剂盒包括权利要求2~4中任一项所述的检测器件。
[0016]将本发明应用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断，能够取得令人满意的效果O
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1对SJ改性硅胶(iPDMS薄膜)的制作过程进行说明的示意图。
[0018]图2说明多肽微阵列点样模式的示意图。
[0019]图3是显示对健康正常人或非肠道病毒71型感染病人血清进行检测的结果的照片。
[0020]图4是显示对肠道病毒71型感染病人血清进行检测的结果的照片。
[0021]发明的【具体实施方式】本发明的多肽
在另一个方面中，本发明提供对对肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断有用的多肽，由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列构成，S卩:QVVTVMDDLCQNPDGKDMSL。如实施例所示，本发明的多肽对肠道病毒71型感染病人的血清呈阳性反应，而对健康正常人或非肠道病毒71型感染病人血清呈阴性反应。因此，本发明的多肽作为肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断工具是有用的。本发明的多肽可以用于制造可用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断的检测器件(例如下述的本发明的检测器件)或检测试剂盒(例如下述的本发明的检测试剂盒)。
[0022]本发明的多肽可以适宜采用(I)化学合成方法、或(2)酶反应合成方法等公知方法来获得，但不限于此，其中化学合成更为简便。在化学合成本发明的多肽情况下，通过使用肽合成仪合成或者半合成该多肽来进行。作为化学合成方法，可以列举出例如肽固相合成法等。这样合成的肽可以采用常规手段例如离子交换色谱、反相高效液体色谱、亲和色谱等进行纯化。这样的肽固相合成方法以及其后的肽纯化都是本【技术领域】公知的。
[0023]此外，在通过酶反应生产本发明的多肽的情况下，可以采用例如国际公开小册子W02004/011653号所述的方法。S卩,可以这样来生产:将一方的氨基酸或二肽的羧基末端被酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、与氨基酸处于游离状态的氨基酸(例如羧基保护的氨基酸)在肽合成酶的存在下进行反应，生成的二肽或三肽。作为肽合成酶，可以列举出:具有生成肽的能力的微生物的培养物、由该培养物分离的微生物菌体、或该微生物的菌体处理物、或该微生物来源的肽合成酶。
[0024]而且，除了上述的酶方法、化学合成方法以外，还可以采用例如基因工程方法来生产本发明的多肽。
[0025]本发明的多肽的氨基酸序列可以采用常规的方法进行分析和确认，例如可以利用质谱、色谱等方法来进行分析和确认。
[0026]本发明的检测器件
在另一方面中，本发明还提供一种检测器件(本发明的检测器件)，其包括固体载体、以及连接于该固体载体上的本发明的蛋白质或本发明的多肽。所述检测器件对于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断是有用的。
[0027]在本发明中，对固体载体没有特殊限制，只要是作为固体或不溶性材料(例如是可以通过过滤、沉淀、磁性分离等从反应混合物中分离的材料)的载体即可。
[0028]构成固体载体的材料包括但不限于:娃胶(聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纤维素、特氟隆?、硝基纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚丙烯、尼龙、聚偏二氟乙烯、胶乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纤维、金、钼、银、铜、铁、不锈钢、铁氧体、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚乳酸、树脂、多糖类、蛋白(白蛋白等)、碳或它们的组人坐I=I 寸 O
[0029]固体载体的形状包括但不要限于:珠子、磁珠、薄膜、微细管、滤膜、板、微量板、碳纳米管、传感器芯片等。正如本【技术领域】公知的那样，薄膜或板等平坦的固体载体上可以设置凹坑、沟槽、滤膜底部等。
[0030]在本发明中，磁珠可以具有约2511111~约Imm范围的球体直径。在优选的实施方式中，磁珠具有约5011!11~约1ym范围的直径。磁珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
[0031]在本发明中，由Sepharose等高交联球形琼脂糖制成的珠子具有约24 μ m~约165 μ m范围的直径。优选地，高交联球形琼脂糖珠具有约24 μ m~约44 μ m范围的直径。高交联球形琼脂糖珠的尺寸可以根据特定的用途来进行选择。
[0032]具有疏水性表面的固体载体的例子包括可从Polysciences, Warrington, PA或Spherotech, Liberville, IL购买的制品等聚苯乙烯胶乳珠。
[0033]二氧化硅(S12)-处理或二氧化硅(S12)基的固体载体的例子包括可从Polysciences, Warrington, PA购买的超常磁性二氧化娃珠等,其可以用于捕捉核酸(例如DNA) ο或者，还可以使用可从Dynal B1tech购买的M-280等。
[0034]具有亲水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的细菌细胞、核酸以及其它成分。作为该磁珠的例子，可以列举出Polysciences, Warrington, PA销售的珠子(名称:B1mag(注册商标)羧基)、或者 Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN 的名称为 MC02N/2928 的珠子。或者，可以使用Dynal B1tech销售的M-270等。
[0035]在本发明的一个优选实施方式中，所述固体载体是SJ改性硅胶，其是苏州傯聚生物材料有限公司开发的一种硅橡胶材质的微阵列固体支撑材料(iPDMS薄膜，参见中国专利公开CN101265329A)。这种材料是以生物学研究常用的PDMS为基础，在其中加入特定的引发剂成分(使该材料可通过表面引发聚合反应(SIP)实现表面功能化修饰)，再经过聚乙二醇甲基丙烯酸酯(poly (oligo (ethylene glycol) methacrylate) ,pOEGMA)表面修饰获得的。SJ改性娃胶具有优秀的抗蛋白质非特异性吸附(Nonspecific protein adsorpt1n,NPA)能力，可以将复杂蛋白免疫检测中的非特异性蛋白质吸附控制到接近“绝对O”水平(接近或低于仪器的检测极限)，不仅可以免除封闭和多次清洗的麻烦，还可以通过使用更强的信号扩增手段来提高蛋白质微阵列的灵敏性。而且其硅橡胶的本质赋予了该材料较强的机械性能和良好的可操作性。苏州傯聚已经成功地将SJ改性硅胶应用于11个肿瘤标志物组成的多指标联检微阵列ELISA试剂盒，实现了高通量和高灵敏的检测，证明了这种材料是一种优秀的蛋白质微阵列固体支撑材料。同时，这种材料还具有表面性质可调的特性，可以通过控制修饰反应时间在一定范围内调整其表面形貌。
[0036]本发明的多肽与固体载体的连接可以采用本领域技术人员公知的多肽与固体载体的连接方法来进行。例如，对于蛋白质/多肽与改性硅胶表面的连接而言，可以通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺[l-ethyl-3- (3-dimethyl am1-nopropyl)carbodiimide, EDC]和 N-轻基玻拍酸亚胺(N-hydroxysuccinimide, NHS)的反应将改性硅胶表面高分子链上的羧基(-C00H)基团改为活化基团，该活化基团可与蛋白/多肽上所带的氨基(-NH2)反应从而实现将蛋白/多肽固定于固体载体表面(参见例如Hongwei Ma,Yuanzi ffu, Xiaoli Yang, Xing Liu, JianJ an He, Long Fu, Jie Wang, Hongke Xu,Yi Shi and Renqian Zhong, Integrated poly (dime thy si loxane) with an intrinsicnonfouling property approaching “Absolute” zero background in immunoassays,Anal.Chem., 82, 6338 - 6342, 2010)。
[0037]对于点样时使用的点样液中本发明的多肽的浓度没有特殊限制，本领域技术人员可以依常规选择，优选为I μ g~1000 μ g/mL,更优选10 μ g~500 μ g/mL。此外,对于本发明的多肽在固体载体上分布的密度没有特殊限制，本领域技术人员可以依常规选择，优选为1-100 点 /10_2，更优选 5~50 点 /10_2。
[0038]本发明的检测器件对于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断是有用的，或者其可以用于制造可用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断的检测试剂盒。
[0039]本发明的检测试剂盒
在另一个方面中，本发明还提供一种检测试剂盒(本发明的检测试剂盒)，其包括本发明的检测器件。该检测试剂盒可用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断。
[0040]本发明的检测试剂盒必须包含本发明的检测器件。本发明的检测试剂盒还可以包括:
1.配好的血清样本稀释液或血清样本稀释液组分溶液:样本稀释液，例如有北京赛驰生物科技有限公司的样本稀释液(产品编号070021-S2)、郑州博威嘉生物科技有限公司的加样变色样本稀释液(产品编号bwj010103)等。该类样本稀释液为含BSA、蔗糖等成分的PBS溶液，含防腐剂，澄清液体，可直接使用。该样本稀释液用来稀释血清，试剂盒检测的血清要稀释适当倍数，例如2~200倍，优选10~100倍。
[0041]本发明的检测试剂盒还可以包括:
2.浓缩洗液及洗液:固体载体表面孵育血清及酶标二抗后，需用洗液清洗掉固体载体表面未结合的抗体和酶标二抗。浓缩洗液例如是1%的吐温20水溶液，使用时需稀释2~40倍、优选5~20倍。可以通过将浓缩洗液(1X )用纯化水或蒸馏水按1:9稀释，来配置洗液。例如，450 mL纯化水或蒸馏水中加入50 mL浓缩洗液(10 X )，充分混匀。未使用完的洗液放在2~8°C保存，可保存3个月。
[0042]本发明的检测试剂盒还可以包括:
3.酶标二抗溶液:人肠道病毒71型感染者血清中的IgG可与固体载体(例如SJ改性硅胶)上的本发明的多肽结合，酶标二抗可与抗体结合，而酶标二抗上的标记物可与发光底物混合溶液反应，从而发出可检测的光。酶标二抗可以是例如辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG。对酶标二抗在酶标二抗溶液中的浓度没有特殊限制，可以是例如lng~1000ng/mL0
[0043]本发明的检测试剂盒还可以包括:
4.发光底物混合溶液:发光底物混合溶液可与酶标二抗上标记的辣根过氧化物酶反应，使得反应发出仪器可检测到的化学光，发光底物混合溶液包括发光底物液A—过氧化氢溶液，及发光底物液B—发光氨(鲁米诺)溶液。使用时预先采用两种发光底物液体以等体积混合而成，得到发光底物混合溶液(45分钟内使用)。发光氨只有用氧化剂处理过才会发光。通常使用双氧水和一种氢氧化物碱的混合水溶液作为激发剂。在辣根过氧化物酶催化下，双氧水分解为氧气和水:
2 H2O2 — O2 + 2 H2O
鲁米诺与氢氧化物反应时生成了一个双负离子，它可被过氧化氢分解出的氧气氧化，产物为一个有机过氧化物。该过氧化物很不稳定，立即分解出氮气，生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。激发态至基态转化中，释放的能量以光子的形式存在，波长位于可见光的蓝光部分。发光底物混合溶液的例子例如Thermo Seientific公司的SuperSignal? ELISAFemto Maximum Sensitiv1-ty Substrate,货号 37074。
[0044]本发明的检测试剂盒还可以包括:
5.一个或两个以上的反应腔体，根据需求可以采用例如双面的生物孵育反应器，中国专利ZL 201120177686.3或者ZL201110142518.5;或者单面的生物孵育反应器ZL201220430886.X。
[0045]本发明的检测试剂盒还可以包括:
6.其他用于检测肠道病毒71型的检测分子(例如多肽、蛋白质、核酸等)。
[0046]本发明的检测试剂盒还可以包括:
7.使用说明书，其中记载了该检测试剂盒可以用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断。
[0047]反应器件和反应试剂盒可以例如采用凝胶成像仪进行化学发光成像。作为凝胶成像仪，可以采用例如GE LAS4000mini型或天能5500型微阵列成像仪。
实施例
[0048]以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但并不是对本发明技术范围的限定。通过本说明书的记载，本领域技术人员可以容易的对本发明进行修饰/改变，这些包含在本发明的技术范围内。本发明的范围由权利要求书确定。
[0049]1.多肽制备与确认
实施例中使用的多肽具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，由上海吉尔生化有限公司合成，该多肽的表征可通过氢谱和质谱确认合成了所述多肽。液相色谱法检测纯度:95.31%(面积归一法):质谱法检测(ES1-MS):计算分子量:2208.52，测试值:2208.06。
[0050]2.检测器件的制备
检测芯片是以SJ改性硅胶(iPDMS薄膜)为固体支撑材料，在其上通过点样固定多肽溶液制备而成。改性硅胶是在传统的聚二甲基硅氧烷材料中加入带烯烃末端的、表面弓I发聚合反应的引发剂，并通过热交联(硅氢键键合)固定到聚二甲基硅氧烷的三维结构中，得到SJ改性硅胶，其制作过程如图1所示。
[0051]其中的A和B为聚二甲基硅氧烷的两个组分，聚二甲基硅氧烷(Poly (dimethylsiloxane), Sylgard 184)购买自美国道康宁(DowCorning)公司，包含液态组分A(成分为金属钼催化剂与带乙烯基的二甲硅氧烷高分子前体混合物)和交联剂B(成分为带有乙烯基和S1-H基团的二甲基硅氧烷前体)两种成分。C为末端带乙烯基的引发剂，购于杭州东伟公司。最后修饰上的高分子是寡聚乙二醇甲基丙烯酸酯单体(Oligo (ethylene glycol) methacrylate,以下简称 0EGMA,分子量 Mw = 526)购买于Aldrich。将聚二甲基硅氧烷前体A和交联剂B与带乙烯基末端的引发剂C以A:B:C=10:1:0.5比例充分混合。通过固化反应制成透明的弹性硅橡胶，然后通过SIP技术进行表面修饰即可得到SJ改性硅胶。实验表明，SJ改性硅胶的表面有足够高密度的、通过共价键固定的引发剂，其可以通过表面引发聚合反应(SIP)实现表面高分子修饰。使用poly (OEGMA)(聚乙二醇甲基丙烯酸酯)进行反应获得聚乙二醇(Polyethylene Glycol, PEG)修饰的表面，实现较强的抗蛋白非特异性吸附的能力。
[0052]制好的SJ改性硅胶薄膜需保存在4°C冰箱中。
[0053]采用晶芯?PersonalArrayerTM 16个人点样仪在改性娃胶上制备多肽微阵列，过程为:
I)预处理
将SJ改性硅胶薄片(15X15mm2)浸泡在活化液中，30min后取出用去离子水淋洗3次，用氮气吹干，马上用于点样。
[0054]2)点样
将点样液稀释好并转移到384孔板相应的微孔中，将带样本的384孔板置于点样仪基台上，同时将预处理的改性硅胶薄片置于点样仪的基台上，马上进行点样。点样环境条件为室温(25°C )，湿度设定为50%。制成的多肽微阵列上每个点的点样量约为0.6nL，样点半径为200 μ m。
[0055]3)化学固定
刚制好的多肽微阵列要放在恒温恒湿箱(26°C，60%湿度)中固定至少6h。化学固定过程如下:
首先通过点样仪将包含有捕获多肽分子的缓冲液点在改性硅胶薄膜上，接着缓冲液开始蒸发，捕获多肽分子与SJ改性硅胶表面亲密接触并相互作用，通过化学结合，改性硅胶表面的ploy (OEGMA)高分子的末端-C00H与多肽分子的-一順2形成稳定共价键，进而将有化学活性的多肽分子固定在SJ改性硅胶表面。
[0056]4)装配
固定6h的多肽微阵列必须在两天内装配好。首先通过背胶将SJ改性硅胶薄片贴在专门的反应柱上，盖上反应腔体。一个反应器由两个反应柱和一个反应腔体组成。
[0057]5)保存
装配好的多肽微阵列，需要抽真空密封，保存在4°C的冰箱中，备用。
[0058]3.用检测器件进行检测检验步骤
1、开始检测前，将浓缩洗液按1:10的比例加入纯化水或蒸馏水进行稀释，稀释完成后得洗液，直接使用，使用移液枪将2mL洗液加到芯片表面，浸泡芯片3分钟，保证芯片表面被完全浸润。
[0059]2、将待测血清样本用样本稀释液按照1:40稀释混匀。
[0060]3、弃去浸泡芯片的洗液，在芯片表面完全湿润的状态下，每个血清样本吸取200 μ L稀释后的血清加入到芯片反应器内。
[0061]4、将芯片反应器放入芯片固定座，放到摇床上，开启摇床，频率150转/分钟，室温孵育30分钟。
[0062]5、弃去芯片反应器内的血清样本，用15mL洗液清洗反应腔体和芯片表面3次。
[0063]6、清洗完成后，每个芯片反应器分别加入200 μ L酶标二抗溶液，将芯片反应器放入芯片固定座，放到摇床上，开启摇床，频率150转/分钟，室温孵育30分钟。
[0064]7、弃去芯片反应器内的酶标二抗溶液，用15mL洗液清洗反应腔体和芯片表面3次。
[0065]8、可预先将发光底物液A和发光底物液B以等体积混合均匀，得发光底物混合溶液(45分钟内使用)。待清洗完成后，取下反应腔体，每个芯片表面分别加入15yL发光底物混合溶液，使发光底物混合溶液能均匀的铺于芯片表面。
[0066]9、将加入了发光液的芯片置于凝胶成像仪中化学发光成像，并判读结果。
[0067]健康正常人血清、肠道病毒71型感染病人血清及其他疾病病人血清样本由合作医院提供，疾病标准均经过临床检验确证，均获得了提供者的知情同意书。
[0068]阴性对照有PBS缓冲液(即在第3步中不用待测血清孵育，而用PBS溶液孵育，其余步骤相同)的对照，血清稀释液的对照，及阴性血清(指健康人及非肠道病毒71型感染病人的血清)的对照。
[0069]多肽微阵列的点样模式如图2所示:其中，黑色圆形的16个点的样本为人IgGJt为定位点；正方形的4个点的样本为PB点样液，作为实验的空白对照；白色圆形点的样本是其他的肠道病毒71型自身抗原蛋白多肽，作为检测指标(这些多肽有响应说明被检测的血清中有肠道病毒71型自身抗体)；星形点的样本多肽为本发明的多肽，它是肠道病毒71型自身抗原蛋白多肽，会对肠道病毒71型感染患者血清产生响应。
[0070]使用该多肽微阵列按照上述检测步骤对肠道病毒71型感染病人血清及阴性对照进行了检测，响应模式如图3~4所示:其中，图3显示了阴性对照的检测结果，只有黑色圆形所示的点的样本有响应。图4显示了肠道病毒71型感染病人血清的检测结果，黑色圆形、白色圆形和星形点的样本有响应。需要说明的是，仪器测得信号值由低到高，相应的信号点颜色由黑一红一白渐变。
【权利要求】
1.一种多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，即:QVVTVMDDLCQNPDGKDMSL。
2.一种检测器件，其包括: 固体载体，以及 连接于该固体载体上的权利要求1所述的多肽。
3.根据权利要求2所述的检测器件，其中，所述固体载体是SJ改性硅胶。
4.根据权利要求2所述的检测器件，其用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断。
5.一种检测试剂盒，其包括权利要求2~4中任一项所述的检测器件。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断。
7.权利要求1所述的多肽在制备检测试剂盒中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述检测试剂盒用于肠道病毒71型抗体IgG的临床辅助诊断。
9.根据权利要求7所述的用途，其中，所述检测试剂盒包括权利要求2~4中任一项所述的检测器件。
【文档编号】G01N33/569GK104447959SQ201410848156
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月31日 优先权日:2014年12月31日
【发明者】赵亚萍 申请人:赵亚萍