本发明属于生物医学工程
技术领域：
，特别涉及SSBP1蛋白的新应用。
背景技术：
：癌症的转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道、血管或体腔等途径，到达其他部分继续生长。癌症的转移是恶性肿瘤的特点之一，也是被认为是治疗失败、造成患者死亡的首要原因。一般来说，癌症转移的途径主要包括下述几种：(1)直接蔓延：随着肿瘤体积的不断增大，肿瘤细胞可沿周围正常组织的薄弱处，直接延伸，侵入并破坏邻近组织或器官。(2)淋巴道转移：肿瘤细胞侵入淋巴管后，随淋巴液转移到淋巴结，在淋巴结内生长形成转移瘤，是常见的肿瘤转移方式。(3)血行转移：癌细胞可经淋巴途径进入静脉，也可直接侵入血液循环而致远处转移。(4)种植性转移和经椎旁静脉系统的转移等等。对于癌症病人而言，早期诊断和控制转移是实现对癌症的临床治愈的关键，寻找与癌症转移有关的可靠且早期的预报信号，已成为肿瘤临床诊治领域的热点。技术实现要素：本发明的目的在于提供SSBP1蛋白在制备用于检测癌症转移的试剂盒、抑制癌症转移的药物以及抑制与癌症转移相关信号通路的药物中的应用，上述应用可有助于实现临床上对癌症转移的早期发现和不良预后。为解决上述技术问题，本发明的实施方式首先提供了SSBP1蛋白(single-strandedDNAbindingprotein1；SSBP1蛋白；线粒体单链结合蛋白1)在制备用于检测癌症转移的试剂盒中的应用，所述癌症为乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。在上述应用中，SSBP1蛋白用作检测癌症发生转移的蛋白质分子标记。具体来说，该种应用是检测SSBP1蛋白在乳腺、肺、卵巢或胃的细胞组织中的表达量是否存在表达下调：如存在表达下调，则得出发生癌症转移的结论；如不存在表达下调，则得出未发生癌症转移的结论。同时，本发明的实施方式也提供SSBP1蛋白在制备抑制癌症转移的药物中的应用，所述癌症为乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌。此外，本发明的实施方式还提供SSBP1蛋白在制备抑制TGF-β信号通路的药物中的应用，所述TGF-β信号通路与乳腺癌转移相关。具体来说，本发明的实施方式首先通过对亲本乳腺癌细胞MDA-MB-231及其衍生的高转移细胞MDA-MB-231HM和MDA-MB-231Bo进行线粒体定量蛋白组学对比分析，发现线粒体单链结合蛋白1(SSBP1)在具有高转移潜能的乳腺癌细胞呈现低表达。其次通过体外细胞功能学实验以及裸鼠动物模型，均证实沉默SSBP1可以促进乳腺癌的转移能力；而过表达SSBP1能显著抑制其转移能力。进而发现沉默SSBP1能增加TGF-β的转录，从而导致细胞TGF-β分泌增加，TGF-β/SMAD信号通路被激活，诱发细胞发生EMT，最终促进乳腺癌细胞转移。同时，在肺癌、卵巢癌或胃癌细胞系中，也发现干扰SSBP1后能显著促进肿瘤的迁移能力。发明的实施方式所提供的SSBP1蛋白的上述种应用，将为乳腺癌、肺癌、卵巢癌或胃癌转移的诊断或预后提供一条全新的途径，SSBP1蛋白更有可能成为对癌症转移进行临床治疗的靶分子。附图说明图1是具体实施方式中线粒体蛋白SSBP1的质谱结果；图2是具体实施方式中线粒体蛋白质组学显示SSBP1在MDA-MB-231、MDA-MB-231HM、MDA-MB-231Bo细胞系中差异表达的结果图；图3是具体实施方式中Westernblot验证SSBP1在MDA-MB-231、MDA-MB-231HM、MDA-MB-231Bo细胞系中表达情况的结果图；图4是具体实施方式中Real-TimePCR显示SSBP1在乳腺癌细胞系中表达情况的结果图；图5是具体实施方式中Westernblot验证干扰表达SSBP1和过表达SSBP1在乳腺癌细胞中的效果的结果图；图6是具体实施方式中Transwell验证在MDA-MB-231中干扰SSBP1表达后对侵袭和迁移的影响的结果图，其中，图6-1是实验结果的代表性图片，图6-2是实验结果的柱状统计图；图7是具体实施方式中Transwell验证在MDA-MB-468中干扰SSBP1表达后对侵袭和迁移的影响的结果图，其中，图7-1是实验结果的代表性图片，图7-2是实验结果的柱状统计图；图8是具体实施方式中Transwell验证在MDA-MB-231Bo中过表达SSBP1后对侵袭的影响的结果图，其中，图8-1是实验结果的代表性图片，图8-2是实验结果的柱状统计图；图9是具体实施方式中WB检测TGF-β信号通路相关分子的结果图；图10是具体实施方式中TGF-β信号通路抑制剂处理后，逆转SSBP1对转移的影响结果图；图11是具体实施方式中Real-timePCR检测SSBP1干扰和过表达后 TGF-β的mRNA水平：其中，图11-1是MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞株的实验结果图、图11-2是MDA-MB-231Bo细胞株的实验结果图；图12是具体实施方式中ELISA检测SSBP1干扰和过表达后TGF-β的分泌水平：其中，图12-1是MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞株的实验结果图、图12-2是MDA-MB-231Bo细胞株的实验结果图；图13是具体实施方式中小鼠活体成像验证干扰和过表达SSBP1后体内转移效果的结果图；图14是具体实施方式中临床标本中检测SSBP1与患者的生存率的结果图；图15是具体实施方式中临床标本中检测SSBP1与患者的肿瘤分期的结果图；图16是具体实施方式中临床标本中检测SSBP1与患者的淋巴结转移状态的结果图；图17是具体实施方式中Real-timePCR验证SSBP1在肺癌细胞A549、胃癌细胞SGC-7901和卵巢癌细胞A2780中的干扰效果的结果图；图18是实施例Transwell验证在肺癌细胞A549中沉默SSBP1的表达后对侵袭和迁移的影响的结果图；图19是实施例Transwell验证在卵巢癌细胞A2780中沉默SSBP1的表达后对侵袭和迁移的影响的结果图；图20是实施例Transwell验证在胃癌细胞SGC-7901中沉默SSBP1的表达后对侵袭和迁移的影响的结果图。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发 明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。1材料和方法1.1材料1.1.1细胞系人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、肺癌细胞A549、胃癌细胞SGC-7901、卵巢癌细胞A2780均购自中国科学院上海细胞库，MDA-MB-231HM、MDA-MB-231Bo系列高转移细胞株由本实验室构建。1.1.2裸鼠来源，品系和品种BALB/c(nu/nu)裸小鼠，由中国科学院上海实验动物中心提供。实验动物生产许可证编号：SCXK(沪)(2007-0005)；实验动物使用许可证编号合格证编号：SCXK(沪)(2007-0005)；日龄:28-35天；体重:16-20g；性别:雌性；饲养于SPF级环境中。1.1.2主要试剂1.1.2.1蛋白电泳及免疫印迹用试剂蛋白裂解液T-PER(Pierce)BCA试剂盒(索莱宝)4×蛋白上样缓冲液、过硫酸铵APS(生工)Trisbase、甘氨酸glycine、十二烷基硫酸钠SDS(Amresco)N,N,N',N'-四甲基乙二胺TEMED(Sigma)30％聚丙烯酰胺(索莱宝)分离胶缓冲液：1.5MTris，pH8.8(Bio-Rad)浓缩胶缓冲液：1.0MTris，pH6.8(Bio-Rad)一抗稀释液(碧云天)化学发光试剂(Millipore)脱脂奶粉(BD)本实施例的蛋白印迹(WB)实验中所用抗体详细信息参见下表1：表1蛋白印迹(WB)实验中用到的抗体及稀释度AntibodyHostDilutionCompanySSBP1rabbitpolyclonal1:1000AbcamGAPDHrabbitpolyclonal1:2000ProteinTech1.1.3主要仪器微型垂直电泳槽(Bio-Rad公司)MiniTrans-Blot微型电泳转移槽(Bio-Rad公司)CO2恒温培养箱(上海精宏公司)MettlerPE-160型电子天平(Mettler)低温高速离心机(ThermoSorvall公司)MultiSKANMK3酶标仪(Thermo公司)动物活体成像仪(BrukerMI)1.1.4培养基及常用溶液配制DMEM高糖培养基(Hyclone)、L15培养基(Sigma)使用前加入常量双抗(Sigma)、10％FBS(Gibco)；ProteinloadingbufferPack(5×Loadingbuffer，20×Reducingagent，Fermentas)；电泳缓冲液(25mMTris-HCl，250mM甘氨酸，0.1％SDS)；1.0MTris-HCl(pH6.8)；1.5MTris-HCl(pH8.8)；10％过硫酸铵；封闭液：0.1MPBS(pH7.4)配制的5％脱脂奶粉或5％BSA；20×转膜缓冲液(48mMTrisbase，39mM甘氨酸，20％甲醇)；丙烯酰胺凝胶配方如下表2所示：表2丙烯酰胺凝胶配方试剂10ml10％分离胶5ml5％浓缩胶胶H2O4.00ml3.40ml30％丙烯酰胺3.30ml0.83mlTris-HCl2.50ml(1.5MpH8.8)0.63ml(1.0MpH6.8)10％SDS0.10ml0.05ml10％过硫酸铵0.10ml0.05mlTEMED4.00μl5.00μl1.2方法1.2.1细胞培养MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-231Bo细胞用含10％胎牛血清(Gibco)、100U/ml青霉素、100μl/ml链霉素的L15培养液(Sigma)培养于37℃、5％CO2和培养箱中。肺癌细胞A549、胃癌细胞SGC-7901、卵巢癌细胞A2780用10％胎牛血清(Gibco)、100U/ml青霉素、100μl/ml链霉素的DMEM培养液(Sigma)。细胞培养排除支原体及真菌污染，所有细胞3个月之后丢弃并重新复苏。1.2.2重组野生型SSBP1表达载体构建以细胞系MDA-MB-231cDNA为模板，设计引物引入BamHI/EcoRI酶切位点，PCR扩增SSBP1的CDS区域，纯化PCR扩增片段并用BamHI/EcoRI酶切，与同样经过BamHI/EcoRI酶切的pCDH载体连接，按照FermentasT4连接酶连接流程操作。引物序列如下：Forward：5’-CCGGAATTCGCCACCATGGACTACAAGGACGATGATGACAAGCTCGATGGAGGAATGTTTCGAAGACCTGTATT-3’Reverse：5’-CGCGGATCCCTACTCCTTCTCTTTCGTCT-3’1.2.3感受态细菌的转化和质粒抽提纯化利用DH5α(Takara)感受态细菌转化，按实验室常规方法操作。所得克隆用质粒小抽试剂盒抽提，酶切鉴定是否插入外源性片段，确定后有插入外源性片段的克隆送上海铂尚生物有限公司送测序。测序正确的克隆制备质粒，方法按照TIANGEN质粒小抽提试剂盒操作说明进行。1.2.4包装病毒本研究中使用慢病毒包装体系，使用三质粒系统：pCDH(过表达携带目的基因载体)或者GV122(携带干扰片段的载体)，psPAX2和pMD2.G(包装质粒)。将生长状态良好的HEK-293T细胞接种至6cm的细胞培养皿中，到第二天约90％以上的融合度，进行转染。转染试剂用PEI，三质粒的用量的摩尔比为1:1:1，总量为8.2μg。将4μg的pCDH/GV122或相应的pcdh-SSBP1/shRNA，3μgpsPAX2和1.2μgpMD2.G与24μlPEI混合，室温放置10min，形成转染复合物；将混合液加入到已接好的HEK-293T细胞中，再加DMEM至总体积3ml；转染8h后换3ml含10％FBS的DMEM，终止转染；换液48h后取培养上清液，0.45μm的滤膜过滤，分装，-70℃冻存备用。1.2.5肿瘤细胞的病毒感染将生长状态良好的肿瘤细胞(包括乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-468、肺癌细胞A549、胃癌细胞SGC-7901和卵巢癌细胞A2780)，接至6cm培养皿，第二天约达到50％的融合度，进行感染。用含10％FBS的L15(或者DMEM)培养基将病毒液1:1稀释，在稀释液中加polybrene至终浓度为8μg/ml；将稀释液加到细胞中，培养8h后换含10％FBS的L15(或DMEM)培养基。相应靶基因转染效率采用Westernblot或者RealtimePCR进一步确定。1.2.6蛋白提取(1)贴壁细胞弃培养基，用预冷PBS清洗细胞两遍并吸净清洗液，将细胞培养皿置于冰上，加上适量蛋白裂解液，用细胞刮刀刮取细胞；(2)吸取裂解液于EP管，4℃冰浴40min，期间置震荡器上震荡数次；(3)14000rpm离心10min后，将上清转移至新EP管；(4)取5μl使用BCA法测定蛋白浓度。(5)剩余蛋白上清添加5×Loadingbuffer和20×DTT，沸水浴10min变性；1.2.7Westernblot(1)分别配制10％聚丙烯酰胺凝胶分离胶、5％浓缩胶；(2)每孔蛋白30μg上样；(3)70V电泳30min到达分离胶界面后改120V电泳继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部；(4)电泳结束后，采用冰浴湿转法将蛋白转移至PVDF膜(Milipore)上，转膜条件：220mA恒流50min；(5)将PVDF膜在PBST(PBSpH＝7.4，0.1％Tween20)中漂洗一次，浸入5％脱脂牛奶封闭液或者BSA封闭液中，室温1h；(6)用一抗稀释液稀释一定浓度的一抗孵育膜4℃过夜；(7)PBST洗膜3次，每次10min；(8)再以脱脂牛奶稀释一定浓度的过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h；(9)PBST洗膜3次，每次10min；(10)等量混合曝光液中的A液和B液，适量滴加于PVDF膜蛋白面，放入成像仪暗室，进行曝光检测。1.2.8细胞迁移、侵袭能力检测实验(1)取对数生长期的乳腺癌细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，将细胞悬浮于空DMEM培养液中备用。(2)细胞浓度至2.5×105个/ml(乳腺癌细胞的迁移实验)或5×105个/ml(乳腺癌细胞的侵袭实验)，取200μL细胞悬液置于上室(迁移实验)或者预置Matrigel的小室上室(侵袭实验)，600μL含20％FBS培养液置于下室，放入细胞培养箱，培养15小时后将小室取出，加入10％多聚甲醛，固定20分钟。后去除固定液，加适量结晶紫染色液染色20分钟，然后小心洗去染色液，置于室温中干燥。最后计数并拍照，每组设三个重复样本。(肺癌细胞A549、胃癌细胞SGC-7901和卵巢癌细胞A2780的侵袭实验选择细胞数1×106/ml取200μL置于上室，其他步骤相同)1.2.9动物实验(1)将5×105/只MDA-MB-231和MDA-MB-231Bo细胞通过尾静脉注射到6-8周龄雌性裸鼠；(2)6周以后，给予每只裸鼠注射150mg/kg底物荧光素，于活体成像系统中进行成像，读取信号值，并做统计分析。1.2.10免疫组化步骤脱蜡水化：60℃烤片过夜，依次置于二甲苯(×3次)、无水乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇中浸泡5min。漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。抗原修复：浸入枸椽酸盐缓冲液，置于微波炉高火加热10min，保温10 min。重复漂洗步骤。消除内源性过氧化物酶活性：3％H2O2孵育30min。重复漂洗步骤。一抗孵育：加入稀释后的抗体，抗SSBP1(1:100)，抗p-SMAD3(1:100)，湿盒内4℃过夜。重复漂洗步骤。二抗孵育：加入鼠抗兔(1:3000)，湿盒内室温孵育1h。重复漂洗步骤。显色：显微镜下监测DAB显色过程3min，终止反应。双蒸水漂洗5min。苏木素复染细胞核1min。双蒸水漂洗5min。脱水封片：梯度酒精脱水，二甲苯透明(×3次)，中性树胶封片。显微镜下观察并记录实验结果。2实验结果2.1SSBP1在乳腺癌高转移潜能细胞中低表达对MDA-MB-231,MDA-MB-231HM,MDA-MB-231Bo三株细胞系抽提线粒体蛋白质，进行iTRAQ定量蛋白质组学分析，筛选差异表达蛋白。SSBP1的表达水平在MDA-MB-231HM，MDA-MB-231Bo中显著下调。附图1为线粒体蛋白SSBP1的iTRAQ质谱结果图；附图2为线粒体蛋白质组学显示SSBP1在MDA-MB-231、MDA-MB-231HM和MDA-MB-231Bo细胞系中差异表达的结果图。随后对三株细胞系线粒体蛋白进行WesternBlot验证，证实了上述差异表达的结果。附图3为Westernblot验证SSBP1在MDA-MB-231、 MDA-MB-231HM和MDA-MB-231Bo这三株细胞系中表达情况的结果图。我们进一步在乳腺癌细胞系中检测SSBP1的mRNA表达水平，结果显示，SSBP1在转移能力较强的基底样细胞系(BT549，MDA-MB-468，MDA-MB-231)中的表达水平显著低于转移能力较弱的Luminal细胞系(MCF-7，T47D，ZR-75-30)。附图4为Real-TimePCR显示SSBP1在乳腺癌细胞系中表达情况的结果图。2.2SSBP1调控肿瘤细胞体外迁移侵袭我们选取了乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468、肺癌细胞A549、胃癌细胞SGC-7901和卵巢癌细胞A2780五株细胞作为干扰SSBP1表达的细胞模型，选取MDA-MB-231Bo作为过表达SSBP1细胞模型。两条独立的shRNA片段干扰效果以及过表达SSBP1效果经WesternBlot或Real-timePCR验证。附图5为Westernblot验证干扰表达SSBP1和过表达SSBP1在乳腺癌细胞中的效果的结果图。附图17为Real-timePCR验证SSBP1在肺癌细胞A549、胃癌细胞SGC-7901和卵巢癌细胞A2780中的干扰效果图。接着我们进行了体外Transwell迁移和侵袭实验。结果显示：在MDA-MB-231和MDA-MB-468迁移和侵袭实验中，相比较shCon组，SSBP1下调细胞的迁移和侵袭能力显著增强。相反地，在MDA-MB-231Bo高转移细胞中过表达SSBP1后，MDA-MB-231Bo体外转移能力明显下降。图6是Transwell验证在MDA-MB-231中干扰SSBP1表达后对侵袭和迁移的影响的结果图，其中，图6-1是实验结果的代表性图片，图6-2是实验结果的柱状统计图；图7是Transwell验证在MDA-MB-468中干扰SSBP1表达后对侵袭和迁移的影响的结果图，其中，图7-1是实验结果的代表性图片，图7-2是实验结果的柱状统计图；图8是实Transwell验证在MDA-MB-231Bo中过表达SSBP1后对侵袭的影响的结果图，其中，图8-1是实验结果的代表性图片，图8-2是实验结果的柱状统计图。图18是Transwell验证在肺癌细胞A549 中干扰SSBP1表达后对侵袭和迁移的影响的结果图；图19是Transwell验证在卵巢癌细胞系A2780中干扰SSBP1表达后对侵袭和迁移的影响的结果图；图20是Transwell验证在胃癌细胞SGC-7901中干扰SSBP1表达后对侵袭和迁移的影响的结果图。2.3SSBP1调控乳腺癌细胞体内迁移侵袭为了进一步明确SSBP1在体内调控乳腺癌细胞转移的能力，我们将MDA-MB-231shCon、MDA-MB-231shSSBP1#1、MDA-MB-231BoCon、MDA-MB-231BoSSBP1四株稳定转染细胞标记Luciference荧光质粒后以5×105细胞浓度给予BALB/c裸小鼠尾静脉注射，6周后进行裸小鼠活体成像。结果发现，SSBP1沉默组小鼠肺部转移灶明显多于对照组，而SSBP1过表达组小鼠的肺部转移灶明显少于对照组。结果说明SSBP1对于乳腺癌细胞体内转移有明显的抑制作用。图13是小鼠活体成像验证干扰表达和过表达SSBP1后体内转移效果的结果图。2.4沉默SSBP1可以激活乳腺癌细胞的TGF-β信号通路我们检测了TGF-β/SMAD信号通路中的重要节点。Real-timePCR和Elisa实验均显示，沉默SSBP1可以促进MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞转录和分泌TGF-β，而过表达SSBP1可以抑制MDA-MB-231Bo细胞分泌TGF-β。图11是Real-timePCR检测SSBP1干扰和过表达后TGF-β的mRNA水平：其中，图11-1是MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞株的实验结果图、图11-2是MDA-MB-231Bo细胞株的实验结果图；图12是ELISA检测SSBP1干扰和过表达后TGF-β的分泌水平：其中，图12-1是MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞株的实验结果图、图12-2是 MDA-MB-231Bo细胞株的实验结果图；同时，通过WesternBlot检测TGF-β信号通路中p-SMAD3、SMAD3、SMAD7和TβR1等重要节点分子的表达情况，图9是WB检测TGF-β信号通路相关分子的结果图；发现SSBP1沉默组细胞分泌TGF-β增加后，SMAD3磷酸化水平明显升高，而TGF-β受体TβR1以及TβR1抑制分子SMAD7都没有明显变化。在MDA-MB-231Bo细胞中过表达SSBP1可以观察到相关分子的相反变化。用TGF-β信号通路抑制剂处理后，能显著抑制SSBP1干扰所产生的生物学效应，图10是TGF-β信号通路抑制剂处理后，逆转SSBP1对转移的影响结果图。2.5SSBP1的表达对乳腺癌患者预后、肿瘤分期、淋巴结转移关系接下来，在临床标本中进一步验证了这一结论。根据SSBP1表达情况，将250例标本分为高表达组和低表达组。Kaplan-Meier分析结果显示：SSBP1低表达患者更容易出现疾病复发，Log-rank检验提示P<0.001；上述结果提示SSBP1可作为乳腺癌患者独立预后因素。进行Spearman相关分析显示：SSBP1的表达与淋巴结转移呈负相关(P＝0.009)。单因素生存分析结果显示：SSBP1的表达(P<0.001)，淋巴结转移状态(P<0.001)以及肿瘤组织学分级(P＝0.038)均是无病生存期的影响因素。应用Cox风险模型对生存资料进行多因素分析，结果显示淋巴结转移阳性(HR＝2.23，P＝0.007)和SSBP1的低表达(HR＝0.385，P＝0.002)是危险因素，SSBP1表达降低，复发风险增加。图14是临床标本中检测SSBP1与患者的生存率的结果图；图15是临床标本中检测SSBP1与患者的肿瘤分期的结果图；图16是临床标本中检测SSBP1与患者的淋巴结转移状态的结果图。本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。当前第1页1 2 3