CD81介导丙型肝炎病毒种属特异性入侵的关键分子特征的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及CD81介导丙型肝炎病毒种属特异性入侵的关键分子特征。

背景技术：

丙型肝炎病毒(HCV)感染是导致慢性肝病的主要原因，自1989年发现至今，HCV在全球范围内已感染1.7亿人次，且由于缺乏疫苗，每年还有约300-400万的新发感染，已成为世界范围内接受肝移植的首要病因。HCV感染的标准治疗方法为聚乙二醇干扰素-α和利巴韦林联合用药，此治疗方法可以引起持续病毒学应答(SVR)。但此方法存在明显的缺陷，例如应答率不足50％，显著的副作用，耐受性差，对晚期疾病治疗无效等。为了更好的治疗HCV感染，直接作用抗病毒药物(DAAs)应运而生。美国食品药品监督管理局(FDA)最近批准了几种蛋白酶抑制剂类DAAs，如Telaprevir(VERTEX),Boceprevir(Merck),Harvoni(Gilead Sciences)和Viekira Pak(AbbVie)。在标准治疗方法中引入此类DAAs使得治疗效果显著改善，对治疗有反应的患者数量明显增加，治疗周期明显缩短。但此类药物价格昂贵，想要利用此方法完全控制HCV传播并不现实，HCV疫苗的研发势在必行。

HCV是单股正链RNA病毒，属黄病毒科，9.6kb的基因组翻译产生全长3011个氨基酸的多聚蛋白，在细胞和病毒蛋白酶的共同作用下，其被切割产生3个结构蛋白(核心蛋白，E1，E2)和7个非结构蛋白(P7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A和NS5B)。

HCV病毒颗粒表面装载着两种表面蛋白E1和E2，二者以异源二聚体的形式存在。病毒入侵过程需要E1/E2异源二聚体与宿主细胞表面受体相互作用。参与HCV入侵过程的细胞表面受体有很多，其中有确切证据表明，糖胺聚糖(GAG)和低密度脂蛋白受体(LDL-R)是病毒颗粒与宿主细胞起始黏附所必须的。此外，还有4个受体确定参与病毒入侵过程，分别是清道夫受体B类1型(SR-B1)，CD81，Claudin-1和Occludin。

细胞表面蛋白CD81参与多种生理过程，例如免疫细胞的黏附，形态，活化，增殖，分化。该分子可以介导多种病原体的入侵，包括寄生虫、细菌、真菌和病毒，其中最受关注的是该分子是HCV入侵必不可少的受体。CD81属于四次跨膜蛋白超家族，哺乳动物的CD81通常是由236个氨基酸组成，主要由四个跨膜区，三个胞内环和两个胞外环串联而成，其中两个胞外环分别是一个小胞外环(SEL)和一个大胞外环(LEL)。CD81分子中大胞外环(LEL)是其发挥功能的重要区域，因为该区域负责与伴侣蛋白结合。据报道，CD81-LEL可以介导自身二聚并且直接结合HCV-E2。

由于HCV感染具有高度严格的宿主特异性，只有人和黑猩猩可支持HCV感染，HCV小动物模型的研发成为了阻滞HCV相关研究，特别是疫苗研发的瓶颈之一。HCV宿主特异性的基础来源于病毒入侵过程的复杂性。CD81直接与HCV-E2相结合，其介导HCV的入侵具有很强的种属特异性，只有人和黑猩猩的CD81以很高的亲和力结合HCV-E2并支持HCV入侵，但其分子机制至今尚不明确。因此解析小鼠和非洲绿猴两种不能支持HCV感染的动物的CD81-LEL的晶体结构，对比发现其与人CD81-LEL晶体结构中存在的差异，将揭示CD81介导HCV入侵种属特异性的分子基础，为感染性动物模型的建立提供筛选的理论依据。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供检测待测动物中CD81-LEL蛋白晶体第188位氨基酸残基与第196位氨基酸残基之间能否形成分子内氢键或盐键的物质的用途。

本发明提供的检测待测动物中CD81-LEL蛋白晶体第188位氨基酸残基与第196位氨基酸残基之间能否形成分子内氢键或盐键的物质在制备辅助检测或辅助预测待测动物是否能被HCV感染的产品中的应用。

上述应用中，所述产品为试剂盒。

上述应用中，所述检测待测动物中CD81-LEL蛋白晶体第188位氨基酸残基与第196位氨基酸残基之间能否形成分子内氢键或盐键的物质包括如下1)和/或2)：

1)、用于蛋白结晶的试剂；

2)、记载XDS package软件的可读载体、记载Phaser软件的可读载体、记载COOT软件的可读载体和记载Phenix软件的可读载体。

上述应用中，

所述待测动物为人或小鼠或非洲绿猴。

本发明另一个目的是提供辅助检测或辅助预测待测动物是否能被HCV感染产品。

本发明提供的产品，为检测待测动物中CD81-LEL蛋白第188位氨基酸残基与第196位之间能否形成分子内氢键或盐键的物质。

上述产品中，

所述检测待测动物中CD81-LEL蛋白第188位氨基酸残基与第196位氨基酸残基之间能否形成分子内氢键或盐键的物质包括如下1)和/或2)：

1)、用于蛋白结晶的试剂；

2)、记载XDS package软件的可读载体、记载Phaser软件的可读载体、记载COOT软件的可读载体和记载Phenix软件的可读载体

上述产品中，

所述待测动物为人或小鼠或非洲绿猴。

本发明第三个目的是提供检测待测动物中CD81-LEL蛋白晶体第188位氨基酸残基与第196位氨基酸残基之间能否形成分子内氢键或盐键的物质的用途。

本发明提供的检测待测动物中CD81-LEL蛋白晶体第188位氨基酸残基与第196位氨基酸残基之间能否形成分子内氢键或盐键的物质在鉴定HCV感染性动物模型中的应用。

本发明第四个目的是提供促进或抑制CD81-LEL蛋白晶体第188位氨基酸残基与第196位氨基酸残基之间形成分子内氢键或盐键的物质的用途。

本发明提供的促进或抑制CD81-LEL蛋白晶体第188位氨基酸残基与第196位氨基酸残基之间形成分子内氢键或盐键的物质在制备HCV感染性动物模型或细胞模型中的应用。

上述应用中，所述促进或抑制CD81-LEL蛋白晶体第188位氨基酸残基与第196位氨基酸残基之间形成分子内氢键或盐键的物质为：使CD81-LEL蛋白晶体第188位氨基酸残基和/或第196位氨基酸残基产生突变的物质。

本发明的实验证明，本发明通过解析不支持HCV感染的小鼠CD81-LEL(mCD81-LEL)和非洲绿猴CD81-LEL(agmCD81-LEL)的三维晶体结构，通过与支持HCV感染的人CD81-LEL(hCD81-LEL)结构对比分析发现：在mCD81-LEL和agmCD81-LEL中分别存在188-196氨基酸残基之间形成了分子内氢键或盐键，而类似的分子内相互作用在hCD81-LEL中是不存在的。综上所述，188-196氨基酸残基之间是否可形成的分子内氢键/盐键为成为判别是否支 持HCV入侵的序列标准之一，可以此特征为依据选择支持HCV入侵的动物模型。可利用此特征辅助HCV疫苗设计。

附图说明

图1为分子筛层析图谱。

图2为mCD81-LEL和agmCD81-LEL溶液的SDS-PAGE电泳图。

图3为mCD81-LEL和agmCD81-LEL的Rikagu衍射结果。

图4为mCD81-LEL和agmCD81-LEL的晶体照片。

图5为mCD81-LEL和hCD81-LEL结构对比图。

图6为agmCD81-LEL和hCD81-LEL结构对比图。

图7为E2-CD81-LEL结合试验。

图8为CD81缺失Huh7.5.1细胞功能检测

图9为HCVpp感染试验结果。

图10为HCVcc感染试验结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

小鼠CD81大胞外环又称mCD81-LEL，其氨基酸序列如序列表的序列1自N末端第113至202位氨基酸残基所示；mCD81-LEL蛋白的编码基因，又称mCD81-LEL基因，其核苷酸序列如序列表的序列2自5’末端第229至608位核苷酸所示；

非洲绿猴CD81大胞外环又称agmCD81-LEL，氨基酸序列如序列表的序列3自N末端第113至202位氨基酸残基所示；agmCD81-LEL蛋白的编码基因，又称agmCD81-LEL基因，其核苷酸序列如序列表的序列4自5’末端第229至608位核苷酸所示。

质粒pET-28a(+)：Novagen:69864-3。大肠杆菌Rosseta：Novagen:71402-4。

实施例1、小鼠CD81大胞外和非洲绿猴CD81大胞外环的蛋白结构差异

(一)mCD81-LEL和agmCD81-LEL蛋白的制备

一、重组质粒的构建

将序列表的序列2自5’末端第229至608位核苷酸所示的双链DNA分子插入质粒pET-28a(+)的Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点之间，得到重组质粒pET28a-mCD81-LEL；

将序列表的序列4自5’末端第229至608位核苷酸所示的双链DNA分子插入质粒pET-28a(+)的Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点之间，得到重组质粒pET28a-agmCD81-LEL。

二、mCD81-LEL和agmCD81-LEL蛋白的制备

1、将步骤一得到的重组质粒pET28a-mCD81-LEL和pET28a-agmCD81-LEL导入大肠杆菌Rosseta的感受态细胞，得到重组菌。

2、将步骤1得到的重组菌的单克隆接种至20ml含50mg/L卡那霉素和50mg/L氯霉素的LB液体培养基，37℃、220rpm振荡培养过夜。

3、取20ml步骤2得到的菌液，以1：50的体积比接种至1L含50mg/L卡那霉素和50mg/L氯霉素的LB液体培养基，37℃、200rpm培养至OD600nm＝1.2后放置冰上；冰上放置半小时后加入IPTG并使其浓度为0.5mmol/L，37℃、200rpm振荡培养5小时。

4、取完成步骤3的培养体系，4000rpm离心15min，收集菌体，用100ml裂解液(溶剂为pH8.5、50mM的Tris-HCl缓冲液，含100mM NaCl)重悬，然后在冰上进行超声波破碎(功率600W，作用5s，间隔5s，99次)，然后15000rpm离心30min，取沉淀即包涵体进行变性复性。

5、包涵体加150mL变性液(8M Urea,100mM NaH2PO4,10mM Tris-HCl pH8.5)溶解，搅拌至完全溶解，4℃，12000rpm，30min离心后取上清，倒入透析袋中浸入1L变性液中，向其中滴加2L透析液(50mM Tris-HCl pH 8.5,100mM NaCl)，滴加完成后铜洗液中尿素终浓度位2.67M；次日倒出2L再加入2L透析液，此时尿素终浓度为0.89M，次日全部倒出向其中加入2L透析液，此时尿素终浓度为0M，经梯度透析复性后得到可溶性的mCD81-LEL和agmCD81-LEL蛋白,12000rm，30min离心后取上清。

6、将步骤5得到的上清上样于镍柱，先用10倍柱体积的除杂液(溶剂为水，含100mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH8.5)洗脱以去除杂蛋白，再用洗脱液(溶剂为水，含100mM NaCl，50mM Tris-HCl，300mM咪唑，pH8.5)洗脱以收集目的蛋白，取过柱后的洗脱液。

7、将步骤6得到的镍柱洗脱液加50μL Thrombin，倒入透析袋中透析切除N-端6×His tag，透析液为50mM Tris-HCl pH8.5,100mM NaCl。透析过夜后将溶液自透析袋中倒出，4℃，4000rpm，30min离心除去可能存在的沉淀。

8、取步骤7得到的溶液，采用截留分子量为3KD的超滤浓缩管进行超滤浓缩，得到1ml左右的浓缩液。

9、将步骤8得到的浓缩液上样并进行分子筛层析。

分子筛层析采用选用Suerdex75 10/300柱子进行进一步分离纯化，洗脱液：50mM Tris-HCl pH 8.5，100mM NaCl。流速为0.5ml/min，收集保留体积为12mL-16mL之间的过柱后洗脱液(图1)。

10、取步骤9得到的过柱后溶液，采用截留分子量为3KD的超滤浓缩管进行超滤浓缩，得到约1mL的溶液(蛋白浓度约为30mg/ml)，将其分别命名为mCD81-LEL(10KD，图2a)和agmCD81-LEL蛋白(10KD，图2b)。

采用同样的方法，制备hCD81-LEL(10KD)。

(二)、mCD81-LEL和agmCD81-LEL蛋白的晶体解析

取(一)获得的mCD81-LEL蛋白溶液(溶剂为50mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH 8.5的缓冲溶液)与结晶缓冲液(0.1M Sodium Citrate pH5.5,5％PEG1000,35％isopropano))按照体积比为1:1混匀，在22℃下结晶3天获得mCD81-LEL晶体，并解析得到结构。

取(一)获得的agmCD81-LEL蛋白溶液(溶剂为50mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH 8.5的缓冲溶液)与结晶缓冲液(5％Ethanol,5％MPD,0.1M Tris pH8.5,200mM Sodium Chloride)按照体积比为1:1混匀，在22℃下结晶2天获得agmCD81-LEL晶体，并解析得到结构。

取(一)获得的hCD81-LEL蛋白溶液(溶剂为50mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH 8.5的缓冲溶液)与结晶缓冲液(0.2M Magnesium acetate,20％PEG3350)按照体积比为1:1混匀，在22℃下结晶2天获得hCD81-LEL晶体，并解析得到结构。

mCD81-LEL晶体和agmCD81-LEL晶体分别在瑞士同步辐射(SLS)X06DA线站和本实验室家用RigakuX射线衍射仪上收集。对数据进行初步的处理与整合(XDS package)后，通过分子置换(Phaser,CCP4package)的方法解析结构生成电子云密度图，经过逐步的精 修和优化(COOT和Phenix)得到最终的结构。

mCD81-LEL晶体和agmCD81-LEL晶体的衍射结果见图3(左图为小鼠CD81-LEL晶体衍射结果；右图为非洲绿猴CD81-LEL晶体衍射结果)和表1。晶体结构照片见图4(左图为小鼠CD81-LEL晶体；右图为非洲绿猴CD81-LEL晶体)。

表1为晶体数据

将mCD81-LEL晶体和agmCD81-LEL晶体通过X射线衍射后收集数据，对数据进行初步的处理与整合(XDS package)后，通过分子置换(Phaser,CCP4package)的方法解析结构生成电子云密度图，经过逐步的精修和优化(COOT和Phenix)得到最终的结构，分析晶体中氢键或盐键。以hCD81-LEL晶体为对照。

mCD81-LEL晶体检测结果如图5，左图为mCD81-LEL晶体结构的电子云密度图局部，右图为mCD81-LEL晶体和hCD81-LEL晶体结构对比，金色为小鼠，蓝色为人；

agmCD81-LEL晶体检测结果如图6所示，右图为agmCD81-LEL晶体结构的电子云密度图局部，左图为agmCD81-LEL晶体和hCD81-LEL晶体结构对比，绿色为非洲绿猴，蓝色为人。可以看出，

CD81-LEL是直接介导与HCV-E2结合的Loop，从小鼠到人CD81-LEL的氨基酸序列是高度保守的，但只有人和大猩猩的CD81可以以纳摩尔级亲和力结合HCV-E2并且介导HCV入侵。通过多序列比对分析发现，CD81-LEL的序列在人和大猩猩中是完全相同的，而在人、非洲绿猴和小鼠中存在着细微的差别(81％-96％的序列同源性)，其中agmCD81-LEL和hCD81-LEL之间只有四个氨基酸残基的差别(残基163,186,188和196)，把CD81与HCV的E2结合决定性因素的识别范围限制在此四个氨基酸残基内。基于结构的序列分析发现，此四个氨基酸残基所处的区域是最不保守的，其中已知的是F186对于直接结合E2至关重要，而其他残基的贡献尚不明确。CD81-LEL的多序列比结果显示，能够介导HCV入侵的CD81的188位残基一般是带负电的，而在不能介导HCV入侵的CD81中188位氨基酸残基往往是电中性的或者是带正电的。

hCD81-LEL和mCD81-LEL的晶体经X射线衍射都得到了高分辨率的数据，最终的模型都表现出了良好的立体化学性质。mCD81-LEL结构的整体构象与hCD81-LEL类似，都是由5个α-螺旋组成的“蘑菇型”结构。hCD81-LEL和mCD81-LEL的结构重叠叠加得出的r.m.s.d值为87Cα原子。在高分辨率结构信息的支持下，在原子水平对结构细节进行分析发现，在mCD81-LEL的Q188和E196之间存在一个分子内氢键(Q188Nε2-H:E196 Oε2,distance:angle:124)。值得注意的是，此氢键在hCD81-LEL中是不存在的，在hCD81-LEL中对应位置的E188和D196都是带负电的，其侧链由于静电排斥的作用而相距甚远。两个残基之间最近的距离为E188 Oε2:D196 Oδ2,

从序列中可以看出在agmCD81-LEL中，188位是一个带正电的赖氨酸，理论上可以和D196之间形成盐键，agmCD81-LEL的晶体X射线衍射分辨率达到了其结构显示残基K188和残基D196之间形成了盐键，但该键强度较弱，可能是由于D196的侧链长度不够造成的。

上述实验表明，

人CD81-LEL的188位的谷氨酸和196位的天冬氨酸之间即不存在氢键也不存在盐键，

mCD81-LEL的188位的谷氨酰胺和196位的谷氨酸之间存在一个分子内氢键，agmCD81-LEL的188位的赖氨酸和196位的天冬氨酸之间形成盐键。

目前公知人可以感染HCV，小鼠和非洲绿猴不可以感染HCV，比较三个CD81-LEL的差别，得出可以根据检测待测动物的CD81-LEL蛋白晶体结构，其188和196氨基酸残基之间能否形成分子内氢键或盐键可以预测待测动物是否为能被HCV感染，若待测动物的CD81-LEL的第188位氨基酸残基和第196位氨基酸残基之间不能形成分子内氢键或盐键，则待测动物能或候选能被HCV感染；

若待测动物的CD81-LEL的第188位氨基酸残基和第196位氨基酸残基之间能形成分子内氢键或盐键，则待测动物不能或候选不能被HCV感染。

人的CD81-LEL蛋白第188位氨基酸残基与第196位氨基酸残基之间不能形成分子内氢键也不能形成盐键，人能被HCV感染；人的CD81-LEL蛋白第188位氨基酸残基为谷氨酸，且第196位氨基酸残基为天冬氨酸；

小鼠的CD81-LEL蛋白第188位氨基酸残基与第196位氨基酸残基之间形成的分子内氢键，小鼠不能被HCV感染；小鼠CD81-LEL蛋白第188位氨基酸残基为谷氨酰胺，且第196位氨基酸残基为谷氨酸；

非洲绿猴的CD81-LEL蛋白第188位氨基酸残基与第196位氨基酸残基之间形成的分子内盐键，非洲绿猴不能被HCV感染；非洲绿猴的CD81-LEL蛋白第188位氨基酸残基为赖氨酸，且第196位氨基酸残基为天冬氨酸。

辅助预测或辅助检测待测动物是否为能被HCV感染的试剂盒包括将用于检测待测动物的CD81-LEL第188位氨基酸残基与第196位氨基酸残基之间能否形成分子内氢键或盐键的物质，物质包括结晶缓冲液、记载XDS package软件的可读载体、记载Phaser软件的可读载体、记载COOT软件的可读载体和记载Phenix软件的可读载体。

实施例2、辅助预测或辅助检测待测动物是否为能被HCV感染

一、蛋白的制备

采用实施例1的方法，制备人CD81-LEL蛋白(hCD81-LEL，氨基酸序列为序列5)、小鼠CD81-LEL蛋白和非洲绿猴CD81-LEL蛋白。

二、蛋白结晶

按照实施例1的方法结晶，得到人CD81-LEL蛋白晶体、小鼠CD81-LEL蛋白晶体和非洲绿猴CD81-LEL蛋白晶体。

三、检测蛋白晶体中的氢键或盐键

采用实施例1的方法，用XDS package，Phaser,COOT和Phenix软件分析人CD81-LEL蛋白晶体、小鼠CD81-LEL蛋白晶体和非洲绿猴CD81-LEL蛋白晶体，检测上述人CD81-LEL蛋白晶体、小鼠CD81-LEL蛋白晶体和非洲绿猴CD81-LEL蛋白晶体中的第188位氨基酸残基和第196位氨基酸残基之间是否形成氢键或盐键。

结果：

人CD81-LEL蛋白晶体第188位氨基酸残基和第196位氨基酸残基之间没有形成氢键或盐键，预测人能被HCV感染；

小鼠CD81-LEL蛋白晶体第188位氨基酸残基和第196位氨基酸残基之间没有形成氢键，预测小鼠不能被HCV感染；

非洲绿猴CD81-LEL蛋白晶体第188位氨基酸残基和第196位氨基酸残基之间没有形成盐键，预测非洲绿猴不能被HCV感染。

这与已知人可以被HCV感染，而小鼠和非洲绿猴不能被HCV感染一致，说明本发明的方法正确。

实施例3、CD81-LEL蛋白晶体188-196氨基酸残基之间是否形成氢键去检测是否被HCV感染的验证

一、结合试验

为研究CD81-LEL中188-196残基之间分子内键和HCV-E2结合亲和性的之间的关系，根据结构设计突变原核表达CD81-LEL及一系列突变体，利用酶联免疫吸附(ELISA)的方法检测其与重组可溶性HCV-E2之间的结合能力。

针对人CD81-LEL蛋白晶体，则第188位为谷氨酸且196位为天冬氨酸，不能形成氢键或盐键，如果突变为其他，则可能形成氢键或盐键；

针对小鼠CD81-LEL蛋白晶体，则第188位为谷氨酰胺且196位为谷氨酸，能形成氢键，如果突变为其他，则不形成氢键；

针对非洲绿猴CD81-LEL蛋白，则第188位为赖氨酸且196位为天冬氨酸，能形成盐键，如果突变为其他，则不形成盐键；

下述CD81-LEL及其突变体分别为：hCD81-LEL(hCD81-WT，氨基酸序列为序列5)、hCD81-LEL-E188K(为将序列5第196位谷氨酸突变为赖氨酸)、hCD81-LEL-D196E(为将序列5第196位天冬氨酸突变为谷氨酸)、hCD81-LEL-D196Q(为将序列5第196位天冬氨酸突变为谷氨酰胺)、hCD81-LEL-D196K(为将序列5第196位天冬氨酸突变为赖氨酸)、hCD81-LEL-D196R(为将序列5第196位天冬氨酸突变为精氨酸)、hCD81-LEL-D196E(为将序列5第196位天冬氨酸突变为谷氨酸)、hCD81-LEL-D196E-E188K(为将序列5第196位天冬氨酸突变为谷氨酸，且将第188位谷氨酸突变为赖氨酸)、mCD81-LEL(mCD81-WT)、mCD81-LEL-L186F(为将序列1第186位亮氨酸突变为苯丙氨酸)、mCD81-LEL-L186F-Q188E(为将序列1第186位亮氨酸突变为苯丙氨酸，第188位谷氨酰胺突变为谷氨酸)、mCD81-LEL-L186F-E196D(为将序列1第186位亮氨酸突变为苯丙氨酸，第196位谷氨酸突变为天冬氨酸)、mCD81-LEL-L186F-Q188A(为将序列1第186位亮氨酸突变为苯丙氨酸，第188位谷氨酰胺突变为丙氨酸)、mCD81-LEL-L186F-Q188E E196D(为将序列1第186位亮氨酸突变为苯丙氨酸，第188位谷氨酰胺突变为谷氨酸，第196位谷氨酸突变为天冬氨酸)、agmCD81-LEL(agmCD81-WT)、agmCD81-LEL–L186F(为将序列3第186位亮氨酸突变为苯丙氨酸)、agmCD81-LEL–L186F-K188A(为将序列3第186位亮氨酸突变为苯丙氨酸，188位赖氨酸突变为丙氨酸)、agmCD81-LEL–L186F-E196D(为将序列3第186位亮氨酸突变为苯丙氨酸，196位谷氨酸突变为天冬氨酸)、agmCD81-LEL–L186F-K188E-E196D(为将序列3第186位亮氨酸突变为苯丙氨酸，188位赖氨酸突变为谷氨酸196位谷氨酸突变为天冬氨酸)。

具体实验操作如下：

本试验中CD81-LEL及其突变体作为捕获抗体固定在板子上(1μg/well)，用包被缓冲液(PBS,137mM NaCl,8.1mM Na₂HPO₄,1.5mM KH₂PO₄,2.7mM KCl,pH 7.4)将蛋白稀释至10μg/mL，每孔中加100μL，封板后4℃过夜。每孔中加250μL封闭液(5％non-fat miLk in PBST)室温孵育2h后，用PBST溶液(0.05％Tween-20)洗板一次。把重组可溶性E2蛋白(序列6)稀释至500ng/mL加入到孔内，室温孵育2h后，用PBST溶液(0.05％Tween-20)洗板3次。加入E2抗体(0.5μg/mL,100μL/weLL)室温孵育2h。再次用PBST溶液(0.05％Tween-20)洗板3次后，在孔中加入HRP标记的二抗，室温孵育1h。使用TMB(SoLarbio science&technology co.,LTD)作为底物进行检测，所有试验平行重复3次。

结果如图7所示，在所有CD81-LEL的野生型和突变体中，hCD81-LEL与E2具有最高的结合亲和力，而mCD81-LEL和agmCD81-LEL与E2的结合亲和力几乎检测不到。如hCD81-LEL-D196E为在hCD81-LEL中进行D196E的保守突变，188-196残基之间不能形成氢键或者盐键，则该突变对其与E2的结合亲和力几乎没有任何影响。hCD81-LEL-E188K的单点突变使得188位电性翻转，突变体中K188-D196之间可以形成微弱的盐键(K-D的配对是被agmCD81b-LEL的结构所启发)，该突变体与E2得结合亲和力下降大约20％。而hCD81-LEL-D196E-E188K的双点突变中，196位的D突变成E延伸了侧链长度，并同时保持E188K的突变的电性翻转，促使188-196位点之间可以形成稳定K-E配对型盐键，该突变体与E2的结合亲和力下降了约80％，类似于不能介导HCV入侵的CD81-LEL。结果数据显示K-D配对的盐键由于侧链长度不足，形成的盐键不够稳定，不能对螺旋-D的构象构象灵活性产生足够的束缚作用，所以与E2仍有一定的结合力。与之相比，K-E配对型的盐键足够稳定，可以对螺旋-D的构象灵活性产生强有力的束缚作用，所以其与E2的结合亲和力显著下降。正如预期所料，D196K和D196R此类196位发生电性翻转的突变体，其与E2的结合亲和力都显著降低，此结果证实188-196位点之间K-E和E-R配对都足够形成稳定的盐键，对螺旋-D的构象灵活性产生束缚作用从而削弱其与E2的结合亲和力。

同时，mCD81-LEL-D196Q的突变可以促使Q196-E188之间形成氢键，该突变体与mCD81-LEL结构中观察到了Q188-E196配对的氢键方向相反，结果也证明该突变导致了其与E2结合能力的显著下降。

设计的hCD81-LEL-D196E-E188K突变体，等同于在hCD81-LEL中引入了和mCD81-LEL中Q188-E196配对相同的分子内氢键，该突变体与E2的结合亲和力下降到了背景的水平，尽管此时F186仍然是存在的。

结果证实诱导hCD81-LEL 188-196位间形成氢键或者盐键，会削弱其与E2的结合亲和力；接下来设计了mCD81-LEL和agmCD81-LEL的不同突变体，破坏其分子内天然存在的188-196间氢键或盐键，分析是否可以增强其与HCV-E2的结合能力。之前有研究报道，F186位点对于其与E2的结合至关重要，首先对L186F单点突变的贡献进行研究，结果显示L186F的单点突变后其与HCV-E2的结合能力并无明显增强。接下来，在保持L186F突变的同时，在mCD81-LEL引入了Q188E，Q188A，E196D，Q188E/E196D(一个类似hCD81的188-196氨基酸的组合)的不同突变，扰乱188-196之间的化学键，结果显示与L186F单点突变和野生型mCD81-LEL相比，这些突变体与E2的结合亲和力有了提高。在agmCD81-LEL中引入K188A或者K188E的单点突变破坏188-196之间的化学键，同样观察到了类似的结果，与 L186F单点突变体和野生型agmCD81-LEL相比，其与E2的结合亲和力有了改善。在agmCD81-LEL中引入E196D的突变的设计是通过缩短羧基侧链来削弱K188-D196之间盐键，该突变改善了其E2的结合，再次证明了K-D配对型盐键不够稳定，不能对螺旋-D的构象灵活性产生足够的束缚作用，并削弱其与E2的结合能力。

上述结果表明，在CD81-LEL的第188和196位氨基酸之间没有形成氢键或盐键可以结合HCVE2蛋白，如果形成氢键或盐键，则不能结合HCVE2蛋白。

二、病毒入侵试验

上述结合实验进一步证明，在CD81-LEL中发现的188-196分子内键影响其与HCV-E2的结合能力，但尚未可知在生理条件下该分子内键是否影响CD81介导HCV入侵的功能，利用病毒入侵试验对其进行深入研究。

1、构建CD81缺陷型Huh7.5.1细胞系

进行病毒入侵试验之前，首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了CD81缺陷型的Huh7.5.1细胞系(Huh7.5.1^CD81-)。

具体如下：

为减少脱靶效应，本试验设计两条sgRNA，序列如下CD81-sgRNA1-F:CAC CGG CGC CCA ACA CCT TCT ATG T；CD81-sgRNA1-R:AAA CAC ATA GAA GGT GTT GGG CGC C；CD81-sgRNA2-F:CAC CGC ATG ATG TTC GTT GGC TTC C；CD81-sgRNA2-R:AAA CGG AAG CCA ACG AAC ATC ATG C。首先将sgRNA构建到线性化好的lentiCRSPER(addgene，49535)载体上。转染前18～24小时用含10％FBS的培养基在10cm平皿内接种培养293T细胞，37℃，CO₂(5％)恒温培养过夜，次日细胞密度达到80％为适。18～24小时后使用TransMAXi转染试剂(北京北方健特生物科技有限公司)共转染构建的重组载体与pVSVg(addgene，8454)质粒和psPAX2(addgenen，12260)质粒，在293T细胞中包装过表达sgRNA的慢病毒。48～72小时后收集上清，离心，分装。-70℃冰箱保存，备用。

sgRNA的慢病毒感染Huh7.5.1细胞(由Dr.Francis Chisari惠赠，记载在如下文献中，Zhong J,et al.Proc Natl Acad Sci U S A 2005；102:9294-9299.)，感染48h后，将Huh7.5.1细胞进行传代，在含10％胎牛血清和1μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养液中培养。两周后，分离得到稳定的细胞克隆Huh7.5.1^CD81-。

利用Trizol试剂收取部分细胞，提取细胞总RNA，以总RNA为模板，使用QuantiFast SYBR Green荧光实时定量RT-PCR试剂盒(购于TakaRa公司)对细胞内宿主基因CD81的mRNA水平进行定量测定。此外，用HCVcc感染Huh7.5.1^CD81-细胞，感染48h后对HCV病毒基因组的RNA水平进行绝对定量检测。本系统中反转录和PCR都在同一个反应体系中完成，反应体系包括(20uL)：上下游引物(10uM)各0.6uL，RNA模板1uL，酶混合物(RNA反转录酶和DNA聚合酶)0.2ul，2xQuantiFastSYBR GreenRT-PCRMaster Mix 10uL，RNA-free水7.6ul。反应条件为50℃，10min；95℃，5min；40次循环反应，循环条件为95℃，10s，60℃，30s；溶解曲线65～95℃连续。

RT-PCR引物序列：

CD81：上游5′-TGTTCTTGAGCACTGAGGTGGTC-3′

下游5′-TGGTGGATGATGACGCCAAC-3′；

HCV 5’UTR：上游5′-GTCTAGCCATGGCGTTAGTA-3′

下游5′-CTCCCGGGGCACTCGCAAGC-3′

结果如图8所示，(a)构建Huh7.5.1^CD81-的原理是使用慢病毒介导的CRISPR/Cas9系统。(b)使用qRT-PCR分别检测和CD81缺陷型Huh7.5.1细胞中内源性CD81RNA的水平；(c)使用基因型H77的包膜蛋白包被的HCVpp分别感染和CD81缺陷型Huh7.5.1细胞，用荧光酶素基因报告系统进行定量；(d)使用HCVcc分别感染和CD81缺陷型Huh7.5.1细胞，分别使用qRT-PCR(d)和In-Cell Western assay(e)的方法对细胞内HCV基因组RNA的拷贝数和感染灶的数量进行定量，与缺失前的naive Huh7.5.1细胞相比，在Huh7.5.1CD81-细胞中几乎检测不到内源性CD81的mRNA。此外，当Huh7.5.1细胞被HCVcc感染的时候，细胞内HCV的RNA的水平明显下降了。以上结果表明Huh7.5.1^CD81-细胞可以作为一种很好的模型来研究病毒感染时CD81在环境中的功能。

2、扩增HCVpp和HCVcc病毒颗粒

1)假病毒的制备

转染前18～24小时在10cm平皿内接种培养293T细胞，37℃，CO2(5％)恒温培养过夜，18～24小时后用TransMAXi转染试剂分别共转染等量PNL4-3.Luc.R-E-(由Dr.F.Cosset惠赠，Bartosch B，et al.J Exp Med 2003；197:633-642.)和空载体、等量PNL4-3.Luc.R-E-和PCMV-E1E2(由Dr.Linqi Zhang惠赠McKeating JA，et al.J Virol2004；78:8496-8505)及等量PNL4-3.Luc.R-E.-和VSV-G，分别产生Env-PP、HCV假病毒颗粒HCVpp及VSV-G假型慢病毒VSVpp。48～72小时后收集上清，离心，分装。-70℃冰箱保存，备用。可在其中加入4～8μg/ml的聚凝胺以保持病毒活力。

2)JFH1HCVcc的制备

用实验室原有的JFH1HCVcc(J Virol.2008Jul；82(14):7034-46.doi:10.1128/JVI.00118-08.Epub 2008May 14.Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles.Steinmann E1,Brohm C,Kallis S,Bartenschlager R,Pietschmann T.)感染Huh7.5.1细胞，通过不断地传代培养，收集含有病毒颗粒的细胞上清。一般隔2天后收集1次细胞培养上清。对收集的上清首先进行450×g离心5分钟，以去掉其中的细胞碎片等沉淀物，然后5ml/15ml离心管分装，-80℃冻存备用。

3、HCVpp感染试验

为了降低转染效率和蛋白表达水平对试验的影响，使用免疫印记(Western Blotting)对外源CD81野生型及突变体重组质粒的表达进行定量。

将上述二中的CD81及其突变体编码基因分别插入pcDNA3.1-myc(Invitrogen)表达载体的BamHI和XhoI位点，得到不同的表达不同蛋白的重组载体。

将不同的表达不同蛋白的重组载体分别转入Huh7.5.1^CD81-，得到转染不同CD81的转基因细胞。

转染不同CD81的转基因细胞使用添加了蛋白酶抑制剂(Sigma or Pierce)的裂解液(50mMTris-HCl,pH7.5,150mM NaCl,1％Nonidet P40,50mM NaF,1mM Na₃VO₄,5mMβ-glycerophosphate,1mM dithiothreitol,1mM phenylmethylsulfonyL fluoride)在冰上裂解后，14,000×g 20min离心。样品加入2×SDS上样缓冲液(Loading buffer)后煮沸处理，使用9-12％SDS-PAGE胶进行电泳。之后，将分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜上(Bio-Rad,Hercules,CA)，10％牛奶封闭1h，4℃孵育一抗过夜。二抗使用的时 1:2000稀释的HRP标签的anti-IgG抗体。ECL试剂(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)作为检测底物。实验结果表明CD81野生型和所有突变体的表达量水平相当。

转染不同CD81的转基因细胞在转染24h后，每孔中加入200μL包含HCVpp，VSV-Gpp或者bald virus的上清，8μg/mL聚凝胺和2μL 2M HEPES(pH 7.55)，在台式离心机中旋转感染1.5h(2500rpm,30CeLsius degree)，再在二氧化碳培养箱中孵育1.5h。旋转感染后48h，裂解细胞，使用ModuLus MicropLate Luminometer(Turner BioSystems,Sunnyvale,CA,USA)对荧光酶素检测系统(Luciferase Assay System，Promega,Madison)进行检测。所有的试验重复三次。通常计数范围为10,000-900,000，而bald virus感染的作为背景的信号通常低于100。所有试验重复三次。

结果如图9所示，a为HCVpp入侵试验结果，b为western－blot试验结果，HCVpp感染试验与ELISA检测的HCV-E2结合试验结果相同。在hCD81中引入D196E保守突变，HCVpp的入侵效率几乎没有任何损失；而如果在hCD81中引入D196Q，D196K，D196R，E188Q/D196E和E188K/D196E这些利于形成188-196间化学键(氢键或者盐键)的突变，则会引起HCVpp入侵效率的显著下降。E188K的突变可以促使188-196间形成一个较弱的K-D型盐键，此键对HCVpp入侵效率影响基本可以忽略。在破坏188-196间分子内键增加mCD81或agmCD81介导HCVpp入侵的效率之前，先评估了L186F单点突变的影响，如图所示，在mCD81和agmCD81中引入L186F的单点突变，HCVpp的入侵效率会有轻微的升高。如果保留L186F的同时，在mCD81中引入了其他的突变Q188E，Q188A，E196D，和Q188E/E196D来破坏188-196之间的化学键，与天然的mCD81和L186F单点突变相比HCVpp的入侵效率有了明显的提升。在agmCD81中得到了类似的结果，保留L186F突变的同时引入K188A，K188E和K188E/E196D的突变破坏188-196分子内键，使得HCVpp的入侵效率有了显著的提高。在agmCD81中引入E196D的突变，可以促使188-196之间形成K-D型弱盐键，其作用等同于削弱188-196之间分子内键，故也可以提高HCVpp的入侵效率。

可以看出，CD81-LEL的第188和196位氨基酸之间无法形成氢键或盐键可以提高HCVpp的入侵效率，如果形成氢键或盐键，则HCVpp不能入侵。

4、HCVcc感染试验

使用JFH1 HCVcc和In-CeLL Western(ICW)的方法检测表达不同CD81的Huh7.5.1CD81-中HCVcc的感染效率。将Huh7.5.1CD81-细胞以1×104密度接种于96孔板中，次日在细胞中转染CD81野生型及突变变表达质粒(将人、小鼠和非洲绿猴CD81全长基因及其突变体基因插入到pcDNA3.1-myc载体(Invitrogen)的BamHI和XhoI酶切位点中得到的质粒)。

24h后，使用HCVcc(MOI＝0.01)对细胞进行感染。感染72h后，加入免疫染色的抗-HCV核心蛋白的抗体(1:400稀释)和IRDye二抗(1:1000稀释,Li-Cor,Nebraska,USA)，之后使用多聚甲醛将细胞固定的在原始孔中，使用Triton X-100渗透。最终通过Odyssey Infrared Imaging System(Li-Cor,Lincoln,NE,USA)获得数据图片。Huh7.5.1^CD81-细胞的免疫染色使用抗HCV核心蛋白的抗体，使用Leica SPW5共聚焦显微镜获得数据图片使用DAPI进行核酸染色。

结果如图10所示，a为HCVcc入侵试验结果，b为HCVcc入侵的免疫荧光共聚焦显微镜显示模式，试验结果与E2结合试验和HCVpp入侵效率试验的结果基本一致。简而言之，在hCD81中引入不能诱导188-196之间成键的D196E突变和能促使形成K-D弱盐键的E188K 突变对HCVcc入侵影响很小，而可以诱导188-196间形成稳定盐键的E188K/D196E突变会导致HCVcc入侵明显降低。在mCD81和agmCD81中引入L186F单点突变后HCVcc入侵无明显增高。在mCD81和agmCD81中，保持L186F的突变，再分别额外引入破坏或者减弱188-196之间氢键的突变，与L186F单点突变和野生型CD81相比这些突变体使得HCVcc的入侵显著提高。使用免疫荧光(immunefluorescent)给HCV核心蛋白着色并使用共聚焦成像(confocal imaging)检测，也得到了类似的结果。

上述均证明，待测动物的CD81-LEL的188-196氨基酸残基之间形成分子内氢键/盐键可以判断该待测动物能被HCV感染。