使用表面增强拉曼光谱的分析方法及用于所述方法的组合物与流程
本发明涉及分析组合物的方法。更特别地，本发明涉及确定物质中存在或不存在化合物，特别是存在或不存在出于鉴别的目的已添加至物质的标签剂化合物。在特别的形式中，本发明涉及定量或半定量分析组合物，特别是用于确定物质中的化合物的量，目的在于鉴别所述物质和评价物质从其原始组成发生改变的可能性。
许多化合物作为用于液体和固体物质的标示物或标签剂的用途是公知的。已将荧光染料用于许多应用，将经标示的物质的样品的荧光特性用于确定物质中的标签剂的存在和浓度。其它已知的标签剂包括生物化合物，特别是dna和寡核苷酸以及磷光体。这些标签剂的典型应用是在标记液体如烃燃料方面，从而在供应链中的后续的点鉴别所述液体。这可以由于操作原因，例如以协助区分一个等级的燃料与另一燃料，或出于其它原因，尤其是为了保证燃料质量，阻止和检测掺假，和为了提供核查正确纳税的手段而完成。除燃料以外，可以标记许多其它产品如药品、农业化学品、化妆品、例如香水，以鉴别在特定来源生产的产品，其可以被认证为特定标准或作为原始的高价值产品的品牌或出于其它目的。
提供难以由未经授权的人员复制而由授权的人员可容易鉴别和量化的标签剂的问题已经以许多方式得以解决。一些现有方法包括借助于萃取至极性液体中或固体吸收剂上从液体中分离标示物化合物。例如，us5,358,873描述并要求保护通过用罗丹明染料标记，然后在包含少量未结合的快速色谱级二氧化硅的小瓶中振摇可疑燃料的小的样品来检测汽油掺假的方法。可疑的样品中的罗丹明标示物染料的存在将所述二氧化硅着色成红色。us4,659,676、us2,392,620和us4,735,631描述了用于燃料标记和分析的其它方法。
已描述dna用作许多产品的标签剂，然而定量检测核酸，例如使用杂交或定量pcr方法对于支持将其用作其中要求通过标签剂浓度方面的相对小的差异的检测来检测稀释或掺假的产品的标示物而言并非足够再现的。
sers(表面增强拉曼光谱)是一种分析方法，其中某些金属的表面增强了吸附至这样的表面上或位于靠近这样的表面附近的化合物的拉曼光谱。所述效应有时被称为等离激元效应并且所述表面可以被称为等离激元表面。公知的等离激元材料包括金、银和铜。在它们的拉曼信号方面显示出这样的增强的化合物被称为“sers活性”化合物。可以将拉曼光谱的增强在sers活性化合物以不可通过其它方法(例如非增强拉曼光谱法)检测的浓度存在时用于检测所述化合物。当sers活性化合物接近多于一个表面时，等离激元效应增加。出于该原因，等离激元表面倾向于具有粗糙或有规律的轮廓。替代性地，当使用等离激元材料的胶体纳米颗粒进行sers时，等离激元效应和因此的sers增强通过胶体颗粒的聚集而增强，从而使得sers活性化合物的分子可以受益于接近两个或更多个颗粒。当在本说明书中提及sers时，意在包括表面增强光谱(ses)的其它形式如serrs(表面增强共振拉曼光谱)。为了简洁，这些方法将被全部称为sers。
wo2008/019161描述了采用表面增强拉曼光谱(sers)标记物的燃料鉴别方法。该方法包括具有已知拉曼光谱的物质与一定量的燃料的联合。在一个实施方案中，可以将包括sers活性核的纳米颗粒与燃料供给混合。在替代性实施方案中，可以将包括拉曼活性报道分子的sers活性染料与一定量的燃料混合。如果将所述一定量的燃料用拉曼活性染料标记，则鉴别所述一定量燃料的方法可以包括向燃料的样品混入拉曼增强性金属颗粒的胶体，然后获得与所述标记物有关的拉曼活性报道分子的拉曼光谱。合适的金属包括，但不限于金或银。替代性地，可以使一部分样品与sers活性物质关联。尽管在wo2008/019161中描述了程序的半定量实例，但是已发现标记物的sers响应易于变化，使得结果由于非再现性而包括明显的不确定性。wo2012/052779描述了通过以特定方式使用内标定量检测标签剂的改进的方法。本领域中的进一步改进仍然是可取的。
根据本发明，提供了包括具有等离激元表面的固体核、sers活性化合物和壳的sers颗粒，所述壳包封所述固体核和所述sers活性化合物；其特征在于所述固体核包括各向异性成形的纳米颗粒。
根据本发明，进一步提供了评估组合物中的sers活性分析物化合物(saac)浓度的方法，包括以下步骤：
a)获得所述组合物的样品；
b)使所述样品与多个sers颗粒接触，每个sers颗粒包括：
i.包括具有等离激元表面的纳米颗粒的核，
ii.邻近所述等离激元表面的sers活性内标化合物(saisc)，和
iii.壳，所述壳包封所述核和所述sers活性内标化合物；
c)从与sers颗粒接触的样品获得sers光谱；
d)从sers活性分析物化合物的sers响应和sers活性内标化合物的sers响应计算sers响应比saac:saisc。
在本说明书中，可以使用以下缩写：
sers活性分析物化合物：缩写为saac；
sers活性内标化合物：缩写为saisc；
sers活性标签剂化合物：缩写为satc。
“纳米颗粒”是指具有在1至100nm范围内的最大物理尺度(例如长度、直径等)的单一颗粒。sers纳米颗粒可以为能够被生产的任意形状。尤其是，sers纳米颗粒可以以棒、棱柱、星形、立方体或椭圆体的形式成形。分子的sers(等离激元)增强在所述分子接近多于一个等离激元表面时可以更大。sers纳米颗粒可以为非球形的。sers颗粒的纳米颗粒物核可以以棒、棱柱、星形、立方体、球体、纳米花、纳米壳、纳米笼、中空纳米球、纳米枝晶、纳米海胆、四面体、六面体、八面体、二十面体和十二面体、三角形、多角形板或三棱柱的形式成形。本发明的一个特定实施方案可以包括棒状纳米颗粒核。
核具有能够增强sers活性化合物的拉曼散射的外表面。核的外表面可以包括任意已知的sers增强型材料。核的表面可以包括金、铜、银或其混合物或合金。可以使用其它等离激元表面，特别是金属，包括na和al和过渡金属如pt、ni、ru、rh、pd、os、co、fe和cr。由于开发了表面增强光谱的新方法，所以不同的促进ses的表面可变得可得并且可有用。核可以由与表面相同的材料形成的纳米颗粒组成，即所述核可以包括固体纳米颗粒。固体纳米颗粒可以包括金、铜、银或其混合物或合金。替代性地，核可以包括至少两种不同的材料：在核的外表面处具有等离激元表面的材料和在核的外表面内的不同的材料。sers颗粒可以包含多于一种核纳米颗粒。核可以为中空的，即所述核可以包括围绕空的空间的材料。
sers颗粒可以包括一个或多于一个核。sers颗粒可以包含以规则的方式布置的多个核，例如所述核可以彼此成行。替代性地，sers颗粒可以包含核纳米颗粒的聚集体或簇。
壳可以由有机或无机材料形成。适合作为壳材料的无机材料包括玻璃、二氧化硅和金属如ti和zr。有机壳材料可以包括聚合物，例如丙烯酸系聚合物如聚丙烯酸及其官能化的衍生物；乙烯基聚合物如聚苯乙烯及其官能化的衍生物；聚酰胺，包括天然衍生的聚合物如多肽及其盐；聚酯及其官能化的衍生物，包括天然衍生的聚酯；和多元醇如聚乙二醇。合适的聚合物的一些实例包括聚(丙烯酸)及其盐，聚-l-谷氨酸及其盐，聚(烯丙胺盐酸盐)，聚-l-赖氨酸盐酸盐，聚(4-苯乙烯磺酸)及其盐和聚(氯化二烯丙基二甲基铵)。这些聚合物的盐包括任意合适的反离子；通常使用钠盐。聚合物壳可以通过与纳米颗粒核和sers活性内标混合的至少一种合适的单体聚合形成，以原位形成聚合物壳层。替代性地，可以将聚合物的溶液或分散体与纳米颗粒核和sers活性内标混合并处理，例如通过除去溶剂，以围绕纳米颗粒核和sers活性内标沉积聚合物的层。通过合适地选择聚合物官能团，溶解或分散的聚合物可以被吸引至核/内标组合并沉积，以形成壳层。例如，带负电的聚合物(例如包括羧酸根或磺酸根基团)可以被吸引至带正电的核/内标组合。可以存在多于一种壳材料。
壳围绕核和sers活性内标化合物，从而使得将核和sers活性内标化合物包封在壳内。通过壳包封核和sers活性内标化合物提供了稳定的sers颗粒，其可以储存较长的一段时间而不影响由sers活性内标化合物获得的sers光谱。这是可实现的，因为壳保护核和sers活性内标化合物免受环境影响，如氧化。壳可以在数月或数年的时间内提供这样的保护，从而提供具有长的“储存期”的sers颗粒。在一些应用中可要求所述储存期不长于数天或数周。壳可以对一些分子是可透过的。壳优选不诱导纳米颗粒聚集至实质影响本发明的方法或制备sers颗粒的程度。在一些实施方案中，可以选择壳材料，所述壳材料在用于测量saisc和saac的激发波长处不具有强的ser(r)s信号。壳材料可以对用于从saisc获得sers响应的激发波长透明，从而激发光能够与saisc相互作用。壳可以与saisc相互作用以产生可再现和可测量的sers响应。
sers活性内标化合物(saisc)可以选自宽范围的化合物。可以选择saisc以在用于从saac获得sers响应的激发波长处提供可测量的sers响应。这样的响应优选是容易再现的。sers活性内标化合物(saisc)的选择可以受到组合物中的sers活性分析物化合物(saac)的性质影响。saisc可以具有包含可区别于在通过相同的激发波长激发时的saac的sers光谱中的全部谱带的至少一个谱带的sers光谱。saac可以具有包含可区别于在通过相同的激发波长激发时的saisc的sers光谱中全部谱带的至少一个谱带的sers光谱。以该方式，组合物的sers响应包含归属于saisc和归属于saac的各自的谱带。当saisc和saac的sers光谱具有交叠的谱带时，则其可以通过使用光谱分析软件区分saac和saisc的响应。sers活性分析物化合物的sers响应和sers活性内标化合物的sers响应可以通过在不同的波长激发分子而测定。优选的是，saac在用于获得其sers光谱的波长处不产生明显和可测量的荧光。sers纳米颗粒可以包括>1sers活性内标。
sers活性内标化合物可以包括壳材料。壳材料可以包含一个或多个化学基团，所述基团产生可以用作saisc的可测量的sers响应。当壳材料包括或包含saisc时，sers颗粒可以包括或可以不包括另外的saisc。壳材料可以包括saisc，例如其呈sers活性化学基团的形式，所述基团是壳材料的不可缺少的部分，结合至壳材料或与壳材料物理混合。
saisc可以包括用于纳米颗粒的稳定化剂。saisc优选与稳定化剂或表面活性剂相互作用。这样的相互作用可以促进saisc和核的包封。saisc优选不诱导纳米颗粒聚集至实质影响本发明的方法或制备sers颗粒的程度。
包括核、saisc和壳的sers颗粒可以包括表面活性剂或稳定化剂，其存在于核的外表面与壳之前。表面活性剂可以是阳离子型表面活性剂如鲸蜡基三甲基溴化铵(ctab)、十八烷基-对乙烯基苄基二甲基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵(ttab)和苄基二甲基十六烷基氯化铵(bdac)。表面活性剂可以替代性地为阴离子型表面活性剂或非离子型表面活性剂如
表面活性剂可以为用于产生形成sers颗粒的核的胶体金属纳米颗粒的表面活性剂。相信表面活性剂分子使得它们以特定方式相对于核的外表面取向。相信表面活性剂分子的取向有助于saisc分子相对于核的外表面规则取向。由分子获得的拉曼光谱的等离激元增强取决于分子相对于等离激元表面的取向。当内标化合物的分子在相同方向上优选地或主要地取向时，与由随机取向的分子获得的光谱相比，sers光谱可以更具再现性。核与壳之间的表面活性剂的存在因此有助于增强内标的sers响应并且以稳定的方式保持响应。
表面活性剂可以使得或促进saisc与核之间和/或saisc与壳之间的相互作用。如果表面活性剂在用于测量saisc和saac的激发波长处具有可测量的ser(r)s信号，则可需要合适的步骤如使用光谱分析软件，以防止这样的信号干扰saisc和saac的sers响应的测量。优选的是使用在用于测量saisc和saac的激发波长处不具有强的ser(r)s信号的表面活性剂。表面活性剂或稳定化剂可以与saisc相互作用以产生可再现的和可测量的sers响应。
表面活性剂材料可以包括saisc，其例如呈结合至表面活性剂的sers活性化学基团的形式或与其物理混合。
sers颗粒中的表面活性剂的存在可以提供可以控制内标与金属表面的间隔的手段。当包封壳具有受控的厚度时，可以控制saac或satc与金属表面的间隔。可以控制saac与等离激元表面的间隔，从而可以使得saac足够接近sers的等离激元表面，和使得大部分这样的saac分子处于等离激元表面的预定距离之内。
sers颗粒可以包括可聚合的表面活性剂。可聚合的表面活性剂可以作为saisc的稳定剂和以其聚合的形式作为壳材料二者存在。合适的可聚合的表面活性剂的实例是11-(丙烯酰氧基)十一烷基三甲基溴化铵。
壳的厚度可以影响核的等离激元表面对sers活性分析物的拉曼散射的增强产生影响的程度，因为壳的厚度影响核的表面与sers活性分析物之间的距离。核的表面与壳的外表面之间的距离可以在1-15nm范围内。在优选的实施方案中，核的表面与壳的外表面之间的距离可以在1-12nm，特别是1-5nm范围内。所述距离可以<10nm。优选的是壳厚度在类似的sers颗粒之间可再现地类似。
壳可以包括能够与化合物相互作用的官能部分。所述官能部分可以包括官能团如胺、醇、硫醇、羧酸、磺酸以及这样的酸的盐。当官能部分存在于壳的外表面上时，sers颗粒可以与其所添加到的组合物的样品中的化合物相互作用。sers颗粒可以以这样的方式与组合物中的化合物相互作用，使得所述化合物结合至或引入壳的外表面。术语“结合”包括，但不限于，物理、静电和化学结合。术语“结合(binding)”、“结合(bind)”、“结合的(bonded)”、“结合(bond)”和“结合(bonding)”应当以类似的方式解释。化合物可以借助于共价、离子、配位结合或磁性结合而吸收、吸附、结合。壳可以包括官能化的部分，选择所述官能化的部分以与组合物中的sers活性分析物化合物相互作用。壳可以包括官能化的部分，选择所述官能化的部分以优选结合至组合物中的sers活性分析物化合物。当选择所述官能化的部分以优选结合至组合物中的sers活性分析物化合物时，使saac保持接近sers颗粒并且受核的等离激元表面影响，从而可从saac获得sers光谱。壳可以与saac通过变成或变得对所述saac(或satc)可选择性透过而相互作用。壳的官能化的部分可以为组合物中的sers活性分析物化合物提供壳的选择性透过性。与未官能化的壳相比，官能化的壳可以因此使化合物更接近核的表面。可以选择壳材料的官能化的部分中所包括的一个或多个官能团的性质，以与感兴趣的特定分析物相容。当saac为标签剂化合物(satc)时，所述satc和包括特定结合至所述satc的官能化的部分的互补的sers颗粒可以作为标记和鉴别产品的匹配的系统供应。供应这样的系统可以提供对标记产品的增加水平的复杂性，这可以防止制造伪造的产品。可以通过从官能化的材料形成壳而将官能化的部分包括在壳中。例如，合适的包含官能化的部分的壳聚合物可以通过官能化的单体的聚合或通过使形成的聚合物与包含需要的官能的化合物反应而官能化而形成。
sers活性分析物化合物可以为标签剂(sers活性标签剂化合物(satc))，即出于提供一种手段的目的添加至组合物的化合物，通过所述手段可以随后可鉴别所述组合物。根据本发明，用于测定未知组合物的样品是否为已添加了已知量的sers活性标签剂化合物(satc)的已知组合物的样品的鉴别方法因此包括以下步骤：
a)获得所述未知组合物的样品；
b)使所述样品与多个sers颗粒接触，每个sers颗粒包括：
i.包括具有等离激元表面的纳米颗粒的核，
ii.邻近所述等离激元表面的sers活性内标化合物(saisc)，和
iii.壳，所述壳包封所述核和所述sers活性内标化合物；
c)从与sers颗粒接触的样品获得sers光谱；
比较未知组合物中来自sers活性标签剂化合物的sers光谱响应和sers活性内标化合物的sers光谱响应的sers响应比satc:saisc与来自所述已知组合物的sers响应比satc:saisc。
当已将已知浓度的sers活性标签剂化合物(satc)添加至已知组合物中时，可以通过测量在发生掺假的机会之后进行分析的类似组合物的样品中satc的浓度，检测已知组合物的后期掺假。例如，如果所述组合物为品牌产品如香水，可以通过以已知浓度添加少量satc(即可鉴别的化合物)对其进行标记。然后所述香水可以通过通常的供应链分配。类似的品牌产品的样品可以在后期获得并且进行分析以确定其是否为添加了所述satc的产品的样品。然后可以通过本发明的方法分析产品(即组合物)的样品，以确定是否存在所述satc，并且如果存在的话测定其浓度。如果未检测到所述satc，则可以推断样品并非添加了所述satc的组合物的样品，并且其因此可能不是正品的样品。如果存在satc但是以与将其添加至组合物的浓度明显不同的浓度存在，则可以推断从其中提取样品的产品可能通过稀释或通过浓缩组合物的一部分而改变。
所述方法可以用于鉴别液体或固体的组合物。如果组合物为固体，则可以将其溶于溶剂，然后使用本发明的方法分析。所述方法适合于鉴别各种类型的组合物，包括有机液体、水、含水溶液、粉末化的固体、颗粒状固体、固态物体或多种物体。可以有利地实践本发明的方法的材料的实例包括烃、石油化学品、燃料、矿物油、植物油、已知用于燃料和油掺假的液体如有机溶剂、醇、柴油排气流体、药物、农业化学品、化妆品、香水和其它高价值或高税收产品。如果需要的话可以将组合物或材料在分析之前溶于或分散于液体中。如果材料是固体，则这是特别有用的，但也用于液体或半液体材料。
satc是不干扰预期用途或组合物品质的化合物。例如，如果组合物预期作为例如药品、化妆品或香水，则所述satc应当在其存在的浓度下为非毒性的。satc可以在组合物中产生可见的改变，例如其可以为着色的。通常，标签剂在其使用的浓度在组合物中不是可见的。当待标记的组合物是液体时，satc优选在待用satc标记的液体中直至待使用的浓度为可溶的。satc优选在液体中直至使用sers分析可测量的浓度为可溶的。satc可以在待标记的材料中比其在用于在sers分析前提取它的溶剂中更不可溶。当所述材料为固体时，satc可以为与所述材料混合或涂覆至所述材料上的固体化合物。当分析所述材料时，可以将satc溶于通过本发明的方法分析的组合物或提取至所述组合物。
saac为在接近或接触sers底物时可以通过其拉曼信号鉴别的化合物。在本发明的鉴别方法中，saac为标签剂，即satc。标签剂为sers活性的，即其在接近等离激元拉曼增强性底物时产生拉曼光谱。
已发现适合用作saac(或satc)或saisc的化合物可以选自中性、阳离子型、阴离子型或两性离子型有机化合物。所述化合物可以包含至少一个芳族或不饱和烃区域。芳族烃区域可以包括一个或多个4元、5元、6元或7元不饱和或稠合环，所述环包含0、1或更多个杂原子。所述芳族区域可以选自吡咯基、嘧啶基、吡啶基、苄基、三嗪基、吡唑基、三唑基、四唑基、四嗪基单元。所述芳族区域可以进一步用0、1或更多个基团官能化，所述基团包括直链或环状烷烃、烯烃、炔烃、硝基、腈、醇、醚、酯、酰胺、醛、硫醇、硫醚、胺、卤化物、硫化物、氰酸酯、羧酸、酮、砜、亚砜、磺酸、膦酸或膦。saac和/或saisc可以包括染料。saac和/或saisc可以包括非染料化合物。saac和/或saisc可以选自染料如蒽醌、偶氮、连氮(azin)、吖嗪、花青、钌、荧光染料、芳基甲烷、香豆素类、天然染料、二芳基甲烷、三芳基甲烷、呫吨、吖啶、硫染料、重氮、萘酚、硝基、亚硝基、酞菁、方酸(squarine)、醌亚胺(连氮、二胺吖嗪(eurhodin)、藏花红)、吲达胺、靛酚、靛蓝、芘、酚、
合适的染料化合物的实例包括坚牢绿fcf，维多利亚蓝r，维多利亚蓝b，n,n-二甲基靛苯胺，苏丹橙g，罗丹明b，罗丹明b异硫氰酸盐，罗丹明b碱，罗丹明800，罗丹明6g，罗丹明530，罗丹明110，酞菁，藻红b，9,10-二溴菲，天青石蓝，棓花青，ir125，ir1061，ir1048，ir26，ir144，ir140，淡黄曙红，吡咯甲烷(pyrromethane)597，油红o，茜素红s钠盐，苝-3,4,9,10-四羧酸二酐，亚甲蓝，水合亚甲蓝，碱性蓝41，分散蓝79，溴甲酚紫，溴甲酚绿，溴甲酚蓝，乙酸甲酚紫(cresylvioletacetate)，红462，
在wo2012/052779中所描述的方法中，标签剂还必须作为在所述方法中用作内标的同位素变化的变体可获得。将标签剂的同位素变化的变体用作内标意在保证所述内标和标签剂对含水胶体纳米颗粒的吸附性质尽量类似。在本发明的方法中，saisc可以不是saac的同位素变化的变体(包括saac是标签剂的情况)。这允许为本发明的方法更宽地选择待用作内标的化合物。另一有利之处在于本发明的方法有助于将多种satc用于标记组合物。
优选的是选择satc和saisc以在用于获得它们的拉曼光谱的激发波长处不显示或显示低的荧光。然而，已知的是接近等离激元表面可以使荧光猝灭(至少至一定程度)，从而可以容忍一些水平的荧光。
将sers活性化合物用作标签剂使得在非常低浓度鉴别标签剂。标签剂可以以1ppt(万亿分之)-100ppm(百万分之)的浓度存在。标签剂可以以50ppt-1000ppb(十亿分之)的浓度存在。可以存在多于一种satc。在多于一种satc存在于组合物中的情况下，可以选择每种satc，以在彼此相同或不同或与其它satc相同或不同的波长产生sers响应。
sers颗粒可以以分散体例如胶体溶液形式提供在流体、通常含水或有机液体中。在这样的情况下，将样品与sers颗粒接触可以通过将样品(或其部分)与分散在流体中或与这样的分散体分开的sers颗粒混合而进行，以形成混合物。然后可以从混合物获得sers光谱。
sers颗粒可以以其中它们定位于表面上的形式提供。可以在方法持续期间将sers颗粒固定至表面。替代性地，sers颗粒可以以其中它们定位于表面上的形式提供，它们在进行本发明的方法时从所述表面脱离。将sers颗粒定位在表面上可以通过将包含sers颗粒的组合物印刷至基材的表面上而实现，例如通过喷墨印刷；将基材浸入sers颗粒的分散体，然后从分散体中取出基材，或通过喷雾沉积或任意其它合适的方法将sers颗粒沉积在基材的表面上。携带sers颗粒的基材的表面可以任选地进行干燥、固化或以其它方式处理。
sers光谱可以通过已知方法从与sers颗粒接触的样品获得。所述方法需要使用合适的拉曼光谱仪。可以通过一种或多种激光任选地与合适的滤光器组合来提供激发能量。saac(或satc)的浓度的计算和/或其与已知浓度的已知标签剂化合物的比较可以使用电子数据处理器进行。所述数据处理器可以与拉曼光谱仪关联并且可以进一步合并至拉曼光谱仪的数据处理设施。数据处理器可以包括与拉曼光谱仪分开的装置。数据处理器可以包括计算机，如便携计算机或其它电子计算装置，如合适编程的平板电脑或移动装置如电话。如果待在通常不可获得实验室设备的环境中进行样品分析，则使用便携或袖珍拉曼光谱仪可以是特别有用的。对于待确定sers活性标签剂的浓度的鉴别方法，期望在样品的源处或附近，例如在分布或使用待鉴别产品的位置进行分析。
sers活性分析物化合物或sers活性标签剂化合物的浓度可以从sers响应比saac:saisc或satc:saisc，即拉曼光谱检测器对saac或satc的响应比拉曼光谱检测器对saisc的响应的特征的比例计算。检测器响应比可以为各sers光谱的所选择的谱带(例如谱带高度或谱带面积)的比例。可以将计算的比例satc/saisc与来自包含已知浓度的sers活性标签剂化合物的参比样品的代表satc/saisc的参比值比较。可以将从仅包含目标sers活性标签剂或内标的参比样品获得的sers光谱用于鉴别合适的谱带，所述谱带为可以经选择用于比较化合物的相对响应的标签剂或内标的特征。相对响应可以从可归属于每个化合物的一个谱带的相对强度或从多于一个谱带计算。作为替代，可以比较全谱或其部分。光谱的经计算的性质如与存在的一种或每种化合物的参比光谱相比的相对响应可以被用于代表由于saac、satc或saisc的检测器响应。并不总是需要收集和显示扩展的拉曼光谱。在本发明的鉴别方法中，鉴别satc和saisc是已知的，因此可足够的是在一个或多个预定拉曼移动波数或波数范围处测量检测器响应并且从测量的响应计算标签剂或分析物的浓度。可以将计算的结果以浓度值、“通过/失败”结果的方式或以基于包含标准量的标签剂的溶液的值的量或相似性的任意值的方式显示给用户。比较光谱和计算相对响应和谱带强度的比例的方法是公知的并且典型地使用合适的采用光谱数据处理软件编程的计算机进行。sers活性标签剂化合物的浓度与拉曼检测器响应比之间的关系可以通过校准来确定。
用于本发明的方法中的sers颗粒可以通过文献中描述的方法制成。合适的方法描述于a.w.wark等人的phys.chem.chem.phys.(2013)15,18835-18843中。
本发明将与附图一起进一步描述在以下实施例中，所述附图为：
图1，实施例2中所述的标示物系统的归一化的响应对稀释的图；
图2，实施例3中所述的标示物系统的归一化的响应对稀释的图；和
图3，实施例4中所述的标示物系统的归一化的响应对稀释的图。
实施例1：制备sers颗粒
通过由sau等人(t.k.sau,murphy,c.j.,langmuir,2004,20,6414-6420)描述的晶种介导法(seed-mediatedmethod)制备金纳米棒。将所述纳米棒离心以除去过量的反应物并且再分散于1mmctab中。将sers活性化合物"a"作为内标的10mm溶液添加至纳米颗粒(以1.2nm存在)以产生1mm的最终内标浓度。留置样品以平衡过夜。这之后通过以下形成壳而包封样品：通过在搅拌下滴加使用聚(苯乙烯4-磺酸盐(钠盐))(pss)，每1ml纳米棒使用200μl的10mg/mlpss(于5mmnacl中)。然后将样品离心三次以除去过量的聚合物并再悬浮于水中。
实施例2：在方法中使用sers颗粒
将甲醇用在水中的sers活性标签剂化合物(化合物"b")标记。然后将经标记的溶剂用水从0-100％稀释以10％的步进来稀释。
对于每个经稀释的经标记溶剂样品，将在实施例1中制得的240μl的sers颗粒与240μl经标记的溶剂一起添加至小瓶。将样品用手摇动3秒并通过se(r)rs在785nm激发处分析，激光功率为40mw，累积时间为1秒。为了使响应定量，测定来自sers活性标签剂化合物和内标的光谱的所选择的谱带的面积并且如下将响应归一化：
归一化的响应＝satc分子的响应/saisc的响应。
将归一化的响应相对satc稀释制图，并且将对于每个经标记的溶剂的r2值确定为归一化的响应与稀释之间的线性关系的指示。结果示于图1中，其中仅示出标示物以表明数据点的位置并且并不意在表明任何误差量。
实施例3
使用乙醇替代甲醇重复实施例2。结果示于图2中。
标示物并不意在表明任何误差限度。
实施例4
使用32.5重量％的尿素水溶液(其商业上被用作柴油排气流体(def))以类似的方式进行实施例2的方法。所使用的sers活性标签剂化合物为化合物c。使用化合物c在def中的四种稀释并且将从sers光谱中所选择的峰的峰高度定量并相对sers颗粒中所包含的saisc的响应归一化的响应如上文所述在图3中制图。
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