本发明属于临床医学诊断领域，特别涉及一种基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术：
降钙素原(PCT)是一种用于严重细菌感染诊断与治疗监测的非创伤性临床实验室指标，自1993年国外首次报道血清降钙素原(PCT)水平与细菌感染有关以来，各类研究表明，PCT正在越来越多地被认为是细菌感染和脓毒血症的良好标记物，从而成为临床诊断中的一个重要工具。PCT浓度的增长反映了从一个健康状态到细菌感染的最严重后果(脓毒血症、严重脓毒症、脓毒性休克)的持续发展，呈现正相关性。因此，对于细菌感染和脓毒血症，高灵敏度、全定量PCT检测不仅可以进行早期的临床诊断，而且能够指明疾病的进程、预后以及对治疗方法进行指导，而目前研究的更长远的应用是将PCT作为抗生素管理的有效工具。
与其他细菌感染的传统诊断指标如白细胞计数、血沉、C-反应蛋白、细菌培养等比较，PCT拥有早期、快速、更高的灵敏度和特异性，从临床应用鉴别诊断中可知，PCT在细菌感染特别是脓毒症方面的诊断的特异性明显优于传统诊断指标，目前在国外已广泛应用于临床各科室。具体应用如下：
1、细菌感染早期的鉴别诊断。通常在发生细菌感染后2-6小时快速升高，并可检测到；对细菌感染的诊断特异性在90％左右，而在病毒感染、自身免疫性疾病、慢性非特异性炎症等情况下几乎不升高。
2、与感染病情的严重程度与发展呈正相关。随着感染严重程度的增加，PCT浓度明显增高，尤其对严重脓毒症和脓毒性休克的诊断特异性明显高于WBC、CRP等指标，国外某些文献指出其特异性甚至可达到100％，因此PCT浓度测定是MODS(多器官功能障碍)发生的预警指标。
3、细菌感染治疗效果及预后观察。PCT水平的下降表明炎性反应的降低及感染灶的清除，因此可提示良好的预后及治疗效果观察，与疾病的发展呈现正相关。
4、在一定程度上可减少临床抗生素的滥用。采用PCT浓度监测与细菌血培养、鉴定药敏等相结合，可以协助临床正确、合理的使用抗生素；国外有研究表明，将PCT定量检测用于门诊怀疑细菌感染的患者，可快速的明确诊断，合理的使用抗生素，防止抗生素的滥用。
因此，降钙素原全定量检测对临床重症监护室、急诊科、呼吸科、新生儿室等科室有着重要的临床意义；不仅如此，也可作为其他科室如普通内科门诊、手术室、血液科、肿瘤科、器官移植中心等科室常见的手术后、放化疗、器官移植后的常规感染性监测指标；同时可协助微生物室的鉴定培养系统对医院院内感染进行更有效的监测及判定。因此，对临床上出现的感染性疾病，尤其是重症感染的诊断与监测所产生的临床效用是不可估量的。
高灵敏度、全定量PCT检测不仅可以完善检验科微生物实验室对细菌感染、脓毒血症早期的快速诊断与治疗监测系统，同时也完善临床急诊、危重症实验室检测项目系统。
传统上多用化学发光法、电化学发光法及胶体金免疫层析法或者荧光免疫层析法等测定PCT。但放射免疫法和酶联免疫吸附法操作复杂，检测耗时长，目前几乎已被淘汰；化学发光法对技术要求高，操作步骤相对比较繁琐，需要多步试剂添加过程；电化学发光法对技术要求高，不易在临床实验室中进行常规开展。胶体金免疫层析法虽然具有标本用量少，简便快速，便宜的优势，然而当遇到某些样品中抗原或抗体含量极低时，胶体金的颜色将很浅甚至无显色，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度较低。荧光免疫层析法虽然灵敏度比胶体金免疫层析法要高，但是其检测精密度并不理想，灵敏度与大型化学发光或者电化学发光仪器仍有差距。
时间分辨荧光(Time-resolvedFluorescence，TRF)是一种非同位素荧光标记物，与普通荧光相比，具有stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免样品中的本底荧光，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。
目前市面上采用时间分辨荧光检测的试剂均采用解离增强镧系元素荧光免疫分析(DELFIA)，它采用具有双功能基团结构的螯合物，使其一段与铕(Eu)连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过免疫反应后形成免疫复合物，由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，需要加入一种解离增强剂，使得铕离子从复合物上解离下来，并与增强剂中的另一种螯合剂形成胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒，该试剂盒能在较短的检测时间内完成降钙素原的检测，检测时间短，检测灵敏度高。
本发明还提供了基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒的制备方法。
本发明还提供了基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原的检测方法。
为了实现以上技术效果，本发明是通过如下步骤实现：
一种基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒，其特征在于：该试剂盒由检测反应杯、荧光标记抗体及清洗液组成；该试剂盒的检测基础是双抗体夹心的免疫反应。
所述检测反应杯的固相表面包被有降钙素原单克隆抗体或多克隆抗体；
所述荧光标记抗体为时间分辨荧光微球与降钙素原单克隆抗体或多克隆抗体通过共价键交联。
所述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素螯合物，其粒径为100-1000nm。优选的，所述镧系元素螯合物为铕螯合物。进一步优选的，该铕螯合物为Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen。
上述基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒的制备方法，其步骤包括，
(1)、检测反应杯的制备：将降钙素原单克隆抗体或多克隆抗体稀释后37℃包被，并用封闭缓冲液封闭、拍干；置于37℃的干燥箱中烘干、密封保存；
优选的，将降钙素原单克隆抗体或多克隆抗体用0.2mol/L的磷酸缓冲液稀释至10μg/mL，100μL/孔，37℃包被4小时，并用封闭缓冲液按200μL/孔加入反应杯，37℃封闭4小时，弃去包被反应杯中的封闭液，拍干，置于37℃的干燥箱中烘干、密封保存；
(2)、荧光标记抗体的制备：将时间分辨荧光微球活化；然后加入降钙素原单克隆抗体或多克隆抗体混匀、封闭、清洗，并用反应缓冲液稀释，获得终浓度到40-60μg/mL的荧光标记抗体；
(3)清洗液的制备：该清洗液中含有PB，NaCl，Tween20，该清洗液的pH值为7-9。优选的，清洗液中含有5mmol/L的PB，0.9％NaCl，0.05％Tween20，该清洗液的pH值为7.8。
所述步骤(2)中，时间分辨荧光微球活化的步骤为，在羧基时间分辨荧光微球中加入MES和EDC进行初次活化处理，加入氨基己酸室温混匀15-60min，加入MES、NHS和EDC进行再次活化处理；每1mg羧基时间分辨荧光微球对应10-100μL50mmol/L氨基己酸。
优选的，所述初次活化处理包括：每1mg羧基时间分辨荧光微球，加60μL500mmol/LpH5.0-7.0的MES，0.02-0.2mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，加纯化水至终体积300μL，室温混匀15～60min；
所述再次活化处理包括：加入所述氨基己酸室温混匀后，加1mL100mmol/L的MESpH6.0，离心清洗15000rpm20min，弃去上清；加400μL的100mmol/L的MESpH6.0，超声分离，加0.02-0.2mgN-羟基琥珀酰亚胺，加0.01-0.1mgEDC，室温混匀15min；加1mL100mmol/L的MESpH5.0-7.0缓冲液，离心清洗15000rpm20min，弃去上清；100mmol/LMESpH5.0-7.0缓冲液恢复到1mL。荧光微粒活化过程中添加氨基己酸作为手臂，使得抗体与微球之间的距离增加，有效的降低了空间位阻效应，提高了检测系统灵敏度。
上述基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原的检测方法，其步骤包括，
(A)、标准曲线的绘制：采用基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒测定不同浓度的校准品，并根据荧光读数仪上的荧光信号值，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号值为纵坐标，绘制成标准曲线；
(B)、将待测样品加入检测反应杯内，再加入荧光标记抗体，30℃-40℃温育，用清洗液清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体；
(C)在340-380nm激发光激发下，测试检测反应杯中荧光信号,检测波长为600-630nm；
(D)将所述荧光信号与步骤(A)中的标准曲线比对，获得所述待测样品的降钙素原浓度。
所述步骤(A)中，浓度为为0、0.02、0.1、0.5、2、10、25、50ng/mL的校准品中加入荧光标记抗体，37℃温育5-25min，然后用清洗液清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体，所述校准品与荧光标记抗体的体积比为1:4-6。
所述步骤(B)中，待测样品与荧光标记抗的体积比为1:4-6，温育温度为37℃。
本发明的有益效果是：
1)本发明所制备的荧光标记物为时间分辨荧光乳胶微球，每个微球中填充了几万到几十万个稀土元素离子螯合物，检测过程中并不需要解离增强过程，便可发出很强的荧光，简化了时间分辨荧光检测步骤，解离增强时间分辨荧光检测往往需要1个小时左右时间才能得到检测结果，而采用时间分辨荧光微球作为标记物，由于每个微球中填充了大量的镧系元素螯合物，荧光信号放大数千倍以上，因此可以在5-20分钟的检测时间内完成检测，缩短了检测时间，并有效的提高了检测灵敏度。
2)荧光微粒活化过程中添加氨基己酸作为手臂，使得抗体与微球之间的距离增加，有效的降低了空间位阻效应，提高了检测系统灵敏度。
3)本发明提供的基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原的检测方法，由于其超高的灵敏度，易于实现自动化操作，而且反应温度均一，不受环境因素影响，准确性更好，精密度也非常优异。
附图说明
图1是本发明的原理示意图。
图2是本发明根据荧光读数仪上的荧光信号值，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号值为纵坐标，绘制成的标准曲线。
图3是采用实施例1中制备的试剂组合成降钙素原时间分辨荧光定量试剂盒，测定临床样本，与电化学发光临床样本测试结果的对比结果图。
图1中：1为荧光标记抗体，2为降钙素原抗原，3为包被抗体，4为反应杯固相表面，5为光免疫复合物。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
实验所用到的设备：PerkinElmer公司的VictorX4多功能酶标仪。
本发明的原理示意图如图1所示，包被抗体3结合在反应杯固相表面4上，在反应杯中添加一定量的样品使得样品中的降钙素原抗原2与反应杯固相表面结合的抗体3结合，再加入荧光标记抗体1，温育形成发光免疫复合物5，采用清洗液清洗反应杯后去除未结合的抗原及荧光标记抗体，检测反应杯中的荧光信号，与标准曲线进行对比，得到待测样本中降钙素原的浓度。
实施例1
(1)、检测反应杯的制备：
A、检测反应杯包被：降钙素原抗体18B7(Hytest公司)用0.2mol/L的磷酸缓冲液(pH7.8)稀释成10μg/ml，100μL/孔，37℃包被4小时，洗板。
B、检测反应杯封闭：用封闭缓冲液按200μL/孔加入反应杯，37℃封闭4小时，弃去包被反应杯中的封闭液，拍干。
C、检测反应杯干燥：将上述封闭好的反应杯放置于湿度低于30％的37℃干燥箱中烘干4小时，密封干燥保存。
(2)、荧光标记抗体的制备：
A、荧光微粒活化：
取1mg羧基时间分辨荧光微球(200nm，0.1ml，10mg/mL，Bangslab公司)，加60μL500mmol/L的MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液，pH6.0，加0.2mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，加纯化水至终体积300μL，室温混匀15min。加100μL50mmol/L氨基己酸，室温混匀30min。加1mL100mmol/LMESpH6.0，离心清洗15000rpm20min，弃去上清。加400μL100mmol/LMESpH6.0，超声分离，加0.2mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加0.1mgEDC，室温混匀15min。加1mL100mmol/LMESpH6.0缓冲液，离心清洗15000rpm20min，弃去上清。100mmol/LMESpH6.0缓冲液恢复到1ml。
B、抗体交联：加0.2mg的降钙素原单克隆抗体44D9(Hytest公司)，室温25℃混匀30min。
C、封闭：加BSA封闭液，至终浓度10mg/mLBSA，室温25℃混匀过夜。
D、清洗：加3mL交联缓冲液，25000rpm离心清洗30min，弃去上清。加500μL缓冲液，超声分离，终浓度2mg/mL。
E、工作用荧光标记抗体配制：
配制反应缓冲液：缓冲液中含有50mmol/Ltris，1％BSA，0.9％NaCl，2％葡聚糖，0.5％tween20，pH7.2。
用反应缓冲液将上述清洗好的荧光标记抗体稀释到终浓度到50μg/mL，作为检测用荧光标记抗体。
(3)、清洗液的制备
配制清洗缓冲液，含5mmol/LPB，0.9％NaCl，0.05％Tween20，pH7.8。
实施例2
(1)标准曲线的绘制：
采用实施例1中制备的试剂组合成降钙素原时间分辨荧光定量试剂盒，测定校准品，每个浓度重复10次。
每个检测中加入校准品10μL，荧光标记抗体50μL，37℃温育20min，然后清洗检测杯，在PerkinElmer公司的VictorX4荧光读数仪上进行读数(激发波长340-380nm,检测波长600-630nm)具体数据如表1所示。
表1
根据表1中的数据，以校准品浓度为横坐标，以荧光信号均值为纵坐标，绘制成标准曲线。标准曲线如图2所示。该标准曲线线性良好，可以通过该标准曲线对样本中所含的降钙素原浓度进行定量分析。
通过表1结果可知，检测试剂盒的批内精密度良好，校准品各浓度点精密度均小于10％，且试剂灵敏度良好(0值校准品除外)，在0.02ng/mL水平与0值校准品有显著区分。
(2)、样本检测
采用实施例1中制备的试剂组合成降钙素原时间分辨荧光定量试剂盒，测定临床样本，与罗氏cobas电化学发光系统测试结果进行相关性分析。
每个检测中加入样品10μL，荧光标记抗体50μL，37℃温育20min，然后清洗检测杯，在PerkinElmer公司的VictorX4荧光读数仪上进行读数(激发波长340-380nm,检测波长600-630nm)，将测试结果带入图2标准曲线，计算样品测试浓度，测试结果如表2所示，与罗氏cobas电化学发光系统测试结果进行相关性分析，相关性曲线如图3所示。
表2临床样本测试结果
从图3中可知，本发明的试剂盒测定结果与罗氏仪器及配套试剂盒测定结果相关系数R2为0.991，相关性很好。罗氏系统和配套的降钙素原试剂盒是知名的电化学发光检测试剂盒，但其价格昂贵，一般只有大型三甲医院的中心实验室才有配置，其精度和结果公认可靠。但是本发明制备的试剂盒无论从价格上还是从检测准确度上考虑，可用于临床诊断使用。
实施例3
(1)、检测反应杯的制备：
A、检测反应杯包被：降钙素原抗体18B7(Hytest公司)用0.2mol/L的磷酸缓冲液(pH7.8)稀释成10μg/ml，100μL/孔，37℃包被4小时，洗板。
B、检测反应杯封闭：用封闭缓冲液按200μL/孔加入反应杯，37℃封闭4小时，弃去包被反应杯中的封闭液，拍干。
C、检测反应杯干燥：将上述封闭好的反应杯放置于湿度低于30％的37℃干燥箱中烘干4小时，密封干燥保存。
(2)、荧光标记抗体的制备：
A、荧光微粒活化：
取1mg羧基时间分辨荧光微球(200nm，0.1ml，10mg/mL，Bangslab公司)，加60ul500mMMES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液，pH6.0，加0.2mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，加0.4mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS，40μL，10mg/mL)，加纯化水至终体积300μL，室温混匀15min。加1mL100mmol/LMESpH6.0，离心清洗15000rpm20min，弃去上清。
B、抗体交联：加0.2mg的降钙素原单克隆抗体44D9(Hytest公司)，室温25℃混匀60min。
C、封闭：加BSA封闭液，至终浓度10mg/mLBSA，室温25℃混匀过夜。
D、清洗：加3mL交联缓冲液，25000rpm离心清洗30min，弃去上清。加500μL缓冲液，超声分离，终浓度2mg/mL。
E、工作用荧光标记抗体配制：
配制反应缓冲液：缓冲液中含有50mmol/Ltris，1％BSA，0.9％NaCl，1％葡聚糖，0.5％tween20，pH7.8。
用反应缓冲液将上述清洗好的荧光标记抗体稀释到终浓度到50μg/mL，作为检测用荧光标记抗体。
(3)、清洗液的制备
配制清洗缓冲液，含5mmol/LPB，0.9％NaCl，0.05％Tween20，pH7.8。
(4)、校准品测试
采用上述方法制备的试剂组合成降钙素原时间分辨荧光定量试剂盒，测定校准品，每个浓度重复10次。
每个检测中加入校准品10μL，荧光标记抗体50μL，37℃温育20min，然后清洗检测杯，在PerkinElmer公司的VictorX4荧光读数仪上进行读数。
通过表3结果可知，检测试剂盒的批内精密度良好，校准品各浓度点荧光信号精密度均小于10％(除0和0.02ng/ml水平以外)，试剂灵敏度相比实施例1来说有所降低，仅在0.1ng/mL水平与0值校准品有较为显著区分。说明荧光微粒前处理过程中通过添加手臂的方式能有有效的提升检测的灵敏度。
表3降钙素原定量检测标准曲线数据