本发明属于生物疫苗效果的检测方法及检测试剂盒的研发技术领域，特别是涉及一种用于微囊化口服疫苗免疫效果血清学抗体效价检测的检测方法及检测试剂盒。
背景技术：
羊大肠杆菌病是由不同血清型的致病性大肠杆菌所引起幼畜腹泻，尤其以新生幼畜特别易感，并可导致生长发育迟缓，生产性能低下，严重的甚至造成死亡，给畜牧业经济的发展带来严重影响。目前，本病的防治主要以药物治疗和疫苗接种为主，疫苗的接种通过刺激机体产生抗体，在畜牧业中可以对被接种的家畜提供经济有效的免疫保护，同时能够防止相对应的传染病流行传染或是大规模爆发。疫苗接种使用较多的接种途径是注射接种和经口接种，在羊源致病性大肠杆菌病的防治中主要以注射接种疫苗为主，但注射接种时的针刺和针头消毒不当都会给家畜造成一定程度的危害，并且在规模化养殖场中，免疫接种的次数较多，难免造成接种人员工作强度大，注射器针头误伤接种人员等情况出现。而口服接种途径可以很好的解决上述在免疫接种过程中所遇到的弊端。口服疫苗的给药途径是通过动物的饮水和采食进行给药，其给药方便并且安全性高同时在对动物进行免疫保护的同时几乎不会对动物造成任何应激。
然而，反刍动物的消化系统形态构造较单室胃动物的复杂，其瘤胃具有强大的发酵消化作用，常规的口服疫苗在给药前不经过保护处理，使得口服疫苗极有可能在其消化道中降解从而失去效力。微囊化技术可以很好的保护抗原抵御消化道各段的降解，微囊化口服疫苗是采用天然或合成的高分子材料对抗原进行包被，从而控制抗原在整个免疫程序中的释放程度，最终保证抗原在抵达靶细胞时具有一定的免疫效力。微囊化大肠杆菌口服疫苗是新型致泻性大肠杆菌疫苗，该口服疫苗可以方便快捷的对动物进行免疫接种，减轻了接种人员的工作强度，克服了注射接种对动物造成应激的缺点，并且利用微囊化技术对抗原进行保护使得口服疫苗能够最大化的发挥其效力。但目前尚无针对微囊包被的口服疫苗免疫抗体进行检测的准确、特异的检测方法来评价微囊包被的口服疫苗免疫动物后的体液免疫效果，故本发明研究建立了微胶囊大肠杆菌口服疫苗免疫抗体检测检测方法。
目前，该病抗体水平的检测方法主要有微量凝集试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法，其中ELISA法具有操作简便、特异性强、结果稳定等优点，是诊断和监测羊大肠杆菌病的行之有效的方法之一。缺点是直接ELISA法实验中的一抗都得用酶标记，但不是每种酶都适合做标记，费用相对较高；间接ELISA法实验中交互反应发生的几率较高。商品化的ELISA检测方法目前可检测的抗体中没有特定针对微囊化灭活口服疫苗刺激机体后而产生。
并且，常规ELISA检测法监测抗体的方法存在着抗原来源不明确、在进行大规模鉴别检测抗体水平时成本较高，又因，微囊化大肠杆菌口服疫苗尚未商品化，用于针对此疫苗抗体水平检测的方法及相关示范法也未见报道。所以，利用新型致泻型大肠杆菌微囊化口服疫苗达到动物机体对致病型大肠杆菌此抗原产生免疫保护过程中抗体水平的监测是需要借鉴流行病学研究，创建实用、简便、经济、灵敏度高的新诊断体系。
间接ELISA检测技术是目前在动物疾病研究领域应用十分广泛。操作简便，灵敏度高，还可对抗体水平做出定量分析。间接ELISA法是检测抗体常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测与固相抗原结合的受检抗体，间接ELISA法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。被免动物血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质再包被一次，以封闭固相上的空余间隙。另外，在检测过程中样本须先行稀释，以避免过高的阴性本底影响结果的判断。本检测方法针对间接ELISA法的相关特点均做出相关优化，以利于检测方法的特异性提升并且灵敏度高的加强。
在前期工作基础上，选取致病型大肠杆菌菌株C83-1、C83-2、C83-3，血清型(O78:K80)做为抗原。在上述基础，在试剂用量、体系建立、条件的优化及配套组装检测方法等方面进行探讨，最终研发了微胶囊大肠杆菌口服疫苗免疫抗体检测检测方法。用其快速、特异、价廉的诊断试剂，进行检测免疫动物抗体水平，为防治致泻型羊大肠杆菌病对养羊业的危害和畜牧业的健康发展提供新技术支撑。
技术实现要素：
本发明的目的在于：采用间接ELISA法，建立一种能够对动物机体所产生的特异性免疫抗体水平进行特异性强、快速准确、操作简单并且经济效益最优的检测方法，并利用这种检测方法制备经济的、适用于生产实践的快速检测试剂盒，用于检测评价微囊化大肠杆菌口服疫苗的体液免疫保护效果。
本发明技术方案：用于微囊化大肠杆菌口服疫苗免疫抗体检测的检测方法，该检测方法包括下述步骤：
(1)抗原包被：用pH为9.6的碳酸盐缓冲液0.05mol/L将抗原按一定比例稀释，每孔加入100μl，4℃包被24h；(2)洗涤：取出后室温平衡30分钟，弃去液体，用1倍含0.05％吐温–20的pH为7.4的磷酸盐缓冲液PBST洗涤3次，每次1min，在吸水纸上吸干；(3)封闭：加1％BSA封闭液每孔100μl，37℃孵育1h；(4)洗涤：弃液体，洗涤3次，吸水纸吸干；(5)加一抗：加用0.1％BSA稀释液稀释的标准阳性血清每孔100μl，37℃孵育1小时，所述一抗为待测血清中的抗体；(6)洗涤：洗涤3次，吸水纸吸干；(7)加二抗：加用0.1％BSA稀释至工作浓度为1∶5000的辣根过氧化物酶标HRP羊抗大鼠IgG每孔100μl，37℃温育1h；所述二抗为辣根过氧化物酶标HRP羊抗大鼠IgG；(8)洗涤：洗涤3次，于吸水纸上吸干；(9)显色：加邻苯二胺OPD底物溶液，每孔100μl，微量振荡器振荡2min，37℃温育30min；(10)终止：加终止液50μl，微量振荡器振荡2min，静置作用15min；(11)酶标仪测OD值：酶标仪492nm和630nm双波长测OD值，并与制备好的标准曲线及回归方程进行比对判断。
所述抗原为选取C83-1(大肠埃希氏菌)、C83-2(大肠埃希氏菌)、C83-3(大肠埃希氏菌)，血清型(O78:K80)菌株的二级种子菌液接种营养琼脂平板，37℃培养20-24h；然后用含0.5％甲醛的生理盐水洗下菌苔，4℃10000rpm离心10min洗涤沉淀，重复3次，121℃高压2h破坏表面抗原，调整浓度至30亿菌/ml即为凝集原。所述抗原稀释度为1∶2，即最佳抗原包被浓度15亿菌/ml的细菌浓度，其蛋白含量为4.75μg/ml。步骤(5)中最佳标准阳性血清稀释度选用1∶50。所述的步骤(11)中的OD492/630为0.444为阴阳性临界值，确定血清样品的P/N值，即标准阳性血清OD值/标准阴性血清OD值≥2.1且临界值≥0.444即为阳性；反之判为阴性。所述标准阳性血清通过采用100亿菌/ml的全菌抗原感染健康无免疫家兔，经玻板凝集法试血，效价达标后，放血，无菌分离血清，加万分之一柳硫汞，-20℃冻存。所述的标准阴性血清采取自健康无免疫家兔。所述的标准曲线及回归方程的建立以每份标准阳性血清按1∶50稀释时的OD492/630值为横坐标，以相应的ELISA效价倒数的对数为纵坐标，作散点图，得出标准曲线及回归方程。
一种依据上述的检测方法制备的用于微囊化大肠杆菌口服疫苗免疫抗体检测的检测试剂盒，应用于微囊化大肠杆菌口服疫苗免疫过后的动物，可针对其机体所产生的特异性免疫抗体进行检测。
有益效果：使用本检测方法能很好的监测大肠杆菌口服疫苗免疫效果，运用本方法制备的检测试剂盒，则能够快速及时进行实地监测。
附图说明
图1为：标准阳性血清最佳稀释度和抗原最佳浓度的确立；图2为：标准曲线。
具体实施方式
实施例1、用于微囊化大肠杆菌口服疫苗免疫抗体检测的检测方法，该检测方法包括下述步骤：(1)抗原包被：用pH为9.6的碳酸盐缓冲液0.05mol/L将抗原按一定比例稀释，每孔加入100μl，4℃包被24h；(2)洗涤：取出后室温平衡30分钟，弃去液体，用1倍含0.05％吐温–20的pH为7.4的磷酸盐缓冲液PBST洗涤3次，每次1min，在吸水纸上吸干；(3)封闭：加1％BSA封闭液每孔100μl，37℃孵育1h；(4)洗涤：弃液体，洗涤3次，吸水纸吸干；(5)加一抗：加用0.1％BSA稀释液稀释的标准阳性血清每孔100μl，37℃孵育1小时，所述一抗为待测血清中的抗体；(6)洗涤：洗涤3次，吸水纸吸干；(7)加二抗：加用0.1％BSA稀释至工作浓度为1∶5000的辣根过氧化物酶标HRP羊抗大鼠IgG每孔100μl，37℃温育1h；所述二抗为辣根过氧化物酶标HRP羊抗大鼠IgG；(8)洗涤：洗涤3次，于吸水纸上吸干；(9)显色：加邻苯二胺OPD底物溶液，每孔100μl，微量振荡器振荡2min，37℃温育30min；(10)终止：加终止液50μl，微量振荡器振荡2min，静置作用15min；(11)酶标仪测OD值：酶标仪492nm和630nm双波长测OD值，并与制备好的标准曲线及回归方程进行比对判断。
所述抗原为选取C83-1、C83-2、C83-3，血清型(O78:K80)菌株的二级种子菌液接种营养琼脂平板，37℃培养20-24h；然后用含0.5％甲醛的生理盐水洗下菌苔，4℃10000rpm离心10min洗涤沉淀，重复3次，121℃高压2h破坏表面抗原，调整浓度至30亿菌/ml即为凝集原。所述抗原稀释度为1∶2，即最佳抗原包被浓度15亿菌/ml的细菌浓度，其蛋白含量为4.75μg/ml。步骤(5)中最佳标准阳性血清稀释度选用1∶50。所述的步骤(11)中的OD492/630为0.444为阴阳性临界值，确定血清样品的P/N值，即标准阳性血清OD值/标准阴性血清OD值≥2.1且临界值≥0.444即为阳性；反之判为阴性。所述标准阳性血清通过采用100亿菌/ml的全菌抗原感染健康无免疫家兔，经玻板凝集法试血，效价达标后，放血，无菌分离血清，加万分之一柳硫汞，-20℃冻存。所述的标准阴性血清采取自健康无免疫家兔。所述的标准曲线及回归方程的建立以每份标准阳性血清按1∶50稀释时的OD492/630值为横坐标，以相应的ELISA效价倒数的对数为纵坐标，作散点图，得出标准曲线及回归方程。
利用酶标记的抗抗体以检测与固相抗原结合的受检抗体：
(1)将特异性抗原为血清型O78大肠杆菌的二级种子菌制得，调整浓度至30亿菌/ml即为凝集原，该凝集原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
(2)加稀释的受检血清，棋盘法测定最佳血清稀释度为1∶50，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
(3)加酶标抗抗体，用0.1％BSA稀释至工作浓度(1∶5000)的辣根过氧化物酶标(HRP)羊抗大鼠IgG，固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
(4)加底物显色，底物溶液为OPD(邻苯二胺)。
抗原包被浓度和血清稀释度确定
采用棋盘法用碳酸盐包被液将菌液浓度30亿菌/ml的抗原倍比稀释(1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256)，加不同稀释度的标准阴阳性血清(1∶50、1∶100、1∶200)，并设立稀释液空白对照组按上述步骤操作，重复做3次，测定OD值，选择阳性血清OD值/阴性血清OD值(P/N值)最大者为最佳血清稀释度，对应的抗原包被浓度即为最佳包被浓度。
临界值的确定：取15份健康未免疫羊大肠杆菌的阴性血清1∶50稀释后，按ELISA操作步骤进行试验，测定OD492/630值,应用统计软件计算其OD值的平均值及标准差，按照公式：临界值＝阴性样本OD492/630平均值+3×标准差，确定阴阳性临界值。
重复性试验：批内重复试验：取4份阳性血清，每份血清重复测4孔。在同一时间同次试验中按优化好的间接ELISA操作程序进行操作，对结果进行统计学分析，求出其平均值和标准差计算变异系数。
批间重复试验：分别取4份阳性血清，每份血清平行测4孔按优化好的间接ELISA操作程序进行操作，在不同时间分别进行4批平行操作，对结果进行统计学分析，计算其平均值和标准差，求出变异系数。
标准曲线及回归方程的建立：取15份按1∶50稀释的效价不同的已知羊大肠杆菌阳性血清，以1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800系列稀释，按优化好的间接ELISA操作程序进行操作。定义每份血清的ELISA效价(ET)为OD492/630值大于阴性临界值所对应的最高稀释倍数。以每份血清按1∶50稀释时的OD492/630值为横坐标，以相应的ELISA效价倒数的对数为纵坐标，作散点图，得出标准曲线及回归方程。
最佳血清稀释度和最佳抗原包被浓度的结果
棋盘法测定最佳血清稀释度和最佳抗原包被浓度的结果见图1，可见当血清稀释度为1:50，抗原稀释度为1:2(即抗原浓度为15亿菌/ml)时P/N值最大。故选用15亿菌/ml的细菌浓度(其蛋白含量为4.75μg/ml)作为最佳抗原包被浓度，血清稀释度选用1:50。
阴性血清临界值的确定：对1∶50稀释的15份阴性血清按ELISA操作步骤测定OD492/630值，其阴性血清平均值为0.163，标准差为0.093。按照公式：阴阳性临界值＝阴性样本OD492/630平均值+3×标准差，阴阳性临界值为0.444。确定血清样品的P/N值≥2.1且临界值≥0.444即为阳性；反之判为阴性。以OD492/630值大于阴性血清临界值的最大稀释倍数最为该血清的ELISA效价。
重复性试验结果
(1)批内重复结果
批内重复结果见表1-1，同一批次不同血清之间的变异系数介于1.71％～12.06％之间，小于15％，变异程度较小，重复性良好。
表1-1批内重复性试验结果
Table1-1theresultofrepetitionwithinplate
(2)批间重复结果
批间重复结果见表1-2，同一血清在不同试验批次中的变异系数介于1.95％～8.37％，小于10％。说明变异程度小，重复性好。
表1-2批间重复性试验结果
Table1-2theresultofrepetitionbetweenbatches
效价标准曲线和回归方程的建立结果
以血清按1:50稀释时的OD492/630值为横坐标，以相应的ELISA效价(ET)
倒数的对数为纵坐标，所得的标准曲线见图2，标准曲线的回归方程，
lg[1/ET]＝1.5564OD492/630+1.3295，R2＝0.6927。
其关键的实验操作：(1)抗原稀释度为1∶2，即最佳抗原包被浓度15亿菌/ml的细菌浓度(其蛋白含量为4.75μg/ml)；反应时间为24h；封闭液为1％BSA每孔100μl，温浴时间1h；血清的稀释倍数为1:50，反应时间1h；二抗稀释倍数1∶5000，反应时间1h；显色时间30min；包被缓冲液为pH9.60.05mol/L碳酸盐缓冲液，洗涤液为1倍PBST(含0.05％吐温–20的pH＝7.4磷酸盐缓冲液)，稀释液为加0.1％BSA。
标准阳性血清通过采用100亿菌/ml的全菌抗原感染健康无免疫家兔，经玻板凝集法试血，效价达标后，放血，无菌分离血清，加万分之一柳硫汞，-20℃冻存，在本实验保存。阴性血清采取自健康无免疫家兔。最佳血清稀释度选用1∶50，最佳抗原包被浓度为15亿菌/ml的细菌浓度(其蛋白含量为4.75μg/ml)。二抗为辣根过氧化物酶标(HRP)羊抗大鼠IgG。OD492/630为0.444为阴阳性临界值，确定血清样品的P/N值(阳性血清OD值/阴性血清OD值)≥2.1且临界值≥0.444即为阳性；反之判为阴性。标准曲线及回归方程的建立以每份血清按1∶50稀释时的OD492/630值为横坐标，以相应的ELISA效价倒数的对数为纵坐标，作散点图，得出标准曲线及回归方程。检测盒适用于微囊化大肠杆菌口服疫苗免疫过后的动物，可针对其机体所产生的特异性免疫抗体进行检测。本检测盒所用试剂均为市售产品。
(2)阳性血清的制备：选用健康无免疫家兔3只，按100亿菌/ml的全菌抗原(含弗氏完全佐剂)皮下注射1ml免疫，间隔7天后加强免疫全菌抗原(含弗氏不完全佐剂)2ml。末次注射后14天后采用玻板凝集法试血，效价达标后，放血，无菌分离血清，加万分之一柳硫汞，-20℃冻存。
(3)凝集抗原的制备：取二级种子菌液接种营养琼脂平板，37℃培养20-24h，然后用含0.5％甲醛的生理盐水洗下菌苔，4℃10000rpm离心10min洗涤沉淀，重复3次，121℃高压2h破坏表面抗原，调整浓度至30亿菌/ml即为凝集原，用BCA蛋白测定检测方法测定蛋白含量，-4℃冻存。
说明：本检测方法所用的PBS、吐温–20、BSA、辣根过氧化物酶标(HRP)羊抗大鼠IgG、OPD(邻苯二胺)底物溶液等试剂均为市售产品，其中PBS、吐温–20、BSA、OPD(邻苯二胺)底物溶液等产品均购自北京鼎国生物公司，辣根过氧化物酶标(HRP)羊抗大鼠IgG购自中杉金桥。
本检测试检测方法主要用于微囊化致泻型大肠杆菌灭活口服疫苗免疫保护所产生抗体的检测。
实施例2、一种依据上述检测方法制备的用于微囊化大肠杆菌口服疫苗免疫抗体检测的检测试剂盒，应用于微囊化大肠杆菌口服疫苗免疫过后的动物，可针对其机体所产生的特异性免疫抗体进行检测。