技术领域本发明属于化学应用技术领域，具体涉及一种以金黄色葡萄球菌为碳源制备碳点并用于盐酸小檗碱的检测方法。
背景技术：
荧光碳点是继富勒烯、碳纳米管及石墨烯之后最热门的碳纳米材料之一。该种纳米材料克服了传统量子点的某些缺点，不仅具有优良的光学性能与小尺寸特性，而且具有良好的生物相容性，易于实现表面功能化，在生化传感、成像分析、环境检测、光催化技术、金属离子检测及药物载体等领域具有很好的应用潜力。合成方法包括电化学法，水热法，微波法，超声法等。目前，实现均匀合成碳点仍然有一定的困难。本发明旨在利用较为均匀的金黄色葡萄球菌为碳源，以合成均匀性更好的碳点。盐酸小檗碱是一种异喹啉生物碱，具有抗菌、镇痛、抗氧化、抗结核、抗肿瘤活性，在药物化学领域有广泛的应用。其定量检测是实现其应用的基础，现已建立测定盐酸小檗碱的方法有化学发光法，荧光分光光度法，液相色谱法，毛细管电泳法，电化学分析法等。本发明基于新合成的碳点为荧光探针，建立了测定盐酸小檗碱的方法。方法具有线性范围宽，选择性高等特征。
技术实现要素：
本发明目的在于提出一种利用较为均匀的金黄色葡萄球菌为碳源，结合水热法合成技术制备均匀性良好的碳点的方法并将其用于检测盐酸小檗碱。该方法具有操作简单、线性范围宽、选择性高等特征，能用于实际样品中盐酸小檗碱的定量检测。为实现上述目的，本发明的实施方案为：一种以金黄色葡萄球菌制备碳点的方法，是以金黄色葡萄球菌为碳源利用水热法合成碳点粗溶液，碳点粗溶液经处理后得到碳点溶液。所述合成的碳点平均粒径为1.6nm，具有荧光特性，最大激发波长为350nm，最大发射波长为440nm。所述以金黄色葡萄球菌为碳源利用水热法合成碳点粗溶液的方法是，将金黄色葡萄球菌置于超纯水中，再将混合液置于水热反应釜中，将反应釜放入鼓风干燥箱中，温度设定为200℃，反应12小时；待反应釜冷却至室温，再将溶液移出反应釜，得到碳点粗溶液。所述碳点粗溶液的处理方法是，将得到的碳点粗溶液分别置于离心管里高速离心，再将得到的上层清液过滤处理，得到黄色透明的碳点溶液。所述高速离心转速为10000R/min，离心时间10min。所述过滤处理是用真空抽滤装置进行减压过滤。作为优化，真空抽滤所用滤膜孔径为0.2μm。本发明所合成的碳点平均粒径为1.6nm，具有荧光特性，最大激发波长为350nm，最大发射波长为440nm。本发明还提供一种如上述方法制备的碳点检测检测盐酸小檗碱的方法，包括：（1）在碳点溶液中加入盐酸小檗碱，反应后，检测碳点溶液的荧光猝灭值；（2）根据盐酸小檗碱溶液浓度与碳点溶液的荧光猝灭值的关系，即可检测出溶液中盐酸小檗碱的量。所述盐酸小檗碱的溶液浓度与碳点溶液的荧光猝灭值的关系为：式中，为荧光强度变化值，c为盐酸小檗碱的溶液浓度。所述盐酸小檗碱溶液浓度的检测限为7.03×10-8molL-1。本发明所合成的碳点均匀性良好，通过盐酸小檗碱对碳点的荧光具有猝灭的性质来进行定量检测，所用的碳点溶液不需要进行进一步的表面修饰和纯化。通过该方法，可以检测盐酸黄连素药品中盐酸小檗碱的含量。本方法具有比较高的选择性，操作简便，在药品安全检测方面有着重大意义和广泛的应用前景。附图说明图1是本发明实施例制备的碳点溶液的荧光光谱图。图2是本发明实施例制备的碳点溶液的TEM图。图3是本发明实施例制备的碳点TEM中粒径分布图。图4是2.5×10-5M的其他物质对本发明实施例制备的碳点溶液荧光的猝灭程度的柱状图。图5是本发明实施例制备的碳点溶液检测不同浓度的盐酸小檗碱的荧光强度变化图。具体实施方式下面给出本发明的实施例，旨在进一步详细说明本发明。（1）金黄色葡萄球菌的培养与提取牛肉膏蛋白胨培养基的成份：牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,氯化钠5.0g,蒸馏水950mL，pH=7.2-7.4。准确称取配方中的各药品，逐一加到含有950mL蒸馏水的烧杯中，加热使之充分溶解，滴加氢氧化钠调节pH至7.2-7.4，放置冷却。量取20mL培养液到三角瓶中，用棉塞包扎。将待灭菌的培养液放入灭菌锅内，于121℃灭菌25min。将灭菌的培养液置于无菌工作台中，打开紫外灯灭菌2h。严格按照无菌要求，将金黄色葡萄球菌接种到培养基中，最后37℃培养48h。取一瓶上述培养的金黄色葡萄球菌，分装于4个5mL的离心管里，以10000R/min的速度离心10min；离心结束后取沉淀，此时金黄色葡萄菌以固体形式沉淀于离心管底部；将每个离心管中的金黄色葡萄球菌分别与2mL超纯水混合，得到提取的金黄色葡萄球菌溶液。(1)碳点的制备将4个离心管中的金黄色葡萄球菌溶液置于一个反应釜中，加2mL超纯水至最终体积为10mL，将反应釜放入鼓风干燥箱中，温度设定为200℃，反应12小时；待反应釜冷却至室温，再将溶液移出反应釜，得到碳点粗溶液，将碳点粗溶液先离心，再用孔径0.2μm的滤膜真空减压过滤得到碳点溶液。如图1所示，最大激发波长为350nm，最大发射波长为440nm。并对碳点的形貌等进行了TEM表征，如图2所示，合成的碳点分散性好，且较为均匀。粒径分布结果(如图3)表明碳点大小在1.6nm左右。(2)碳点用于盐酸小檗碱检测的条件优化碳点与盐酸小檗碱的反应时间及反应体系的pH值对盐酸小檗碱的检测有较大的影响，主要从其对荧光强度的改变值的影响进行考察。盐酸小檗碱与碳点的反应时间对盐酸小檗碱的检测有影响，探究了反应时间在10-70min内荧光强度的改变值，当反应时间达到30min时，荧光值达到最低之后逐渐趋于稳定，所以选用30min为最佳的检测时间。体系的pH值对盐酸小檗碱的检测有影响，用Britton-Robinson缓冲溶液控制酸度，探究了pH值分别为1.81,2.87,3.78,4.78,5.72,6.80时对检测盐酸小檗碱的影响，在pH为2.87时荧光强度改变值达到最大，所以选用最优的pH2.87。(3)碳点对盐酸小檗碱检测的选择性探讨取18支2.0mL离心管，标上A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、Q、R号，分别向A-R号18只离心管里加入1.0mL碳点溶液，200μLBritton-Robinson缓冲溶液(pH2.87)，再向离心管中依次加入200μL蒸馏水和200μL2.5×10-4molL-1分别含盐酸小檗碱，L-胱氨酸，氨基乙酸，L-组氨酸，L-精氨酸，丙氨酸，DL-天冬氨酸，L-酪氨酸，DL-苏氨酸，DL-蛋氨酸，Ca2+，Na+，Ni+，K+，Zn2+，Co2+，Mn2+的溶液，最后加二次蒸馏水定容至2.0mL，反应30min后，将离心管中溶液依次在荧光分光光度计中测试体系的荧光光谱，并与空白溶液的荧光光谱进行比较，分别计算各荧光强度的改变值(图4)。结果表明，常见的氨基酸和阴离子对检测盐酸小檗碱的影响很小，说明该探针对盐酸小檗碱的检测具有较高的选择性。(4)碳点对盐酸小檗碱检测的分析参数取10支2.0mL的离心管，分别标上A、B、C、D、E、F、G、H、I、J号，向A-J号10支离心管中加入1.0mL碳点溶液和200μLBritton-Robinson缓冲溶液(pH2.87)，再向离心管中依次加入200μL，浓度分别为0、1.0×10-6、1.0×10-5、2.5×10-5、5.0×10-5、7.5×10-5、1.0×10-4、2.5×10-4、5.0×10-4、7.5×10-4的盐酸小檗碱溶液，最后加入二次蒸馏水定容至2.0mL，待反应一段时间后，将各个离心管中的溶液依次在荧光分光光度计中测试，记录碳点在不同浓度的盐酸小檗碱存在下的荧光光谱，结果见图5，与空白溶液的荧光光谱对照，计算强度变化值()，与盐酸小檗碱浓度(c)之间的定量关系为：。(5)碳点应用于实际样品中盐酸小檗碱的检测根据=3.79×106c+16.02，按照上述检测盐酸小檗碱溶液浓度的方法，将盐酸小檗碱溶液换做实际样品复方黄连素片，对复方黄连素片中盐酸小檗碱的含量进行了测定，结果见表1。检测结果表明，复方黄连素中盐酸小檗碱的含量为29.89mg/片，与标示量30.00mg/片接近，RSD=0.37%。结果表明，该方法可实现对实际样品复方黄连素中盐酸小檗碱含量的测定。还需要说明的是，本发明的具体实施例只是用来示例性说明，并不以任何方式限定本发明的保护范围，本领域的相关技术人员可以根据上述一些说明加以改进或变化，但所有这些改进和变化都应属于本发明权利要求的保护范围。