本发明涉及一种快速高效检测水产品中甲砜霉素对映体的方法。
背景技术：
甲砜霉素系氯霉素类广谱抗生素，其抗菌谱与氯霉素基本相似，属于广谱抗生素，对流感杆菌、脑膜炎球菌和淋球菌在低浓度时具有更强大的杀菌作用，许多肠杆菌科细菌，如大肠杆菌、普鲁威登菌属、产气杆菌、克雷伯菌属、阴沟肠杆菌、伤寒杆菌及沙门菌属、沙雷氏菌等均对此敏感；革兰氏阴性菌如白喉杆菌、李斯德菌属、炭疽杆菌、肺炎球菌、链球菌属大多数敏感，各种厌氧球菌、杆菌包括脆弱类杆菌、梅毒螺旋体、钩端螺旋体、支原体、衣原体、立克次体对该品也敏感。
目前已在水产养殖中使用用以抗菌，由于水产品会吸收该类药物，使得水产品体内会带有该药物，检测方法较难。
目前手性药物对映体的常用分离方法有结晶法、动力学方法、酶拆分法和色谱法等，这些方法应用广泛，促进了手性药物的研究和发展。然而，这些方法也存在一些不足之处，如结晶法操作繁琐、分离时间长、适用性窄，酶拆分法对酶的专一性有较高要求，分离成本较高，而色谱拆分法是目前应用最广泛的一种方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于为了解决现有结晶法检测甲砜霉素对映体成本高、分离时间长，适用性窄，操作复杂，精度不高的缺陷而提供一种快速、精度高，操作简单、成本较低的检测水产品中甲砜霉素对映体的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种检测水产品中甲砜霉素对映体的方法，包括以下步骤：
1)用体积比90％：10％的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将甲砜霉素溶解并稀释配置成40-50μg/mL的溶液，并用微孔滤膜过滤；
2)取匀浆后的水产品置于离心管中，加入步骤1)配置的甲砜霉素溶液，料液比为1g：120-150mL，振荡后加入无水硫酸铜及聚乙二醇，8000-12000rpm离心处理10-15min，取上清液，残渣用聚乙二醇溶解并离心处理，合并上清液备用；
3)在步骤2)的上清液中加入上清液体积2-3倍的正己烷溶液，静置分层后弃正己烷层，将剩余溶液过柱萃取，萃取完成后用去离子水淋洗，负压抽干，分2-5次洗脱，洗脱后的溶液在氮吹仪内于30-35℃水浴中，氮气吹干，残余物用乙醇复溶，微孔纳滤，滤液备用；
4)采用高效液相色谱仪对步骤3)得到的滤液进行检测；检测时选用CHIRALCEL OD-H手性柱，该手性柱的填料为5μ硅胶表面涂布纤维素-L-异亮氨酸。在本技术方案中，本发明所用的萃取方法效果好，时间短，降低了试剂的消耗量。
作为优选，步骤3)中，依次用甲基叔丁基醚、二对甲苯甲酰-l-酒石酸，含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱。
作为优选，水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为5-6.5％，柠檬酸铁铵的质量分数为0.4-0.7％。
作为优选，步骤3)洗脱液为含体积分数15％的甲醇溶液，过柱的流速为6-9mL/min，洗脱液流速为1.2-1.5mL/min。
作为优选，纤维素-L-异亮氨酸的制备方法为：将纤维素纤维放入45-55℃的质量分数为25-30％的氢氧化钾溶液中，然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物，55-85kw的功率下超声处理20-30min，然后升温至150℃，加入纤维素纤维质量10倍的L-异亮氨酸，反应2-4h，冷却后水洗，用醋酸中和至中性。
作为优选，纤维素纤维为粘胶纤维或棉纤维。
作为优选，无水硫酸铜的加入量为水产品的质量的3倍，聚乙二醇的加入量为1g水产品加入20mL。
作为优选，高效液相色谱的条件为：色谱柱：CHIRALCEL OD-H；流动相：正己烷-乙醇(20:80，v/v，乙醇中含有体积比为0.4％的冰乙酸和0.5％的三乙胺)；流速：0.7mL/min；检测波长：294nm；进样量：20μL；柱温：25℃。
本发明的有益效果是本发明对固相萃取条件进行了优化，使得固相萃取的时间缩短、效率变高，而高效液相色谱方法分析甲砜霉素对映体的浓度精度高，速度快，操作简单、成本较低；检测方法对目标化合物的线性关系好，回收率高，相对偏差小，使用的试剂低毒，使用量少，对环境友好。
附图说明
图1为实施例1的色谱图。
图中，1为左甲砜霉素；2为右甲砜霉素。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明做进一步的描述。
在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
高效液相色谱仪Agilent 1200购自安捷伦(中国)科技有限公司；水浴氮吹仪WD-12购自河南天驰仪器设备有限公司；固相萃取仪HSE-12B购自天津市恒奥科技发展有限公司；固相萃取柱Waters Oasis HLB购自杭州伽钛科学仪器有限公司；冰乙酸(分析纯)、三乙胺(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司；甲砜霉素购自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司。
高效液相色谱的条件为：色谱柱：CHIRALCEL OD-H；流动相：正己烷-乙醇(20:80，v/v，乙醇中含有体积比为0.4％的冰乙酸和0.5％的三乙胺)；流速：0.7mL/min；检测波长：294nm；进样量：20μL；柱温：25℃。
实施例1
一种检测水产品中甲砜霉素对映体的方法，包括以下步骤：
1)用体积比90％：10％的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将甲砜霉素溶解并稀释配置成50μg/mL的溶液，并用微孔滤膜过滤；
2)取匀浆后的水产品置于离心管中，加入步骤1)配置的甲砜霉素溶液，料液比为1g：150mL，振荡后加入无水硫酸铜及聚乙二醇，12000rpm离心处理15min，取上清液，残渣用聚乙二醇溶解并离心处理，合并上清液备用；无水硫酸铜的加入量为水产品的质量的3倍，聚乙二醇的加入量为1g水产品加入20mL；
3)在步骤2)的上清液中加入上清液体积3倍的正己烷溶液，静置分层后弃正己烷层，将剩余溶液过柱萃取，萃取完成后用去离子水淋洗，负压抽干，分5次洗脱，洗脱液为含体积分数15％的甲醇溶液，洗脱液流速为1.5mL/min，洗脱后的溶液在氮吹仪内于35℃水浴中，氮气吹干，残余物用乙醇复溶，微孔纳滤，滤液备用；依次用甲基叔丁基醚、二对甲苯甲酰-L-酒石酸，含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱；水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为6.5％，柠檬酸铁铵的质量分数为0.7％；过柱的流速为9mL/min；
4)采用高效液相色谱仪对步骤3)得到的滤液进行检测；检测时选用CHIRALCEL OD-H手性柱，该手性柱的填料为5μ硅胶表面涂布纤维素-L-异亮氨酸。
纤维素-L-异亮氨酸的制备方法为：将粘胶纤维或棉纤维放入55℃的质量分数为30％的氢氧化钾溶液中，然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物，85kw的功率下超声处理30min，然后升温至150℃，加入纤维素纤维质量10倍的L-异亮氨酸，反应4h，冷却后水洗，用醋酸中和至中性。
实施例2
一种检测水产品中甲砜霉素对映体的方法，包括以下步骤：
1)用体积比90％：10％的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将甲砜霉素溶解并稀释配置成40μg/mL的溶液，并用微孔滤膜过滤；
2)取匀浆后的水产品置于离心管中，加入步骤1)配置的甲砜霉素溶液，料液比为1g：120mL，振荡后加入无水硫酸铜及聚乙二醇，8000rpm离心处理10min，取上清液，残渣用聚乙二醇溶解并离心处理，合并上清液备用；无水硫酸铜的加入量为水产品的质量的3倍，聚乙二醇的加入量为1g水产品加入20mL；
3)在步骤2)的上清液中加入上清液体积2倍的正己烷溶液，静置分层后弃正己烷层，将剩余溶液过柱萃取，萃取完成后用去离子水淋洗，负压抽干，分2次洗脱，洗脱液为含体积分数15％的甲醇溶液，洗脱液流速为1.2mL/min，洗脱后的溶液在氮吹仪内于30℃水浴中，氮气吹干，残余物用乙醇复溶，微孔纳滤，滤液备用；依次用甲基叔丁基醚、二对甲苯甲酰-L-酒石酸，含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱；水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为5％，柠檬酸铁铵的质量分数为0.4％；过柱的流速为6mL/min；
4)采用高效液相色谱仪对步骤3)得到的滤液进行检测；检测时选用CHIRALCEL OD-H手性柱，该手性柱的填料为5μ硅胶表面涂布纤维素-L-异亮氨酸。
纤维素-L-异亮氨酸的制备方法为：将粘胶纤维或棉纤维放入45℃的质量分数为25％的氢氧化钾溶液中，然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物，55kw的功率下超声处理20min，然后升温至150℃，加入纤维素纤维质量10倍的L-异亮氨酸，反应2h，冷却后水洗，用醋酸中和至中性。
实施例3
一种检测水产品中甲砜霉素对映体的方法，包括以下步骤：
1)用体积比90％：10％的异丙醇与正庚烷的混合物作为流动相将甲砜霉素溶解并稀释配置成45μg/mL的溶液，并用微孔滤膜过滤；
2)取匀浆后的水产品置于离心管中，加入步骤1)配置的甲砜霉素溶液，料液比为1g：130mL，振荡后加入无水硫酸铜及聚乙二醇，9000rpm离心处理12min，取上清液，残渣用聚乙二醇溶解并离心处理，合并上清液备用；无水硫酸铜的加入量为水产品的质量的3倍，聚乙二醇的加入量为1g水产品加入20mL；
3)在步骤2)的上清液中加入上清液体积3倍的正己烷溶液，静置分层后弃正己烷层，将剩余溶液过柱萃取，萃取完成后用去离子水淋洗，负压抽干，分3次洗脱，洗脱液为含体积分数15％的甲醇溶液，洗脱液流速为1.3mL/min，洗脱后的溶液在氮吹仪内于33℃水浴中，氮气吹干，残余物用乙醇复溶，微孔纳滤，滤液备用；依次用甲基叔丁基醚、二对甲苯甲酰-L-酒石酸，含柠檬酸铁铵的水杨酸水溶液活化HLB固相萃取柱；水杨酸水溶液中水杨酸的质量分数为5.4％，柠檬酸铁铵的质量分数为0.5％；过柱的流速为7mL/min；
4)采用高效液相色谱仪对步骤3)得到的滤液进行检测；检测时选用CHIRALCEL OD-H手性柱，该手性柱的填料为5μ硅胶表面涂布纤维素-L-异亮氨酸。
纤维素-L-异亮氨酸的制备方法为：将粘胶纤维或棉纤维放入50℃的质量分数为28％的氢氧化钾溶液中，然后加入纤维素纤维质量2倍的环氧季铵盐化合物和纤维素纤维质量5倍阳离子聚丙烯酰胺类化合物，65kw的功率下超声处理24min，然后升温至150℃，加入纤维素纤维质量10倍的L-异亮氨酸，反应3h，冷却后水洗，用醋酸中和至中性。
分别称取1mg左甲砜霉素、右甲砜霉素，置于100mL容量瓶中，用空白海水定容，超声摇匀后，实施例1的步骤经高效液相色谱仪检测后，所得色谱图示于图1。
甲砜霉素对映体浓度在0.04mg/L-10mg/L范围内与其响应值呈良好的线性关系。以X表示浓度，Y表示甲砜霉素对映体峰面积，左甲砜霉素和右甲砜霉素的回归方程及相关系数分别为y＝113.93x-7.2217、R2＝0.9994及y＝117.71x-9.9342、R2＝0.9998。在空白海水中添加0.1mg/L、5mg/L和15mg/L这3个浓度的甲砜霉素标准溶液，按本方法进行回收率实验。每个添加浓度平行操作3次，计算回收率和精密度，左甲砜霉素及右甲砜霉素的样品平均回收率分别为88.53％和89.26％，日间精密度分别为分别为5.71％和4.25％，定量限均为0.04mg/L。