结构光照明的双光子荧光显微系统与方法与流程

文档序号:12357904阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种结构光照明的双光子荧光显微系统,其特征在于:包括飞秒激光器(1)、电光强度调制器(2)、扩束镜(3)、相位调制器(4)、扫描模块、扫描镜(9)、场镜(10)、二色镜(11)、物镜(12)、Z向扫描台(13)、样品架(14),三轴平移台(15)、滤光片(16)、第三透镜(17)和光电倍增管(18);电光强度调制器(2)、扩束镜(3)和相位调制器(4)沿飞秒激光器(1)发出的光束依次布置在飞秒激光器(1)前方,飞秒激光器(1)发出的飞秒激光束经电光强度调制器(2)功率调制、扩束镜(3)扩束和相位调制器(4)相位调制后入射到扫描模块中,扫描模块的出射光依次经扫描镜(9)、场镜(10)、二色镜(11)和物镜(12)后照射到样品架(14)的样品上,物镜(12)安装在Z向扫描台(13)上,样品架(14)安装在三轴平移台(15)上;样品被激发出的荧光经物镜(12)收集并由二色镜(11)反射,再依次经滤光片(16)、第三透镜(17)入射到光电倍增管(18)中,光电倍增管(18)连接解调模块,通过解调模块解调出所需信号。

2.根据权利要求1所述的一种结构光照明的双光子荧光显微系统,其特征在于:所述的扫描模块包括同轴布置的第一振镜(5)、第一透镜(6)、第二透镜(7)和第二振镜(8),四个光学器件构成4f系统。

3.根据权利要求1所述的一种结构光照明的双光子荧光显微系统,其特征在于:所述的解调模块包括NI采集卡(19)和主控计算机(20),扫描模块和光电倍增管(18)均与NI采集卡(19)连接,NI采集卡(19)和Z向扫描台(13)连接到主控计算机(20)。

4.根据权利要求1所述的一种结构光照明的双光子荧光显微系统,其特征在于:所述的解调模块包括同轴布置的平板玻璃(21)、聚焦镜(22)、小孔(23)和光电二极管(24)以及用于解调的锁相放大器(25)、NI采集卡(19)和主控计算机(20),平板玻璃(21)安装在所述相位调制器(4)和所述扫描模块之间,经相位调制器(4)相位调制后的光束经平板玻璃(21)发生透射和反射,接着依次经同轴布置的第聚焦镜(22)、小孔(23)后入射到光电二极管(24),光电二极管(24)和光电倍增管(18)均连接到锁相放大器(25),扫描模块经NI采集卡(19)后和Z向扫描台(13)一起连接到主控计算机(20)。

5.一种结构光照明的双光子荧光显微方法,其特征在于采用权利要求1-4任一所述系统,并采用以下步骤:

(1)飞秒激光器(1)发出脉冲激光光束;

(2)依次经电光强度调制器(2)调制出射功率、扩束镜(3)准直扩束后入射到相位调制器(4),经相位调制器(4)后,光束在空间上被分为两束,两束光在圆形光束约束下形状互补、面积相等,第一光束与第二光束强度相同;

(3)两束光经扫描模块后入射到扫描镜(9),再依次经场镜(10)、二向色镜(11)和物镜(12)后到达样品架(14)上的样品,样品架上的样品被激发出荧光;

(4)样品被激发出来的荧光依次再经过物镜(12)收集、二向色镜(11)反射、滤光片(16)过滤和第三透镜(17)聚焦后进入光电倍增管(18)中,物镜连接有Z向扫描台(13),使得物镜可沿z轴移动;

(5)上述过程(3)中,激光通过扫描模块对样品表面区域进行扫描,探测样品表面被激发出的荧光信号,通过Z向扫描台(13)调整物镜沿光束方向的位置对样品不同深度处进行扫描,探测样品不同深度处被激发出的荧光信号,荧光信号被光电倍增管(18)收集并通过解调处理后即获得样品不同深度处的荧光显微图像。

6.根据权利要求5所述的一种结构光照明的双光子荧光显微方法,其特征在于:所述的步骤(5)中,样品表面显微信号和样品深度显微信号经NI采集卡(19)发送到主控计算机(20)中,主控计算机(20)接收信号进行傅里叶变换处理,根据相位调制器(4)预先设定的调制频率进行滤波,解调出所需信号进行显微成像。

7.根据权利要求5所述的一种结构光照明的双光子荧光显微方法,其特征在于:在相位调制器(4)和所述扫描模块光路之间平板玻璃(21)使得光束反射,反射光束再依次经聚焦镜(22)、小孔(23)后入射到光电二极管(24)中,光电二极管(PD)(24)采集获得参考光信号,参考光信号、样品表面显微信号和样品深度显微信号一起输入到锁相放大器(25)进行解调。

8.根据权利要求5所述的一种结构光照明的双光子荧光显微方法,其特征在于:所述的扫描模块光路包括同轴布置的第一振镜(5)、第一透镜(6)、第二透镜(7)和第二振镜(8),经相位调制器(4)相位调制后的光束经第一振镜(5)反射偏转角度后,依次经第一透镜(6)和第二透镜(7)后入射到第二振镜(8),再经第二振镜(8)反射偏转角度后入射到所述扫描镜(9),主控计算机(20)发送电机控制信号经NI采集卡(19)发送到所述扫描模块光路的第一振镜(5)和第二振镜(8)进而控制扫描探测;主控计算机(20)发送控制信号到物镜扫描台(13),控制物镜的移动。

9.根据权利要求5所述的一种结构光照明的双光子荧光显微方法,其特征在于:所述样品固定于载玻片上,并由样品架夹持,样品架固定在三轴平移台上,通过三轴平移台调节样品的空间位置。

10.根据权利要求5所述的一种结构光照明的双光子荧光显微方法,其特征在于:所述的相位调制器(4)包括同轴依次布置的半波片、电光相位调制器、沿水平方向并排拼接的两个偏振分光镜和一片偏振片,进入相位调制器(4)的光束经半波片偏振方向旋转角度后入射到电光相位调制器,电光相位调制器将光束分解成水平方向和竖直方向的两个偏振分量,再入射到两个偏振分光镜拼接形成端面的中间使得调制的光束透过,然后经偏振片(7)形成一路含偏振方向一致的两束光的光束。

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