一种基于碳量子点检测大肠杆菌含量的荧光分光光度法的制作方法

本发明涉及一种大肠杆菌的荧光分光光度检测法，尤其是涉及一种利用碳量子点对大肠杆菌含量进行快速检测的荧光分光光度法。

背景技术：

大肠杆菌是水体污染程度的重要指示菌，是肠道中最普遍、数量最多的一类细菌，近年来，由于大肠杆菌引发的食品安全事件层出不穷，每年由大肠杆菌引发的病例多达6.4亿，在我国，大肠杆菌是引起我国居民腹泻的首要病源，环境中的大肠杆菌己经成为人类病原存在的一个重要指标,成为环境保护、食品卫生、饮水卫生和流行性病学领域中最重要的研究对象之一。饮用水或食物中的大肠杆菌可引发霍乱、伤寒、痢疾等肠道疾病。因此快速准确的检测大肠杆菌的数量在环境水质监测与食品安全中有着重大的意义。

目前大肠杆菌检测的技术包括：平板计数法、PCR、基因芯片、生物传感器、紫外可见分光光度检测法、胶体金免疫侧吸检测试纸条、脉冲场凝胶电泳分析、乳胶凝集试验等，以上的检测方法各有利弊，常规培养检测法耗时且工作量大，新兴的检测技术对仪器设备操作等要求较高，并且一些检测灵敏度受到限制，分子生物学方法，如PCR存在不能区分死菌或者活菌的缺陷，使检测结果具有假阴性。

碳量子点是近年来发现的以碳为骨架结构的新型纳米材料，是一种分散的、尺寸小于10nm的类球形的纳米颗粒。由于碳量子点不仅表现出极好的荧光性、强的稳定性、很好的耐光性、耐漂白性好、可调控的发射波长等优越的荧光性能，还拥有较低的毒性、很好的生物相容性、较低的相对分子量和极小的颗粒粒径等特点，因此在替代传统的荧光染料和量子点而应用于光学、生命科学上的研究中很有发展前景。

如能基于碳量子点研究一种快速、简单、高灵敏的检测方法，将会有十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明的发明目的在于克服现有大肠杆菌检测技术的缺陷，提供一种灵敏度高，操作简便的基于碳量子点检测大肠杆菌含量的荧光分光光度法。

本发明为实现上述发明目的，采用的技术方案是：

提供一种基于碳量子点检测大肠杆菌含量的荧光分光光度法，包括以下步骤：

(1)利用碳化法制备碳量子点：配置蔗糖溶液，超声使其完全溶解后，逐滴加入浓硫酸并剧烈搅拌，蔗糖的质量与浓硫酸的体积比为1:1～1:1.5g/ml，最后加入蒸馏水，待恢复常温后于5000～12000rpm下离心2～10min，取上清，加入饱和NaOH溶液中和过量的酸，得亲水性碳量子点，备用；

(2)制备大肠杆菌选择性培养基：按配方将各组分溶解定容，各组分配方组成：乳糖：10～26g/L，蛋白胨：15～25g/L，牛胆盐：1～7g/L，羧甲基纤维素钠：0.01～0.90g/L，氯化钠:2～7g/L，磷酸氢二钾：2.5～7.5g/L，灭菌备用；

(3)制备待测样品检测体系，测定待测样品的荧光值：取待测样品接种到上述步骤(2)的大肠杆菌选择性培养基中，25～44℃，150～280rpm，培养7～15h，加入步骤(1)制备好的碳量子点混匀备用，将上述混合后的溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定350nm和410nm激发波长时最大发射波长的荧光强度值；

(4)基于测得的待测样品的350nm和410nm激发波长时最大发射波长的荧光强度值比值，根据350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光值比值和大肠杆菌初始浓度关系标准曲线求得样品中大肠杆菌的含量。

进一步地，所述步骤(1)蔗糖溶液中蔗糖和蒸馏水的质量比为1:1～1:3。

进一步地，所述步骤(1)碳量子点制备中滴加浓硫酸反应过程中无黑色沉淀生成。

进一步地，所述步骤(1)合成的碳量子点发绿色荧光，且在pH＝4到7的范围内，其在350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光强度值比值的对数值Log[I_(F410)/I_(F350)]与pH呈线性关系，如图2。

进一步地，所述步骤(2)中选择性培养基的灭菌条件应为115℃，15min。

进一步地，步骤(3)中碳量子点的用量为每4ml待测样品中加入1ml～2ml碳量子点。

进一步地，上述检测方法所适用的待测样品中大肠杆菌的浓度为10cfu/ml～150000cfu/ml。

按上述方案，所述荧光强度值和大肠杆菌初始浓度关系标准曲线的获得方法如下：

a.配制一系列浓度的大肠杆菌溶液样品；

b.将不同浓度的大肠杆菌溶液样品接种到大肠杆菌选择性培养基中，25-44℃，150-280rpm，培养7-15h，加入步骤(1)制备好的碳量子点，混匀备用，将上述混合后的溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光强度值，计算得到两者的比值I_(F410)/I_(F350)：

c.拟合得到350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光强度值比值的对数值和大肠杆菌初始浓度对数值关系标准曲线c(x，y)——x大肠杆菌初始浓度的对数值，y为350nm和410nm激发波长时最大发射波长的荧光强度值比值的对数值。

进一步地，所述350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光强度值比值的对数值和大肠杆菌初始浓度关系标准曲线中一系列大肠杆菌溶液样品的浓度范围是：13.3cfu/ml～133000cfu/ml。

进一步地，所述一系列大肠杆菌样品的制备方法为：大肠杆菌接种于LB培养基中，25～44℃，150～280rpm，培养5～10h后，进行平板计数，求出每毫升大肠杆菌的数目；用灭菌的生理盐水按比例稀释成10cfu/ml～150000cfu/ml范围内的9个不同浓度梯度的大肠杆菌溶液样品。

本发明的原理是：一定范围内不同浓度的大肠杆菌接种到所述大肠杆菌选择性培养基上培养一定的时间后，加入上述制备好的碳量子点，用荧光分光光度计检测其荧光值，发现在350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光强度值比值的对数值Log[I_(F410)/I_(F350)]与大肠杆菌浓度的对数值呈现一定的线性关系，由此进行大肠杆菌浓度的测定。

本发明的优点：快速准确，灵敏度高，其测定大肠杆菌的检出限可达10cfu/ml。操作简便，适合测定含大肠杆菌的各种试样如牛奶，废水等，在环境检测及食品分析等方面具有十分重要的意义。

附图说明

图1中是350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光强度值比值的对数值和大肠杆菌初始浓度对数值关系标准曲线。图中410nm和350nm激发下最大发射波长的荧光值比值的对数Log[I_(F410)/I_(F350)]和大肠杆菌初始浓度的对数值Log[E.coli(cfu/mL)]的线性关系式是y＝a+bx，R²＝99.486％。其中a的值是0.45726，b的值是-0.05962，y＝0.45726-0.05962x，x为大肠杆菌初始浓度对数值，y为大肠杆菌菌液混合碳量子点后分别在410nm和350nm激发下最大发射波长处的荧光强度值比值的对数Log[I_(F410)/I_(F350)]。

图2中是碳量子点350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光强度值比值的对数值与pH的关系曲线。图中410nm和350nm激发下最大发射波长处的荧光强度值比值的对数Log[I_(F410)/I_(F350)]和pH的线性关系式是y＝a+bx，R²＝98.626％。其中a的值是-0.12494，b的值是0.0884，y＝0.0884x-0.12494，x为缓冲溶液的pH值，y为碳量子点在缓冲液中分别在410nm和350nm激发下最大发射波长处的荧光强度值比值的对数。

图3和图4分别是所制备的碳量子点的XRD和FTIR图。

具体实施方式

为更好理解本发明，以下结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

实施例1：

大肠杆菌选择性培养基的制备：按配方将各组分溶解定容，各组分配方组成：乳糖：10g/L，蛋白胨：15g/L，牛胆盐：1g/L，羧甲基纤维素钠：0.04g/L，氯化钠:2g/L，磷酸氢二钾：2.5g/L，灭菌备用；

碳量子点的制备：配置蔗糖溶液(蔗糖和蒸馏水的质量比为1:1)，超声使其完全溶解后，逐滴加入浓硫酸(蔗糖的质量与浓硫酸的体积比为1:1g/ml)并剧烈搅拌，最后加入蒸馏水，待恢复常温后于5000rpm下离心10min，取上清，加入饱和NaOH溶液中和过量的酸，备用；

用紫外光照射上述制备的碳量子点，可见发绿色荧光。碳量子点的XRD图见图3，由图分析可得：在2θ＝20°-23°的范围内有一宽化的峰，该峰和碳的(002)晶面一致，暗示了碳的无定形特征。碳量子点的FTIR图见图4，由图分析可得：碳点表面富含羟基和羧基。这些基团都是亲水基团，从而使得碳量子点具有良好的水溶性。

经实验分析：上述碳量子点410nm和350nm激发下最大发射波长处的荧光强度值比值的对数Log[I_(F410)/I_(F350)]和pH呈良好的线性关系曲线。结果见图2。

基于碳量子点检测大肠杆菌的荧光分光光度法，步骤如下：

(1)荧光强度值和大肠杆菌初始浓度关系标准曲线的获得：

a.配制一系列浓度的大肠杆菌溶液：

大肠杆菌接种于LB培养基中，37℃，225rpm，培养6h后，进行平板计数，求出大肠杆菌的浓度为1.33×10⁷cfu/ml；

用灭菌的生理盐水按比例稀释成浓度梯度为1.33×10⁵cfu/ml、6.65×10⁴cfu/ml、1.33×10⁴cfu/ml、6.65×10³cfu/ml、1.33×10³cfu/ml、6.65×10²cfu/ml、1.33×10²cfu/ml、66.5cfu/ml、13.3cfu/ml的大肠杆菌溶液；

b.将不同浓度的大肠杆菌溶液样品4mL接种到选择性培养基中，37℃，225rpm，培养13h，加入1ml制备好的碳量子点，混匀备用，将上述混合后的溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光强度值，计算得到两者的比值I_(F440)/I_(F350)：

c.拟合得到350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光强度值比值的对数值和大肠杆菌初始浓度对数值关系标准曲线c(x，y)——x大肠杆菌初始浓度的对数值，y为350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光强度值比值的对数值，见图1。

(2)定量检测废水样品中的大肠杆菌：取待测样品4mL接种到上述选择性培养基中，37℃，225rpm，培养13h，加入1ml制备好的碳量子点混匀备用，将上述混合后的溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光强度值；基于测得的待测样品的350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光强度值比值，根据350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光值强度值比值的对数值和大肠杆菌初始浓度关系标准曲线求得样品中大肠杆菌的含量。

经检测，废水样品中大肠杆菌含量分别为61cfu/ml，对照采用平板计数法检测结果为66cfu/ml，证明本方法可靠。

实施例2

大肠杆菌选择性培养基的制备：按配方将各组分溶解定容，各组分配方组成：乳糖：26g/L，蛋白胨：25g/L，牛胆盐：7g/L，羧甲基纤维素钠：0.90g/L，氯化钠:7g/L，磷酸氢二钾：7.5g/L，灭菌备用；

碳量子点的制备：配置蔗糖溶液(蔗糖和蒸馏水的质量比为1:3)，超声使其完全溶解后，逐滴加入浓硫酸(蔗糖的质量与浓硫酸的体积比为1:1.5g/ml)并剧烈搅拌，最后加入蒸馏水，待恢复常温后于12000rpm下离心2min，取上清，加入饱和NaOH溶液中和过量的酸，备用；

基于碳量子点检测大肠杆菌的荧光分光光度法，步骤如下：

(1)荧光强度值和大肠杆菌初始浓度关系标准曲线的获得如实施例1；

(2)定量检测牛奶样品中的大肠杆菌：取待测样品4ml接种到上述选择性培养基中，37℃，225rpm，培养12h，加入2ml制备好的碳量子点混匀备用，将上述混合后的溶液置于石英比色皿中，用荧光分光光度计测定350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光强度值；基于测得的待测样品的350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光强度值比值，根据350nm和410nm激发波长时最大发射波长处的荧光强度值比值的对数值和大肠杆菌初始浓度关系标准曲线求得样品中大肠杆菌的含量。

经检测，牛奶样品中大肠杆菌含量分别为11cfu/ml，对照采用平板计数法检测结果分别为13cfu/ml，证明本方法可靠。