代谢组学方法对二噁英类化合物的毒性作用进行评估与流程

本发明是污染物毒性评价及评估的方法，具体地说是通过相同毒性当量的不同种类的二噁英短期处理人肝癌细胞，通过对代谢组分的检测分析及后续的数据处理、代谢路径分析，对二噁英类化合物进行毒性评估。该方法通过细胞内代谢物的代谢响应及干扰的代谢路径定位，对污染物的毒性作用进行评估，是二噁英毒性作用评价的一种新方式。

背景技术：

二噁英是一类严重威胁人类健康和生态环境的持久性有机污染物。它们遍布于世界上包括空气、土壤、水、沉淀物和食物(尤其是奶制品、肉类和水生有壳动物)在内的所有媒介中[M.Lorber,P.Pinsky,P.Gehring,C.Braverman,D.Winters,W.Sovocool,Relationships between dioxins in soil,air,ash,and emissions from a municipal solid waste incinerator emitting large amounts of dioxins,Chemosphere,37(1998)2173-2197]，由于其高稳定性、长距离迁移性及脂溶性等特点，在生物放大作用的影响下，造成人类和动物食物源的严重污染，并能够引起人体及动物的多种毒性反应[林海鹏,于云江,李琴,王丽丽,王先良,车飞,二噁英的毒性及其对人体健康影响的研究进展,环境科学与技术,32(2009)]。尤其是近年来，二噁英污染及中毒事件频频发生，极大的推动了二噁英毒理学研究的发展，研究二噁英的毒性作用并进一步探讨其毒性机制对于其生态和人类健康风险评价具有重要意义[杨永滨,郑明辉,刘征涛,二恶英类毒理学研究新进展,生态毒理学报,1(2006)105-115]。代谢组学是近几年发展起来的对某一生物或细胞所有低分子量代谢产物进行定和定量分析的一门新学科，其在毒理学中的运用正日益成为研究的热点[刘.鹏,朴丰源,王艳艳,洪.岩,代谢组学技术及其在毒理学中的应用,大连医科大学学报,30(2008)565-569]。利用小分子代谢物的变化情况来评价环境污染物的毒性作用成为环境毒理学发展的新方向[A.Kortenkamp,Ten Years of Mixing Cocktails:A Review of Combination Effects of Endocrine-Disrupting Chemicals,Environ Health Persp,115(2007)98-105]。到目前为止,细胞尤其是人体细胞是毒理学中使用最广泛和最深入的体外实验系统。和体内模型不同的是,细胞模型更适合小型化和高通量有毒物质筛选平台的使用,提供广泛的、全面的研究毒性的方法。人体细胞作为一种体外毒性评价工具，具有快速、敏感、特异高、条件易控等优点，可以避免使用大批动物进行的长时间毒理研究，不仅可以节省动物及人力投入，还可缩短实验周期，增加实验的敏感性，是目前为止较为理想的毒性分析工具[E.V.Hestermann,J.J.Stegeman,M.E.Hahn,Serum alters the uptake and relative potencies of halogenated aromatic hydrocarbons in cell culture bioassays,Toxicol.Sci.,53(2000)316-325]。

不少研究表明，二噁英可以引发生物体内葡萄糖、氨基酸及尿素等代谢的紊乱[C.Lu,Y.Wang,Z.Sheng,G.Liu,Z.Fu,J.Zhao,X.Yan,B.Zhu,S.Peng,NMR-based metabonomic analysis of the hepatotoxicity induced by combined exposure to PCBs and TCDD in rats,Toxicol Appl Pharmacol,248(2010)178-184]，如对2,3,7,8-TCDD的系统研究表明，2,3,7,8-TCDD可以干扰细胞内多种小分子代谢物，且有的代谢物表现出显著的剂量-效应关系[张保琴,张海军,陈吉平,杨常青,2,3,7,8-TCDD的短期暴露对HepG2肝癌细胞内小分子代谢产物的影响,生态毒理学报,7(2012)292-298.]，因此用小分子代谢物的变化来反馈二噁英的毒性作用是完全可行的，[E.V.Hestermann,J.J.Stegeman,M.E.Hahn,Serum alters the uptake and relative potencies of halogenated aromatic hydrocarbons in cell culture bioassays,Toxicol.Sci.,53(2000)316-325]。

基于此，本专利用相同毒性当量的不同种类二噁英短期处理人肝癌细胞，通过对代谢组分的检测分析及后续的数据处理、代谢路径分析，灵敏准确地定位不同种类二噁英的毒性效应。并比较异同点，对不同种类的二噁英类化合物进行毒性评估。

技术实现要素：

本发明的目的在于发展一种对二噁英类化合物进行快速、高效、准确的毒性评估方法。传统的二噁英类化合物毒性评价是是利用毒性当量因子计算，通过计算二噁英的毒性当量进行毒性评价。另一方面，毒性的评估基于动物实验，评价周期长，且人与动物的亲缘关系比较远，人体细胞在毒理学中的应用越来越广泛，且敏感性高，相对于传统的毒性评价参数，代谢组学指标作为代谢的终点，更能灵敏的指示毒性作用的程度，因此，本发明所采用的技术方案是：

选择相同毒性当量的不同种类的二噁英，对人体细胞进行短期的暴露处理，通过质谱检测细胞内代谢物的种类和含量变化，数据统计和代谢路径分析评估二噁英的毒性作用。

a)选择的人体细胞为人肝癌细胞，暴露时间为24h；

b)代谢物检测分析仪器为UPLC-QTRAP，检测模式为SRM；

c)数据处理采用的是显著性分析、主成分分析、热重分析，代谢路径分析采用的是http://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml中的路径分析程序。

此方法涉及到的人体肝癌细胞为HepG2细胞，此细胞是污染物毒性评价的常用细胞，且在二噁英的毒性评价中较为常用。

步骤a选择的二噁英为2,3,7,8位取代的PCDD和PCDF共计17种；

步骤b中的代谢物分别包括了细胞极性成分和非极性成分两部分；

步骤b中UPLC-QTRAP检测分析方法色谱条件选择C8柱和C18柱，质谱条件分别选择ESI正负离子模式，SRM检测；

步骤a中，选择的二噁英类的污染物的暴露浓度为1nM TEQ；

步骤a中选择的细胞培养液为DMEM培养液；

步骤b中极性代谢物和非极性代谢物全部提取检测；

步骤c中对二噁英类污染物进行评估的依据是代谢物的显著性变化程度和干扰的代谢路径的定位。

本发明具有如下优点：

(1)利用人体细胞作为暴露模型，即解决了种属差异的问题，又能缩短分析时间；(2)代谢组学参数更能灵敏的指示污染物的毒性效应；(3)不同毒性作用模式的差别方便对相同种类的不同二噁英类化合物进行毒性评估；

利用该发明方法对二噁英类化合物的毒性作用进行评估，人体细胞敏感度高，暴露时间短，可大规模的进行对照及平行处理，代谢组学指标作为代谢的终点更能灵敏的指示二噁英类污染物的毒性作用模式，实验结果可靠性高，是一种污染物毒性作用评价及评估的新方法。

附图说明

图1为不同种类二噁英暴露后HepG2细胞内小分子代谢物的PLS-DA因子得分图。

图2为不同种类二噁英暴露后对HepG2细胞代谢通路的影响图。

具体实施方式

本发明通过以下具体实例进一步描述，但不限制本发明

细胞培养与暴露

HepG2细胞在37℃，含有5％CO2的细胞培养箱中培养，培养基为含10％FBS和1％双抗的DMEM细胞培养液。取对数期生长的细胞接种至96孔板用于细胞增殖活性测试，接种密度为2×10⁴细胞/孔，待细胞铺满96孔板的80％后进行二噁英的暴露试验，暴露时间为24h。取对数期生长的细胞接种至6孔板用于胞内小分子代谢物的代谢组学分析和相关酶活性测试。接种密度为3×10⁵细胞/孔，待细胞铺满6孔板的80％后进行二噁英的暴露试验，暴露时间为24h。二噁英通过溶解在DMSO中引入细胞培养液。DMSO在培养液中的最终浓度为0.05％(v/v)，对照组只含有0.05％的DMSO。试验组HepG2细胞暴露于相同毒性当量的二噁英中(1nM)，分别是2,3,7,8-TCDD，2,3,7,8-TCDF，1,2,3,7,8-PeCDD，2,3,4,7,8-PeCDF。细胞淬灭与代谢物提取。

细胞暴露试验结束后，移弃6孔板中细胞培养液，每孔加入2mL超纯水在10s内快速洗涤细胞，加入液氮淬灭，6孔板每孔液氮用量大约为5mL，使细胞的代谢活动终止。小分子代谢物的提取采用经典的80％甲醇提取法，冻干的细胞培养板中每孔加入1mL提取液(甲醇/水＝4:1)，涡旋震荡20min，然后在8℃条件下离心，13000g×20min。提取上清经过0.22μm滤膜过滤后用于样品分析。提取液中含有6种内标用于样品制备和仪器分析过程中的回收率校正，包括D5-L-苯丙氨酸、(D3-8,8,8)-L-辛酰基肉碱、LPC12:0、PE17:0、十一烷酸(FFA C11:0)和十九烷酸(FFA C19:0)。用于小分子代谢物分析的细胞样品，对照组和每个剂量组均设6个平行。

小分子代谢物仪器分析

采用拟靶向代谢组学方法对细胞内小分子代谢物进行分析，首先采用高分辨Q-TOF-MS的AutoMS/MS功能对分子量在50–1000的代谢物进行全扫和二级质谱扫描，获得离子对信息。然后采用高灵敏度的Q-Trap-MS对获得的离子对进行Schedule MRM分析，离子化方式为电喷雾电离(ESI)，扫描模式采用正负扫描。

数据处理

为了深入探讨不同二噁英暴露对HepG2细胞带来的代谢干扰，对代谢物数据进行偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)。从PLS-DA得分图可以看出所有二噁英暴露组均能够与对照组分开(图1)。即不同种类的二噁英对HepG2细胞均表现出显著的代谢干扰，在PC1方向，对照组、PCDD组与其它暴露组表现出了显著的分离，能够明显区分。TCDF、TCDD及PCDF能够在PC2方向更好地区分。从图1可以看出，即使毒性当量相同，不同的氯含量及不同的分子结构都对HepG2细胞的代谢表现出明显的干扰作用，且干扰方式不同。

采用MetaboAnalyst对不同种类二噁英暴露后显著变化的代谢物进行通路分析，如图2所示，结果表明，TCDD主要影响的代谢通路为磷脂的生物合成，甜菜碱代谢，嘌呤代谢,甲硫氨酸代谢和嘧啶代谢。TCDF主要影响的代谢通路为磷脂的生物合成，甜菜碱代谢，甲硫氨酸代谢，长链脂肪酸的β氧化，亚油酸和亚麻酸代谢。PCDD主要影响的代谢通路为亚油酸和亚麻酸代谢，甲硫氨酸代谢，氨循环，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢及精氨酸和脯氨酸代谢。PeCDF主要影响的代谢通路为亚油酸和亚麻酸代谢，嘌呤代谢，磷脂的生物合成，花生四烯酸代谢及甲硫氨酸代谢。