牛奶中黄曲霉毒素M1快速检测卡的制作方法

本实用新型属于免疫化学检测技术领域，具体涉及一种牛奶中黄曲霉毒素M1快速检测卡。

背景技术：

黄曲霉毒素是一类真菌（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些和人类血液、动物饲料相关的产品中。黄曲霉毒素（AFT）目前已发现20余种，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）的毒性、致癌性、污染频率均居于首位。黄曲霉毒素M1（AFM1）是黄曲霉毒素B1的羟基化代谢产物，也是一种强致癌物质。当哺乳动物摄入黄曲霉毒素B1污染的饲料后，在体内经羟基化会将黄曲霉毒素M1分泌于乳汁当中，奶牛经摄入黄曲霉毒素B1污染的饲料后产出的牛奶中便含有黄曲霉毒素M1。由于黄曲霉毒素M1相当稳定，巴氏灭菌法也无法将其消除，所以检测黄曲霉毒素M1不仅要检测动物饲料原料，而且要检测最终产品。为此世界各国都规定了牛乳及其制品中黄曲霉毒素M1的最大允许含量并将其作为强制性标准，如中国政府规定牛乳及其制品（消毒牛奶、新鲜生牛乳、全脂牛奶粉、奶油等）中黄曲霉毒素M1的最高允许含量为0.5 ng/ml。

黄曲霉毒素检测的常用方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、免疫分析法、质谱法、免疫亲和荧光光度法等。采用理化分析方法虽然是一种较理想的药物残留分析方法，但黄曲霉毒素M1分子中没有紫外发光团和荧光团，在化学分析中需要将它转变为具有紫外发光团或荧光团的衍生物才能进行分析，这给检测工作带来了极大困难，而且具有样品前处理步骤繁琐，耗时费力，仪器价格昂贵，需要专业人员操作等缺点。酶联免疫吸附法是目前常使用的一种检测方法，它具有快速、灵敏、对样品纯度要求不高等特点，特别适用于大批量样品的检测，但由于需要酶标仪和操作熟练的工人，不适合现场快速检测。

胶体金标记免疫分析法是近年来迅速发展的一种新型分析技术，其特点是简便快速、成本低、无污染和无需培训，非常适合于现场检测。与酶联免疫吸附法相比，具有样品前处理简单，显色时间短（3-5min），且所有试剂包含在一根试纸条上，无需使用仪器等优点，具有广阔的市场前景和应用价值。因此，研制快速、灵敏且高效的黄曲霉毒素M1快速检测卡对于保障动物性食品安全具有十分重要的意义。目前，黄曲霉毒素M1残留检测时往往出现单一试纸卡准确性需要2个，甚至2个以上试纸卡重复验证问题，本实用新型为解决上述问题，直接研制一种牛奶中黄曲霉毒素M1快速检测卡。

技术实现要素：

本实用新型解决的技术问题是提供了一种操作简单、灵敏度高、快速准确、成本低廉、稳定性好且能够重复验证的牛奶中黄曲霉毒素M1快速检测卡。

本实用新型为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种牛奶中黄曲霉毒素M1快速检测卡，其特征在于包括塑料壳体和封装于塑料壳体内的试纸条，其中塑料壳体由设有卡帽的卡座和设有卡柱的卡壳扣接而成，卡座的中部设有两道相互平行的卡槽，试纸条分别设置于卡槽内，试纸条的底层为PVC板构成的支撑层，该支撑层上依次附着有紧密相连的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，金标抗体结合垫上灌注有胶体金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，硝酸纤维素膜上喷涂有黄曲霉毒素M1-载体蛋白偶联物溶液印制的检测线T线和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线C线，两者之间的距离为5mm，其中黄曲霉毒素M1-载体蛋白偶联物溶液印制的检测线T线位于靠近样品垫的一侧，卡壳上与试纸条样品垫相对的位置分别设有加样孔，卡壳上与试纸条硝酸纤维素膜相对的位置分别设有观察窗，卡壳上与试纸条吸收垫相对的位置分别设有透气孔。

进一步优选，所述的卡座两侧分别设有3组相对称的中空圆柱形卡帽，卡壳上与卡帽相对的位置分别设有与卡帽相配的卡柱。

进一步优选，所述的样品垫、金标抗体结合垫和吸收垫上方覆盖有胶膜保护层。

进一步优选，所述的加样孔的形状为漏斗状椭圆形开口，所述的透气孔呈扇形排列。

进一步优选，所述的卡壳外侧边角处设有手持柄，卡壳外侧上部设有商标符号，卡壳外侧下部设有药品代号。

进一步优选，所述的样品垫和金标抗体结合垫的叠压宽度为2mm，吸收垫和硝酸纤维素膜的叠压宽度为2mm。

本实用新型与现有技术相比具有以下优点：

1、结果准确，可靠性高。本实用新型在一张试纸卡上同时设置2个性能完全一致的试纸条，进行双重检测，其检测环境、受干扰因素、加样量、观察时间等完全一致，能相互进行充分验证，保证了结果准确、可靠。

2、操作简单、方便快捷。使用该试纸卡时无需其它任何试剂，只要将处理后的样品溶液分别用滴管滴入试纸卡2个加样孔内各3-4滴，3-5min即可观察结果。

3、检测结果形象、直观。试纸卡以红色印迹线“｜”或“‖”作为检测线的阳性和阴性标记，即在两个观察窗内，2条硝酸纤维素膜上质控线C线均显示一条红色“｜”印迹时，表示被检测样品溶液中黄曲霉毒素M1残留含量超标；若2条硝酸纤维素膜上质控线C线和检测线T线同时出现两条红色“‖”印迹时，表示样品溶液中黄曲霉毒素M1残留含量呈阴性；其它结果表明试纸卡无效。结果形象直观，简单准确，不容易出现误判。

4、胶膜保护层的使用可以延长检测结果观察时间，试纸卡稳定性好。本试纸卡样品吸收垫将检测溶液完全吸收，使之与结合垫上金标抗体充分反应，可以有效减少误差率；还可以防止外界杂质干扰，影响金标抗体与检测抗原的结合。

5、塑料卡壳上的透气孔使溶液“爬坡”顺畅，显色时间短。透气孔使塑料卡壳内非常狭窄的空间与外界保持空气流通，保证反应膜正常发挥毛吸作用，使检测物能够快速地定向移动至透气孔，避免了阻滞或者不完全泳动等现象，提高了显色效率。

附图说明

图1是本实用新型的结构示意图；

图2是本实用新型中卡座的内侧结构示意图；

图3是本实用新型中卡壳的内侧结构示意图；

图4是本实用新型中试纸条的结构示意图。

图中：1、塑料壳体，2、试纸条，3、卡座，4、卡壳，5、卡槽，6、卡帽，7、卡柱，8、加样孔，9、观察窗，10、透气孔，11、商标符号，12、药品代号，13、手持柄，14、支撑层，15、样品垫，16、金标抗体结合垫，17、硝酸纤维素膜，18、吸收垫，19、黄曲霉毒素M1-载体蛋白偶联物溶液印制的检测线T线，20、羊抗鼠IgG溶液印制的质控线C线，21、胶膜保护层。

具体实施方式

结合附图详细描述本实用新型的具体内容。一种牛奶中黄曲霉毒素M1快速检测卡，包括塑料壳体1和封装于塑料壳体1内的试纸条2，其中塑料壳体1由设有卡帽6的卡座3和设有卡柱7的卡壳4扣接而成，卡座3的中部设有两道相互平行的卡槽5，试纸条2分别设置于卡槽5内，试纸条2的底层为PVC板构成的支撑层14，该支撑层14上依次附着有紧密相连的样品垫15、金标抗体结合垫16、硝酸纤维素膜17和吸收垫18，金标抗体结合垫16上灌注有胶体金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体，硝酸纤维素膜17上喷涂有黄曲霉毒素M1-载体蛋白偶联物溶液印制的检测线T线19和羊抗鼠IgG溶液印制的质控线C线20，两者之间的距离为5mm，其中黄曲霉毒素M1-载体蛋白偶联物溶液印制的检测线T线19位于靠近样品垫15的一侧，卡壳4上与试纸条2样品垫15相对的位置分别设有加样孔8，卡壳4上与试纸条2硝酸纤维素膜17相对的位置分别设有观察窗9，卡壳4上与试纸条2吸收垫18相对的位置分别设有透气孔10。

本实用新型所述的卡座3两侧分别设有3组相对的卡帽6，卡壳4上与卡帽6相对的位置分别设有与卡帽6相配的卡柱7。所述的样品垫15、金标抗体结合垫16和吸收垫18上方覆盖有胶膜保护层21。所述的加样孔8的形状为漏斗状椭圆形开口，所述的透气孔10呈扇形排列。所述的卡壳4外侧边角处设有手持柄13，卡壳4外侧上部设有商标符号11，卡壳4外侧下部设有药品代号12。

本实用新型所述的支撑层14是由聚氯乙烯树脂与稳定剂及辅料配合制成的PVC板。所述的吸收垫18是由吸水能力极强的植物长纤维为原材料制成的纯白滤纸。所述的样品垫15和金标抗体结合垫16是由玻璃纤维棉制作而成的。所述的样品垫15和金标抗体结合垫16的叠压宽度为2mm，吸收垫18与硝酸纤维素膜17的叠压宽度为2mm。

本实用新型所述的试纸卡的制备方法：

1）硝酸纤维素膜的制备：将硝酸纤维素膜置于X-only单向喷点仪平台上，黄曲霉毒素M1-载体蛋白偶联物溶液放于A池，羊抗鼠IgG溶液放于B池，展平压紧，开机后将抗原和二抗分别点射于硝酸纤维素膜上，形成检测线T线和质控线C线。室温自然干燥后，将其浸入封闭液（质量浓度为1%的 BSA的PBS缓冲液，pH 7.4）中30min，37℃烘干后，加入干燥剂，4℃密封保存。

2）金标抗体结合垫的制备：将玻璃纤维棉裁成4mm宽的细条，放入含质量浓度为5%的BSA、质量浓度为2%的蔗糖、质量浓度为0.8%的NaCl溶液和质量浓度为0.05%的NaN₃的PBS处理液中20min，37℃恒温烘干，然后将胶体金标记的抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体灌注已处理好的玻璃纤维棉上，真空冻干4h，即为金标抗体结合垫。

3）样品垫的制备：玻璃纤维棉要用含质量浓度为2%的BSA、质量浓度为1%的蔗糖、质量浓度为0.5%的硼酸钠和质量浓度为0.1%的 NaN₃的PBS处理后，干燥备用，即为样品垫。

4）吸收垫的制备：将吸水能力极强的植物长纤维为原材料制作的纯白滤纸用切割机切成4 mm宽的细条，并用胶膜进行一侧封闭，干燥备用。

5）试纸条的制备：在支撑板PVC板上，将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫、吸收垫和胶膜等按一定工艺组装在一起，用CM4000切割机制成4mm宽的试纸条，放入带干燥剂的密闭容器中储存。

6）试纸卡的组装：按一定工艺将两根试纸条封装于带有2个加样孔和2个观察窗的特制的塑料壳体中，即为本实用新型的黄曲霉毒素M1双重检测试纸卡。

本实用新型所述的试纸卡的检测原理：

试纸卡根据抗原抗体竞争性免疫层析原理设计。滴加样品液后，在吸收垫和硝酸纤维素膜的毛细作用下，样品溶液向上迁移，到达结合垫时，金标抗体将被溶解。当样品中含有黄曲霉毒素M1时，它们将和金标抗体结合，并一起向上迁移，到达固定有AFM1-OVA的检测线位置时，检测抗原将和黄曲霉毒素M1竞争结合金标抗体上有限的抗原结合位点。样品中AFM1含量越高，检测抗原和金标抗体结合数量就越少，T线显色就越弱；当样品中AFM1高于一定数值时，检测抗原就无法和金标抗体结合，T线不显色。无论样品中是否有AFM1存在，过量的金标抗体或检测抗原与金标抗体的结合物都将和二抗RaMIgG结合，在C线形成红色。

本实用新型所述的试纸卡的使用方法：

1）牛奶样品前处理：

量取2ml 样品于10ml 离心管中，加入5ml水-乙腈（1:1）混合稀释液，均质混匀，5000r/min离心10min，取上清液进行样品检测。

2）样品滴加：

将试纸卡平放后，用滴管将样品溶液分别滴入试纸卡2个加样孔内3-4滴，3-5min后即可观察结果。

3）检测结果分析：

阴性：若试纸卡2个观察窗内硝酸纤维素膜上质控线C线和检测线T线均同时出现两条红色“‖”印迹时，表示牛奶样品溶液中黄曲霉毒素M1含量呈阴性。

阳性：若试纸卡2个观察窗内硝酸纤维素膜上质控线C线均显示一条红色“｜”印迹，而对应检测线T线不显色，表示被检测牛奶样品溶液中黄曲霉毒素M1含量呈阳性。

无效：若试纸卡2个观察窗内硝酸纤维素膜上质控线C线有一条或两条不显示红色条带，则无论对应检测线T线是否出现红色印迹，该试纸卡均判为无效。

以上显示和描述了本实用新型的基本原理，主要特征和优点，在不脱离本实用新型精神和范围的前提下，本实用新型还有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本实用新型的范围。