液相色谱‑串联质谱法检测组织亚油酸含量的方法及结直肠癌诊断试剂盒与流程

本发明属于肿瘤医学领域，涉及液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS方法)检测肠道组织样本亚油酸含量，以及用于结直肠癌的诊断试剂盒。

背景技术：

结直肠癌(Colorectal cancer)是消化系统中常见的恶性肿瘤，其致死率在全球居第四位。虽然内镜检查有助于结直肠癌的确诊，但受制于经济条件和患者的依从性，应用范围有限。目前，癌胚抗原(CEA)常用于卵巢癌和消化道肿瘤的早期筛查，但其检测灵敏性和特异性有待提高。结肠直肠癌的诊断对于提高患者的生存率具有重要意义。

必需脂肪酸因为在体内不能合成，必须依赖于食物提供，主要包括亚油酸和亚麻酸等多元不饱和脂肪酸。亚油酸与类脂代谢有关，尤其对胆固醇的转运和代谢起着重要的作用。胆固醇在体内必须和脂肪酸结合才可以被转运和代谢。当体内缺乏必需脂肪酸时，胆固醇的转运和代谢发生异常，进而堆积以致含量增加。亚油酸与胆固醇结合生成水溶性物质，降低血清胆固醇水平，保护心脑血管。亚油酸是不饱和脂肪酸，是细胞膜的组成成分，参与线粒体及细胞膜磷脂的合成。亚油酸代谢产物是血栓素A2(TXA2)，具有促进血小板聚集和促进动脉内膜增生功能。同时，亚油酸是生物抗氧剂，具有抗老化和增加机体免疫力作用。

近期研究显示，代谢通路的变化与肿瘤的发生发展密切相关。特别是，肿瘤细胞内的亚油酸代谢通路发生了变化。明确细胞内亚油酸代谢模式有助于肿瘤的早期诊断和发生发展进程评价。因此，通过检测肠息肉、腺瘤等活检组织中的亚油酸代谢通路变化和代谢靶点，有助于对患者进行早期确诊和发病风险评估。

目前，亚油酸的检测方法主要是GC-MS。通常将亚油酸衍生为易挥发的甲酯，经过GC分离，然后进行MS检测。但在衍生过程中的水解、氧化或者异构化等问题，极易造成检测结果不准确。使用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)较GC-MS有以下优点，LC条件温和，适合像亚油酸这样的极性低、低挥发性且热敏感的化合物，可避免衍生过程中的异构和氧化。但时，LC-MS/MS的衍生方法过于繁琐和耗时。因此，建立简便、快捷、准确的亚油酸检测方法具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种液相色谱-串联质谱法检测组织亚油酸含量的方法及结直肠癌诊断试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种液相色谱-串联质谱法检测组织亚油酸含量的方法，包括以下步骤：

1)将50～110mg组织样本在液氮中研磨成粉，将研磨得到的组织粉末用含有0.1％2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)的冰甲醇均质后进行离心，取离心得到的上清液；

2)向15～20μL上清液中加入亚油酸同位素内标，放置25～35min后离心，将离心得到的上清液经氮气吹干后用50～60μL正丁醇于60～65℃衍生处理20～30min，然后氮气吹干，用100～150μL流动相重新分散溶解，得到待上样检测样品；

3)对待上样检测样品利用液相色谱-串联质谱法进行分析，得到组织样本中亚油酸的含量。

所述组织样本由肠道活检得到。

所述冰甲醇是指0～4℃预冷的甲醇(色谱级)。

所述液相色谱的工作条件包括：流动相是将0.6～1mL 50％的乙酸水溶液与1000mL乙腈水溶液混合而制成的，所述乙腈水溶液中乙腈与水的体积比为(7～8):(2～3)；流动相采用梯度流速，且初始流速为240μL/min；进样量为18～25μL。

所述质谱的工作条件包括：离子源温度为350～370℃；每次转变驻留时间为200～220ms；雾化气为0.3MPa，辅助气为0.4MPa，气帘气为0.25MPa；分析模式为母离子扫描，目标物亚油酸的母离子扫描范围为350～500m/z，子离子为85.1m/z。

一种结直肠癌诊断试剂盒，该试剂盒包括用于提取组织液的试剂以及用于制备液相色谱-串联质谱法所需样品的预处理试剂和流动相(即上述流动相)，所述用于提取组织液的试剂包括2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚以及甲醇，所述预处理试剂包括亚油酸同位素内标以及衍生试剂正丁醇。

所述试剂盒还包括用于实时定量PCR检测组织样本中FADS1、FADS2、ELOVL2或ELOVL5基因表达量的对应引物对P1、P2、P3或P4。

所述引物对P1为：

上游引物FADS1F：5`-GTCCGCTTCTTCCTCACTTATG-3`

下游引物FADS1R：5`-GCTTTCCAGGAACCTGACTATG-3`；

所述引物对P2为：

上游引物FADS2F：5`-CATGACCATGATCGTCCATAAGA-3`

下游引物FADS2R：5`-GATGCCGTAGAAAGGGATGTAG-3`；

所述引物对P3为：

上游引物ELOVL2F：5`-CCCTTCGGTTGTCTCATCTTC-3`

下游引物ELOVL2R：5`-CAGGTGGCTCTTGCATATCTT-3`；

所述引物对P4为：

上游引物ELOVL5F：5`-TCCCTCTTGGTTGGTTGTATTT-3`

下游引物ELOVL5R：5`-CCTTCAGGTGGTCTTTCCTTC-3`。

本发明的有益效果体现在：

本发明所述方法通过液相色谱-串联质谱联用分析对组织样本中的亚油酸含量进行快速、准确、可靠的检测，分析样品的前处理简单有效，可用于对肠道活检物，例如癌组织或正常组织的亚油酸含量分析，为比较疑似结直肠癌患者癌组织与癌旁组织的亚油酸含量差异提供了便利的途径，为结直肠癌的诊治以及后期的营养学支持提供重要参考。

本发明所述试剂盒，可以用于对疑似结直肠癌患者的活检样本亚油酸含量变化以及相关代谢通路中基因的表达变化进行检测，从而达到快速、准确、可靠诊断结直肠癌的目的。

附图说明

图1为10对结直肠癌组织(Tumor)和癌旁对照(Normal)的代谢数据集通过主成分分析(Principal Component Analysis)分析方法进行分类的结果。

图2为对代谢数据集利用随机森林方法进行分析的结果。

图3为亚油酸代谢通路变化示意图。

图4为基因芯片结果层次聚类图。

图5为Real-time PCR检测结直肠癌组织和癌旁对照中FADS1、FADS2、ELOVL2以及ELOVL5基因的表达差异。

图6为液相色谱-串联质谱法检测结果图，其中方框所指特征锋为亚油酸。

图7为亚油酸(LA(Linoleate 18:2))在结直肠癌组织以及癌旁对照中的点线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

(1)对结直肠癌组织以及相应的癌旁对照进行代谢组学分析，筛选出合适的代谢生物标记物。本发明发现亚油酸含量在结直肠癌患者肿瘤组织中降低。(2)对结直肠癌组织以及相应的癌旁对照进行转录本分析，确定此代谢物(亚油酸)的相关酶的表达发生改变，进一步对代谢物(亚油酸)相关酶的表达进行实验室验证。基因芯片结果显示结直肠癌组织和癌旁对照相比FADS、FADS2、ELOVL2和ELOVL5表达上调，亚油酸代谢增加，结直肠癌细胞内亚油酸含量降低。Real-time PCR结果显示FADS1、FADS2、ELOVL2和ELOVL5的表达增加，与基因芯片结果重合。FADS1、FADS2、ELOVL2和ELOVL5为亚油酸代谢调控提供了新的靶点，以此为依据，可用以设计和开发直接针对靶点治疗结直肠癌的新药。以下为具体举例说明。

1、筛选出结直肠癌组织中含量显著变化的代谢物。

1.1实验设计

收集10对结直肠癌组织(Tumor)样本以及相应的癌旁对照(Normal)，将-70℃冻存的组织样本送往上海烈冰科技有限公司，对样本进行代谢组学检测。

样本于2014年3月采集自陕西省西安市西京医院。

1.2数据的初步处理

总共有347个代谢物在肿瘤组织中检测出来，首先对数据进行对数转换以及数据缺失处理，结果显示代谢物在肿瘤组织和正常组织间可以很好的区分。

1.3配对t检验方法

进一步通过配对t检验对代谢物进行分析，其中肿瘤组织中有95个代谢物含量显著增加，而25个代谢物含量显著降低；并且其中22个代谢物含量极显著增加，而12个代谢物含量极显著降低。

1.4主成分分析方法

通过主成分分析(Principal Component Analysis)分析方法对10对肿瘤组织和正常对照(癌旁对照)的代谢数据集进行分类。所有样本都在三维空间中进行了分类，除1例肿瘤组织外，结果显示，依据代谢物主要成分含量差异，可以很好的将肿瘤组织与正常组织进行区分，结果如图1。

1.5随机森林方法

对代谢数据集进行随机深林分析，结果显示亚油酸(LA)含量显著下降。同时亚油酸通路中γ亚油酸也下降，但因为检测过程中γ亚油酸和亚麻酸无法区分，因此不作为结直肠癌代谢检测的靶标分子，结果如图2。

从图3中可以明显的看出肿瘤组织的亚油酸代谢通路与正常组织的代谢通路不同。

2、亚油酸含量的降低关联代谢通路中调控关键酶基因表达的变化。

2.1收集10对结直肠癌组织(Tumor)样本以及相应的癌旁对照(Normal)，将-70℃冻存的组织和样本送往上海烈冰科技有限公司，对样本进行基因表达检测。从图4可以看出，对基因芯片结果进行的层次聚类分析，发现不饱和脂肪酸通路基因表达上调。

2.2qPCR对基因芯片中含量变化的验证。

2.2.1FADS1、FADS2、ELOVL2以及ELOVL5基因扩增引物设计

FADS1F：5`-GTCCGCTTCTTCCTCACTTATG-3`(SEQ.ID.NO.1)

FADS1R：5`-GCTTTCCAGGAACCTGACTATG-3`(SEQ.ID.NO.2)

FADS2F：5`-CATGACCATGATCGTCCATAAGA-3`(SEQ.ID.NO.3)

FADS2R：5`-GATGCCGTAGAAAGGGATGTAG-3`(SEQ.ID.NO.4)

ELOVL5F：5`-TCCCTCTTGGTTGGTTGTATTT-3`(SEQ.ID.NO.5)

ELOVL5R：5`-CCTTCAGGTGGTCTTTCCTTC-3`(SEQ.ID.NO.6)

ELOVL2F：5`-CCCTTCGGTTGTCTCATCTTC-3`(SEQ.ID.NO.7)

ELOVL2R：5`-CAGGTGGCTCTTGCATATCTT-3`(SEQ.ID.NO.8)

2.2.2RNA提取

1)先将肿瘤组织以及癌旁对照的纤维组织、脂肪组织清除干净，加入到研磨器中，在研磨器中磨碎后，吸取100μL的组织液加入到EP管中。

2)经第一步处理后的样品，每个样品加500μL预冷的Trizol，用加样枪反复吹打，并放置冰上5min，使细胞充分裂解。

3)转移至经DEPC水处理过的1.5mL EP管，加200μL氯仿，充分震荡混匀，静置5min使其分层。

4)4℃ 12000rpm离心15min，用200μL加样枪吸取上层水样400μL左右至新的1.5mL EP管中。

5)加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温静置10min。

6)4℃ 12000rpm离心15min，弃上清。

7)加100％乙醇1mL，充分洗涤后再重复步骤(6)，可见底部有白色沉淀析出，即总RNA。

8)倒扣EP管于吸水滤纸上，静置5min后，用20μL DEPC水溶解。

9)RNA定量：取4μL从步骤8获得的RNA溶解于196μL ddH2O中，用紫外分光光度计测定其A260和A280值，即可知道所提取总RNA的纯度和浓度。

2.2.3反转录

取0.5μg总RNA，使用TaKaRa公司的Prime Script RT reagent kit进行反转录，反应体系(20μL)为：5×buffer 4μL、补去离子水至20μL。反应条件为：37℃ 15min；85℃5s，4℃ 10min。

2.2.4实时定量PCR(Real-time PCR)

采用TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq试剂进行Real-time PCR反应，每个样本做三个重复，反应体系为20μL：2×buffer 10μL、上下游引物各1μL、cDNA模板2μL、ROX 0.4μL、补去离子水至20μL。在ABI 7500荧光定量PCR仪上按下列条件扩增：95℃预变性10s，然后95℃ 10s，60℃ 30s，共40个循环。设定在每个循环的变性期结束后，程序记录上一循环最后10％时间的平均荧光值，以表示在该循环结束时的PCR产物的量。反应完成后，进行数据分析和修正。在调整基线循环和计算阈值后，采用^2-ΔΔCt法比较FADS2和ELOV5的相对表达量，仪器自动根据得出的Ct值计算得出代表相对表达量的值。参见图5，结果提示结直肠癌组织中FADS1、FADS2、ELOVL2以及ELOVL5基因表达上调。

3、LC-MS/MS方法快速简便的检测结直肠癌组织及癌旁组织中亚油酸含量变化

3.1主要试剂：

3.2主要仪器：

3.3溶液的配制：

亚油酸同位素内标储存液配制：取冻干粉一支，加入1mL甲醇混合使溶解，浓度15.2μmol/L，纯度99.7％。

亚油酸同位素内标使用液配制：取内标储存液用甲醇稀释100倍(1个月内用完)，浓度0.152μmol/L。

流动相的配制：加0.6mL的体积分数50％的乙酸水溶液到1000mL的乙腈水溶液中(乙腈：水＝80％：20％)，混合均匀并超声脱气以备用。

洗针液的配制：在1000mL的玻璃瓶中分别加入250mL的乙腈、250mL的异丙醇和250mL的去离子水，混合均匀后室温条件下贮存以备用。

3.4组织样本的前处理(以结直肠癌组织为例)：

准确称量100mg结直肠癌组织于1.5mL离心管中，液氮研磨成粉，加到1.5mL含0.1％(体积分数)BHT的冰甲醇中，研磨组织样品直至完全均质，5000rpm离心，取上清100μL，-20℃冰箱保存待测。

3.5样本预处理：

取15μL(每孔)准备好的肿瘤组织液(即步骤3.4得到的上清液)，置于96孔过滤板中，每孔加入50μL亚油酸同位素内标使用液，室温放置25min，然后离心至96孔聚丙烯微孔板，65℃氮气加热吹干，再加入60μL正丁醇(74.12g/mol)，Teflon膜覆盖(防止挥发)，置65℃恒温箱内25min，随后65℃氮气加热吹干，再加入100μL流动相，铝膜覆盖(防止挥发，同时，方便采样针穿入)，即可上样检测。

3.6LC-MS/MS分析条件：

LC参数：初始流速：240μL/min，四元泵设置梯度流速见表1，进样量：18μL。

表1.流动相流速

MS/MS参数：离子源温度(Probe temperature)350℃，每次转变驻留时间(Dwell time per transition)200ms，雾化气(Nebulizer GAS 1)0.3MPa，辅助气(Heater gas GAS 2)0.4MPa，气帘气(Curtain gas)0.25MPa，离子源电压(Ion spray voltage)：5500V，分析模式(Mode of analysis)：母离子扫描(Precursor Ion Scanning)，目标物亚油酸，母离子(Q1)480.6，子离子(Q3)85.1。

3.7数据处理：

由Chem View软件(美国生物应用系统公司)对数据进行分析计算，采用内标标准曲线法，根据代谢物与相应内标丰度比值代入标准曲线中进行计算，得出样品中亚油酸的浓度。

3.8检测方法验证：

方法学认证样本：采用美国Cambridge Isotope Labs公司提供的加入已知浓度标准品的样品进行检测，标本编号分别为061-064，包括四个浓度等级，分别为：基质、低加标浓度、中加标浓度、高加标浓度。

3.8.1方法准确性测定结果：所测得结果均在检测结果95％可信区间内。

3.8.2方法精确性测定：采用在1天内1次测定5个样本，计算这5个样本中亚油酸的变异系数作为批内变异；每天1次测定5个样本，连续5天，计算这5天的亚油酸的变异系数作为批间变异，用变异系数(CV)表示精确性，CV(％)＝100*均值/标准差，结果显示变异系数均小于5％。

3.8.3提取回收率：不同浓度水平的回收率在95.8％～98.2％范围内，总回收率为97.2％。

如图6，通过LC-MS/MS的方法快速对结直肠癌肿瘤样本进行亚油酸含量检测，比传统的GC-MS的方法简便快捷，检测限更低，分析时间更短。

如图7所示，经检测，肿瘤组织亚油酸含量显著降低。

总之，本发明首先对肿瘤组织代谢组学数据进行t检验，主成分分析，以及随机深林分析，均发现亚油酸显著降低，并且代谢组学结果提示结直肠癌组织中亚油酸代谢通路不同于其他组织，代谢通路中如代谢物24:4以及24:5不表达，并且在进行碳链延长过程中会也会通过20:2而不仅仅是GLA。因此推测亚油酸代谢通路与结直肠癌肿瘤的发生发展密切相关。进一步对亚油酸通路的代谢酶进行表达分析，结果提示亚油酸通路中FADS1，FADS2，ELOVL2以及ELOVL5的基因表达都增加，说明肿瘤细胞内亚油酸代谢旺盛，亚油酸进入细胞后很快的会被代谢，因此肿瘤组织中亚油酸含量降低，提示亚油酸可能是结直肠癌基因组学中一个重要的靶标。

以上通过组学的方法筛选亚油酸作为结直肠癌病人的一个BIOMARK，那么如何推广，在医院中如何检测呢？首先可以将取来的活检组织进行LC-MS/MS检测快速的确定活检组织中亚油酸的含量，接着可提取RNA进行FADS1、FADS2、ELOVL2和ELOVL5的表达分析。通过对结直肠癌患者的肿瘤组织亚油酸含量变化以及相关代谢通路中基因的表达变化进行检测，为结直肠癌的诊治，以及后期的营养学支持提供重要参考。

核苷酸序列表

<110> 中国人民解放军第四军医大学

<120> 液相色谱-串联质谱法检测组织亚油酸含量的方法及结直肠癌诊断试剂盒

<160> 8

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gtccgcttct tcctcactta tg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gctttccagg aacctgacta tg 22

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

catgaccatg atcgtccata aga 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gatgccgtag aaagggatgt ag 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tccctcttgg ttggttgtat tt 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ccttcaggtg gtctttcctt c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cccttcggtt gtctcatctt c 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

caggtggctc ttgcatatct t 21