本发明涉及一种贵金属纳米材料电化学免疫传感器的制备方法及应用，更具体而言，本发明是采用Au八面体分散液作为基底材料，Au八面体等离子胶体负载的甲苯胺蓝为二抗标记物，通过层层自组装构建的夹心型免疫传感器，可以实现对赭曲霉毒素A的特异性检测，属于新型传感器构建技术领域。
背景技术：
赭曲霉毒素A是真菌生长过程中产生的有毒物质，经研究发现它具有较强的肝毒性和肾毒性，并会引发致畸、致突变和致癌的作用。赭曲霉毒素A在真菌毒素中毒性第二，并且广泛存在于各类农作物及食品中，严重危害着人类和动物的健康，因此赭曲霉毒素A的检测刻不容缓。传统的检测方法包括液相色谱、气相色谱和毛细管电泳法等方法，但多数方法需要的仪器设备昂贵，样品准备耗时长，不适于大量样品的筛选。电化学免疫传感器，尤其是夹心型电化学免疫传感器，具有检测灵敏度高、选择性好、重现性好、稳定性高等优点，是当今时代备受人们关注的一门技术。
本发明基于纳米功能材料构建了一种新型的电化学免疫传感器，用于赭曲霉毒素A的检测。利用Au八面体分散液作为基底材料，Au八面体等离子胶体负载的甲苯胺蓝作为二抗标记物，实现了对赭曲霉毒素A的检测。测试结果显示该电化学免疫传感器灵敏度高，检出限低，稳定性好，基于上述发现，发明人完成了本发明。
技术实现要素：
本发明的目的之一是基于Au八面体分散液为基底材料，利用Au八面体等离子胶体负载的甲苯胺蓝为标记层，构建了一种新型的夹心型电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是提供一种基于贵金属材料Au的电化学免疫传感器的制备方法，该方法制备的传感器稳定性好、选择性好、灵敏度高和重现性好。
本发明的目的之三是实现了所述电化学免疫传感器的构建并且对赭曲霉毒素A进行了有效的检测，达到了所述电化学免疫传感器在测定赭曲霉毒素A的用途。
本发明的技术方案如下：
1. 一种基于Au八面体等离子胶体的赭曲霉毒素A免疫传感器的构建
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极，超纯水清洗干净，将6 µL、1.0 ~ 1.6 mg mL-1 Au八面体分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）依次滴加6 µL、1~5 µg mL-1的赭曲霉毒素A抗体anti-OTA，3 µL、质量分数为0.5% ~ 2%的BSA溶液到电极表面，超纯水洗净，室温下晾干；
（3）滴加6 µL、10-4~100 ng mL-1的一系列不同浓度的赭曲霉毒素A到电极表面，孵化2 h，超纯水冲洗，室温下晾干；
（4）滴加6 µL的Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb溶液，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种夹心型免疫传感器。
2. Au八面体分散液的制备
将20 mg mL-1、1.2 mL氯金酸及0.1~1.8 g PDDA同时加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C条件下加热0.1~10 h，通过在14500 rpm下离心并用超纯水反复洗涤制得Au八面体。
3. Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb溶液的制备
（1）Au八面体等离子胶体的制备
将制得的Au八面体分散液用正丁醇溶液洗涤，然后通过超声重新分散在一定量的去离子水中，形成胶体悬浮液，再把1 mL正丁醇溶液加入到上述胶体悬浮体中，超声振荡0.2~5 h，通过界面自组装形成Au八面体等离子胶体，静置5~100 min，得到的沉淀即为Au八面体等离子胶体；
（2）Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb溶液的制备
将0.5 mL、1.0 mg mL-1 Au八面体等离子胶体分散于1.0 mL超纯水中摇匀，并加入0.1 mL的赭曲霉毒素A抗体anti-OTA和甲苯胺蓝， 4 °C下振荡1~5 h，得到的产物14500 rpm离心分离，固体重新分散在蒸馏水中即为Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb溶液。
4. 赭曲霉毒素A的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL的含有浓度为4~6 mmol L-1铁氰化钾和10-2~10 mmol L-1硝酸钾溶液中进行测试；
（2） 用方波伏安法对赭曲霉毒素A标准溶液进行检测，其电压测试范围为-0.6V ~ 0.3V；
（3）当背景电流趋于稳定后，观察赭曲霉毒素A加入前后传感器的峰电流值，然后记录电流变化，绘制工作曲线。
本发明的有益成果
（1）本发明的发明人将Au八面体分散液作为基底材料，Au八面体等离子胶体作为二抗标记物应用到电化学免疫传感器的制备当中， 由于Au八面体和Au八面体等离子胶体具有良好的电子传递能力，并且能够牢固的连接赭曲霉毒素A抗体，提高了传感器的灵敏度和稳定性。
（2）本发明采用甲苯胺蓝作为电子媒介体，构建了一个夹心型电化学免疫传感器，并且对赭曲霉毒素A进行了有效的检测，此方法操作较为简单。
（3）本发明制备的电化学免疫传感器用于赭曲霉毒素A的检测，该电化学传感器稳定性高，重现性好，灵敏度高，线性范围宽，可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。
具体实施方式
实施例1 一种基于Au八面体等离子胶体的赭曲霉毒素A免疫传感器的构建
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极，超纯水清洗干净，将6 µL、1.0 mg mL-1Au八面体分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）依次滴加6 µL、1 µg mL-1的赭曲霉毒素A抗体anti-OTA，3 µL、质量分数为0.5%的BSA溶液到电极表面，超纯水洗净，室温下晾干；
（3）滴加6 µL、10-4~100 ng mL-1的一系列不同浓度的赭曲霉毒素A到电极表面，孵化2 h，超纯水冲洗，室温下晾干；
（4）滴加6 µL的Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb溶液，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种夹心型免疫传感器。
实施例2 一种基于Au八面体等离子胶体的赭曲霉毒素A免疫传感器的构建
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极，超纯水清洗干净，将6 µL、1.2 mg mL-1Au八面体分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）依次滴加6 µL、3.5 µg mL-1的赭曲霉毒素A抗体anti-OTA，3 µL、质量分数为1%的BSA溶液到电极表面，超纯水洗净，室温下晾干；
（3）滴加6 µL、10-4~100 ng mL-1的一系列不同浓度的赭曲霉毒素A到电极表面，孵化2 h，超纯水冲洗，室温下晾干；
（4）滴加6 µL的Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb溶液，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种夹心型免疫传感器。
实施例3 一种基于Au八面体等离子胶体的赭曲霉毒素A免疫传感器的构建
（1）用Al2O3抛光粉打磨直径为4 mm的玻碳电极，超纯水清洗干净，将6 µL、1.6 mg mL-1Au八面体分散液滴加到电极表面，室温下晾干成膜；
（2）依次滴加6 µL、5 µg mL-1的赭曲霉毒素A抗体anti-OTA，3 µL、质量分数为2%的BSA溶液到电极表面，超纯水洗净，室温下晾干；
（3）滴加6 µL、10-4~100 ng mL-1的一系列不同浓度的赭曲霉毒素A到电极表面，孵化2 h，超纯水冲洗，室温下晾干；
（4）滴加6 µL的Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb溶液，超纯水冲洗，室温下晾干，制得一种夹心型免疫传感器。
实施例4 Au八面体分散液的制备
将20 mg mL-1、1.2 mL氯金酸及0.1 g PDDA同时加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C条件下加热0.1 h，通过在14500 rpm下离心并用超纯水反复洗涤制得Au八面体。
实施例5 Au八面体分散液的制备
将20 mg mL-1、1.2 mL氯金酸及1.0 g PDDA同时加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C条件下加热5 h，通过在14500 rpm下离心并用超纯水反复洗涤制得Au八面体。
实施例6 Au八面体分散液的制备
将20 mg mL-1、1.2 mL氯金酸及1.8 g PDDA同时加入到140 mL乙二醇溶液中，在195 °C条件下加热10 h，通过在14500 rpm下离心并用超纯水反复洗涤制得Au八面体。
实施例7 Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb溶液的制备
（1）Au八面体等离子胶体的制备
将制得的Au八面体分散液用正丁醇溶液洗涤，然后通过超声重新分散在一定量的去离子水中，形成胶体悬浮液，再把1 mL正丁醇溶液加入到上述胶体悬浮液中，超声振荡0.2 h，通过界面自组装形成Au八面体等离子胶体，静置5 min，得到的沉淀即为Au八面体等离子胶体；
（2）Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb溶液的制备
将0.5 mL、1.0 mg mL-1 Au八面体等离子胶体分散于1.0 mL超纯水中摇匀，并加入0.1 mL的赭曲霉毒素A抗体anti-OTA和甲苯胺蓝， 4 °C下振荡1 h，得到的产物14500 rpm离心分离，固体重新分散在蒸馏水中即为Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb溶液。
实施例8 Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb溶液的制备
（1）Au八面体等离子胶体的制备
将制得的Au八面体分散液用正丁醇溶液洗涤，然后通过超声重新分散在一定量的去离子水中，形成胶体悬浮液，再把1 mL正丁醇溶液加入到上述胶体悬浮液中，超声振荡2.5 h，通过界面自组装形成Au八面体等离子胶体，静置50 min，得到的沉淀即为Au八面体等离子胶体；
（2）Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb的制备
将0.5 mL、1.0 mg mL-1 Au八面体等离子胶体分散于1.0 mL超纯水中摇匀，并加入0.1 mL的赭曲霉毒素A抗体anti-OTA和甲苯胺蓝， 4 °C下振荡3 h，得到的产物14500 rpm离心分离，固体重新分散在蒸馏水中即为Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb溶液。
实施例9 Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb溶液的制备
（1）Au八面体等离子胶体的制备
将制得的Au八面体分散液用正丁醇溶液洗涤，然后通过超声重新分散在一定量的去离子水中，形成胶体悬浮液，再把1 mL正丁醇溶液加入到上述胶体悬浮液中，超声振荡5 h，通过界面自组装形成Au八面体等离子胶体，静置100 min，得到的沉淀即为Au八面体等离子胶体；
（2）Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb溶液的制备
将0.5 mL、1.0 mg mL-1 Au八面体等离子胶体分散于1.0 mL超纯水中摇匀，并加入0.1 mL的赭曲霉毒素A抗体anti-OTA和甲苯胺蓝， 4 °C下振荡5 h，得到的产物14500 rpm离心分离，固体重新分散在蒸馏水中即为Au八面体等离子胶体负载甲苯胺蓝的二抗标记物Au opc@Ab2@Tb溶液。
实施例10 赭曲霉毒素A的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL的含有浓度为4 mmol L-1铁氰化钾和10-2 mmol L-1硝酸钾溶液中进行测试；
（2）用方波伏安法对赭曲霉毒素A标准溶液进行检测，其电压测试范围为-0.6V ~ 0.3V；
（3）当背景电流趋于稳定后，观察赭曲霉毒素A加入前后传感器的峰电流值，然后记录电流变化，绘制工作曲线。
实施例11 赭曲霉毒素A的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL的含有浓度为5 mmol L-1铁氰化钾和1 mmol L-1硝酸钾溶液中进行测试；
（2）用方波伏安法对赭曲霉毒素A标准溶液进行检测，其电压测试范围为-0.6V ~ 0.3V；
（3）当背景电流趋于稳定后，观察赭曲霉毒素A加入前后传感器的峰电流值，然后记录电流变化，绘制工作曲线。
实施例12 赭曲霉毒素A的检测
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的免疫传感器为工作电极，在10 mL的含有浓度为6 mmol L-1铁氰化钾和10 mmol L-1硝酸钾溶液中进行测试；
（2）用方波伏安法对赭曲霉毒素A标准溶液进行检测，其电压测试范围为-0.6V ~ 0.3V；
（3）当背景电流趋于稳定后，观察赭曲霉毒素A加入前后传感器的峰电流值，然后记录电流变化，绘制工作曲线。