金纳米簇和碳量子点复合荧光探针及其应用的制作方法

本发明属于纳米检测离子技术领域，具体涉及金纳米簇和碳量子点复合荧光探针及其在对重金属离子Hg²⁺和Cr⁶⁺的检测的应用。

背景技术：

重金属污染指由重金属或其化合物造成的环境污染。重金属离子中，汞是一种具有剧毒却又普遍存在于自然界的污染物。汞污染会造成对脑、神经系统、内分泌系统、肾脏严重的伤害。水溶性的汞离子(Hg²⁺)是汞离子污染物中最平常和最稳定的形式之一，它是水环境和土壤污染的主要方式。主要由采矿、废气排放、污水灌溉和使用重金属制品等人为因素所致。无机汞离子可以被环境中的细菌转化成甲基汞，这种形式的汞污染会通过食物链传递给或聚集在更高一级的有机生物体。因此，环境中的水溶性的Hg²⁺的检测和监测是必要的。对于六价铬离子危害最大的是长期或短期接触或吸入时有致癌危险：六价铬为吞入性毒物/吸入性极毒物，皮肤接触可能导致敏感；更可能造成遗传性基因缺陷，吸入可能致癌，对环境有持久危险性。但这些是六价铬的特性，铬金属、三价或四价铬离子并不具有这些毒性。六价铬是很容易被人体吸收的，它可通过消化、呼吸道、皮肤及粘膜侵入人体。有报道，通过呼吸空气中含有不同浓度的铬酸酐时有不同程度的沙哑、鼻粘膜萎缩，严重时还可使鼻中隔穿孔和支气管扩张等。经消化道侵入时可引起呕吐、腹疼。经皮肤侵入时会产生皮炎和湿疹。 六价铬化合物在体内具有致癌作用，还会引起诸多的其他健康问题，如吸入某些较高浓度的六价铬化合物会引起流鼻涕、打喷嚏、瘙痒、鼻出血、溃疡和鼻中隔穿孔。短期大剂量的接触，在接触部位会产生不良后果，包括溃疡、鼻黏膜刺激和鼻中隔穿孔。摄入超大剂量的铬离子会导致肾脏和肝脏的损伤、恶心、胃肠道刺激、胃溃疡、痉挛甚至死亡。皮肤接触会造成溃疡或过敏反应（六价铬是最易导致过敏的金属之一，仅次于镍）。据实验研究表明，大剂量饲喂小鼠，六价铬离子会对小鼠的繁殖产生影响，造成每窝仔鼠的数量减少和胎鼠体重下降，因此，环境中的Cr⁶⁺的检测和监测是必要的。

金纳米颗粒是研究较早的一种纳米材料。它的粒子尺寸一般在1-100 nm 之间，随粒径的变化呈现不同的颜色，有利于肉眼观察，具有较强的显色能力，而且合成方法简单，产率高，技术成熟，已被广泛应用于感光、催化、生物标识、医学免疫、表面增强拉曼散射等诸多领域，在这里，重点阐述金纳米簇的合成、表面修饰、光学性质以及在重金属离子检测方面的应用。生物大分子如多肽和蛋白质也被应用于合成具有强荧光的金属纳米粒子-荧光金纳米簇。以蛋白质为模板合成荧光金纳米簇最经典的方法当属Xie [Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters, Xie J P, Zheng Y G, Ying J Y. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131 (3): 888–889. ]等人用牛血清蛋白为模板合成的具有红色荧光的金纳米簇。制备的金纳米簇具有较高的荧光量子产率(6％)，较好的稳定性。这里牛血清蛋白起到还原剂和稳定剂的作用。由于该方法操作简单，且绿色环保，所有一经报道就得到了研究者的广泛关注。

碳纳米材料的一个重要的性质在于维度。目前人们对零维材料的研究主要集中在碳量子点上。纳米材料的尺寸和形状会影响它们的性质。当纳米材料的尺寸小于激子尺寸的时候，随着纳米材料尺寸的变大，其荧光发射光谱会发生红移，这就是所谓的量子限制效应。然而碳量子点没有类似于其他荧光碳纳米材料的与尺寸相关的量子限制效应。其次，随着纳米材料尺寸的减小，其表面原子数会随之增加。而由于表面原子周围缺少相邻的原子，有许多悬空键，具有不饱和性，易与其他原子相结合而稳定下来，故表现出很高的化学活性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种牛血清白蛋白功能化金纳米簇及应用。

一种牛血清白蛋白功能化金纳米簇，它是由下述方法制备的，包括：

1）在不断的搅拌下，取 9.5-10.5 mM 的氯金酸溶液4.8-5.2mL加入49-51 mg/mL BSA 4.8-5.9 mL溶液中，反应；

2）加入 0.9-1.1 M的NaOH 溶液0.49-0.51 mL，然后将混合溶液在 36-38 °C 下持续搅拌反应 10-14小时，即得。

步骤1）所述的氯金酸溶液浓度为10mM，加入5.0mL， BSA溶液为50mg/mL，加入5.0 mL；反应时间为2分钟；

步骤2）所述的NaOH 溶液浓度为1 M，加入0.50 mL，温度为37°C，搅拌反应时间为12小时。

所述的牛血清白蛋白功能化金纳米簇检测Hg²⁺的用途。

本发明的又一个目的是金纳米簇和碳量子点复合荧光探针及应用。

一种荧光碳量子点，它是由下述方法制备的，包括：

1）将每2.05-2.15 g的柠檬酸添加到3.4-3.6 g的34-36 mmol二乙烯三胺中，反应物加热到165-175 ^oC，保持28-32分钟；自然冷却到室温；

2）将（5-10 mL）丙酮加入到反应物中，离心收集沉淀物，沉淀物经透析袋超纯水透析中，除去的小分子，冷冻干燥。

步骤1）所述的柠檬酸为2. 10 g；二乙烯三胺浓度为35 mmol，加入3.5 g；加热到170 ^oC；

步骤2）所述的透析袋为3.0 kDa。

所述的一种荧光碳量子点检测Cr⁶⁺的用途。

本发明的又一个目的是提供金纳米簇和碳量子点复合荧光探针及应用。

金纳米簇和碳量子点复合荧光探针， 它包括：所述的牛血清白蛋白功能化金纳米簇和所述的一种荧光碳量子点，摩尔比为1 : 1 -5；

所述的摩尔比1 : 2-4；

所述的摩尔比为1 :3。

所述的金纳米簇和碳量子点复合荧光探针检测Hg²⁺和\或Cr⁶⁺的用途。

本发明提供了金纳米簇和碳量子点复合荧光探针，它包括：牛血清白蛋白功能化金纳米簇和一种荧光碳量子点，摩尔比为1 : 1 -5；牛血清白蛋白功能化金纳米簇是由氯金酸溶液、BSA 4溶液和NaOH 溶液反应制备的，荧光碳量子点是由柠檬酸、二乙烯三胺和丙酮反应制备的；

金纳米簇和碳量子点多功能探针(AuNCs-CDs)通过荧光法可同时检测出水溶液样品中含有的微量的重金属离子Hg²⁺和Cr⁶⁺。加入汞离子，红色荧光淬灭，显现蓝色荧光，642 nm处的特征峰有明显的降低；加入六价铬离子，蓝色荧光淬灭，显现红色荧光，444 nm处的特征峰有下降趋势，当二种离子同时存在时，红光和蓝光都发生淬灭，二处的荧光光谱强度也都降低，这种多功能探针可以同时实现分别检测二种离子Hg²⁺和Cr⁶⁺单独或同时存在，并通过荧光光谱和荧光比色清晰地显现结果。

由于组成多功能荧光复合探针的BSA-AuNCs和CDs分别针对Hg²⁺和Cr⁶⁺具有特异性识别响应，并且由于两种荧光纳米探针BSA-AuNCs和CDs分别呈现不同颜色的荧光发射，在紫外光源激发下，BSA-AuNCs呈现红色荧光，而CDs呈现蓝色荧光，当它们组成多功能复合探针时，二者之间的荧光发射相互不受影响，两种荧光的颜色也发生了叠加，在紫外激发下成为粉色荧光，各自的探针的检测效果也相互不受干扰，且具有较高的灵敏度和选择性，当同时存在二种离子时，组成多功能复合探针的二种荧光探针都发生了淬灭，显现出更明显的检测效果，从而实现了分别检测不同种离子和二种离子同时存在时的区别效果。

本发明旨在通过将金纳米簇和荧光碳量子点两种性质稳定，且具有不同的荧光发射，分别对不同的重金属离子有响应的探针的混合，进而达到同时实现检测不同种重金属离子的效果。由于重金属离子的种类较多，包括 Cr⁶⁺、Te³⁺、Co³⁺、Se⁶⁺、Pu³⁺、Hg²⁺、Mn⁴⁺ 等 ，在检测过程中，不但操作耗时耗财，大多也需要重复操作，探针也需要多种，比较麻烦，因此，我们尝试试制组合荧光纳米多功能探针，将具有不同发射荧光的金属荧光纳米簇与碳量子点进行组合，再通过系统研究金属荧光纳米簇与碳量子点的组合配比及组合后的荧光性质，并考察组合后探针对其原响应的重金属离子的检测效果，及组合后探针同时检测不同各类重金属离子的检测应用。

1、本发明提供了金纳米簇和碳量子点复合探针（AuNCs-CDs）的制备方法，具有对不同种重金属离子的多功能检测性能，并且提供的荧光检测探针灵敏度高、选择性好，检测限低。

2、不需要大型仪器，通过裸眼观察或荧光光谱，即可识别检测结果，简单、快速、易操作，可进行现场原位快速检测。

3、本发明易制备和保存；在4°C条件下可保存8～15个月不发生变化。

4、本发明所用试剂和操作过程均无毒副作用。

附图说明

图1金纳米簇及向其中加入汞离子的荧光光谱对比图；

图2碳量子点及向其中加入六价铬离子的荧光光谱对比图；

图3金纳米簇,碳量子点和综合探针的对比荧光光谱图；

图4综合探针及向其中加入汞离子、六价铬离子和同时加入汞离子和六价铬离子的荧光光谱对比图；

图5为AuNCs-CDs多功能荧光探针的透射电镜照片；

图6其中a为AuNCs-CDs多功能荧光探针检测Hg²⁺灵敏度的荧光光谱，插图为荧光强度与Hg²⁺浓度的线性关系；b、紫外光源照射下的荧光对比图；

图7为综合探针对六价铬离子的灵敏度检测曲线及在紫外下的荧光对比图；

图8 其中a为AuNCs-CDs多功能荧光探针检测Hg²⁺和Cr⁶⁺选择性的荧光光谱； b、选择性直方图； c、紫外光源照射下的荧光对比图。

具体实施方式

实施例1、牛血清白蛋白功能化金纳米簇（BSA-AuNCs）的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

在不断的搅拌下，取 5 mL，10 mM的氯金酸溶液加入 5 mL的50 mg/mL BSA 的溶液中，2分后，加入 0.5 mL, 1 M 的NaOH 溶液，然后将混合溶液在 37 °C 下持续搅拌 12个小时。溶液的颜色由原来氯金酸溶液的亮黄色变成了深棕色。BSA-AuNCs 溶液在紫外光源(254 nm)下观察其颜色，用 Perkin Elmer LS-55荧光光谱仪检测其吸收峰和发射峰的荧光光谱变化。所制得的BSA-AuNCs在紫外光源下呈现红光发射，测其荧光光谱，在470 nm的波长下激发，BSA-AuNCs在640 nm有强的发射峰，向其中加入Hg²⁺后再在紫外光源下观察红色淬灭，用荧光光谱仪检测吸收峰和发射峰荧光光谱的变化（附图1），所述BSA-AuNCs通过荧光检测的方法，可检测出水溶液样品中含有的微量的重金属离子Hg2+。

实施例2、荧光碳量子点的制备：

将2.10 g的柠檬酸添加到3.5 g（35 mmol）的二乙烯三胺（DETA)中，并将混合后的反应物在油浴中加热，反应物从室温加热到170 oC,并在170度下加热30分钟。然后将反应混合物从油浴中取出，并且自然冷却到室温。将丙酮加入到反应物中，沉淀通过离心收集。得到的白色固体放入透析袋（3.0 kDa）中，用水透析两天来除去其中的小分子。每六小时换一次水，得到的在透析袋中被冷冻干燥的黄色固体即为碳量子点。所制得的荧光碳量子点在紫外光源下呈现蓝光发射，用Perkin Elmer LS-55荧光分光光度计测其荧光光谱，在360 nm的波长下激发，荧光碳量子点在450 nm有强的发射峰，向其中加入Cr6+后再在紫外光源下观察蓝色淬灭，用荧光光谱仪检测吸收峰和发射峰荧光光谱的变化（附图2）。所述荧光碳量子点通过荧光检测的方法，可检测出水溶液样品中含有的微量的重金属离子Cr6+。

实施例3、BSA-AuNCs和碳量子点多功能复合探针的制备及检测应用研究：

通过调节BSA-AuNCs和碳量子点的物质的量比的变化来研究对混合溶液的荧光强度的影响：通过控制稀释了10倍的BSA-AuNCs用量一定，改变以柠檬酸为碳源合成的纳米碳量子点稀释150倍溶液的用量使两者的摩尔比分别为1 : 1，1 : 2，1 : 3，1 : 4，1 : 5每组实验平行做3次，分别测定所得混合溶液的荧光强度，选取荧光强度最大的摩尔比1 : 3为最佳反应条件。制备得到的金纳米簇和碳量子点混合溶液（AuNCs-CDs）通过荧光检测的方法，可检测出水溶液样品中含有的微量的重金属离子Hg²⁺和Cr⁶⁺，通过JEOLFETEM-2100透射电子显微镜测试可知AuNCs-CDs多功能荧光探针的尺寸为2 nm（附图5）。

所制得的金纳米簇和碳量子点混合溶液（AuNCs-CDs）在紫外光源下呈现粉色荧光发射，用Perkin Elmer LS-55荧光分光光度计测其荧光光谱，在365 nm的波长下激发，AuNCs-CDs在444 nm和642 nm处有强的发射峰，向其中加入Hg²⁺在紫外光源下观察红色荧光淬灭，显现蓝色荧光发射，并且在642 nm处的吸收峰降低，在444 nm处的吸收峰无明显改变；加入Cr⁶⁺后在紫外光源下观察蓝色荧光淬灭，显现红色荧光发射，并且444 nm处的吸收峰降低，642 nm处的峰无明显的改变，当Hg²⁺和Cr⁶⁺同时存在时，AuNCs-CDs的两种荧光材料的荧光都发生淬灭，可观察到的是粉色荧光淬灭，444 nm和642 nm处的吸收峰都降低，具体的荧光光谱和紫外光源下颜色的变化情况图中所示（附图4）。

金纳米簇和碳量子点组成的多功能复合荧光探针（AuNCs-CDs）具有很强的荧光发射性质及检测性能，并且此综合探针的制备简单、环保和节约资本，所以合成AuNCs-CDs作为纳米荧光检测探针。AuNCs-CDs多功能荧光探针检测Hg²⁺、Cr⁶⁺的过程中，待测的样品与AuNCs-CDs按体积比为1 : 1的量混合，即200 µL 的Hg²⁺或Cr⁶⁺的溶液样品加入到200 µL的AuNCs-CDs中，所有的灵敏度实验和选择性实验都按以上的比例进行，具体实验过程如下：

（1）检测灵敏度

为检验使用AuNCs-CDs作为荧光探针检测Hg²⁺、Cr⁶⁺的灵敏度，需要先配制的0.001- 80 μM Hg²⁺、0.001-300 μM Cr⁶⁺溶液，将不同浓度的Hg²⁺、Cr⁶⁺溶液分别与AuNCs-CDs反应，然后分别用Perkin Elmer LS-55荧光分光光度计测试样品的荧光光谱来验证探针的灵敏度。从荧光光谱（附图6、7）中可以看出，AuNCs-CDs的荧光发射峰都在444 nm处是BSA-AuNCs的特征峰，在642 nm处是碳量子点混合溶液的特征发射，并且随着Hg²⁺浓度的升高，AuNCs-CDs的红色荧光强度是逐渐降低的，显现蓝色荧光。在当Hg²⁺浓度为80 μM时，AuNCs-CDs的红色荧光强度几乎完全淬灭，从而显现深蓝色的荧光。随着Cr⁶⁺浓度的升高，AuNCs-CDs蓝色的荧光强度是逐渐降低的，显现红色荧光，当二种离子都同时存在时，红色和蓝色荧光都被淬灭，从而指示二种离子同时存在于检测样品中。进行检测灵敏度的检测，AuNCs-CDs作为检测探针的荧光强度与1 nM-100 nM 浓度的Hg²⁺有良好的线性关系（附图6插图），并且与1 nM-500 μM浓度的Cr⁶⁺也有良好的线性关系（附图7插图）。因此，AuNCs-CDs可以作为检测Hg²⁺和Cr⁶⁺的荧光探针快速并定量地检测水溶液中Hg²⁺和Cr⁶⁺的存在。

（2）选择性

使用金纳米簇和碳量子点的混合溶液（AuNCs-CDs）作为荧光探针检测Hg²⁺、Cr⁶⁺，需要分别考察其对Hg²⁺、Cr⁶⁺的选择性。相同条件下，浓度为100 μM的Cd²⁺，Hg²⁺，Cr⁶⁺，Ba²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Mg²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Pb²⁺，Ag⁺，Fe³⁺溶液，分别与AuNCs-CDs荧光检测探针混合反应后测试样品的荧光光谱，从荧光光谱图中可以看出，加入Cd²⁺，Ba²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Mg²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Ni²⁺，Pb²⁺，Ag⁺后，AuNCs-CDs的峰没有发生明显的改变，并且在紫外灯照射下，可观察到AuNCs-CDs依然呈现粉色荧光发射，没有出现淬灭现象。而向AuNCs-CD中加入Hg²⁺和Cr⁶⁺时，由于所制得的金纳米簇和碳量子点混合溶液（AuNCs-CDs）在紫外光源下呈现粉色荧光发射，用Perkin Elmer LS-55荧光分光光度计测其荧光光谱，在365 nm的波长下激发，AuNCs-CDs在444 nm和642 nm处有强的发射峰，向其中加入Hg²⁺在紫外光源下观察红色荧光淬灭，显现蓝色荧光发射，并且在642 nm处的吸收峰降低，在444 nm处的吸收峰无明显改变；加入Cr⁶⁺后在紫外光源下观察蓝色荧光淬灭，显现红色荧光发射，并且444 nm处的吸收峰降低，642 nm处的峰无明显的改变。（附图8）通过比较荧光光谱和其在紫外灯下的发射光可说明金纳米簇和碳量子点的混合溶液（AuNCs-CDs）对Hg²⁺、Cr⁶⁺具有很高的选择性。

当有Hg ²⁺、Cr⁶⁺同时存在时，完全由于两种荧光探针均发生响应，导致荧光淬灭，同时进行荧光光谱测试，从荧光光谱中观察AuNCs-CDs吸收峰强度的变化，当溶液中同时存在Hg²⁺和Cr⁶⁺时，溶液的荧光光谱的两个峰的吸收强度都会下降。而且，当溶液存在的Hg²⁺和Cr⁶⁺浓度很大时，AuNCs-CDs的粉色荧光会完全淬灭，并且荧光光谱吸收峰的强度会出现大幅度的降低。以此通过AuNCs-CDs多功能纳米探针可以同时实现分别检测二种离子Hg²⁺和Cr⁶⁺单独或同时存在，并通过荧光光谱和荧光比色清晰地显现结果。

从结果中可得知，组成多功能荧光复合探针的BSA-AuNCs和CDs分别针对Hg²⁺和Cr⁶⁺具有响应，并且具有不同颜色的荧光发射，当它们组成多功能复合时，相互的荧光发射强度不受影响，两种材料的不同种荧光颜色发生了叠加，成为粉色，检测效果也相互不受干扰，仍对各自的响应离子保持检测效果，且具有较高的灵敏度和选择性，当同时存在二种离子时，组成多功能复合探针的二种荧光探针都发生了淬灭，显现出更明显的检测效果，从而实现了分别检测不同种离子和二种离子同时存在时的区别效果，从而使多功能复合探针具备了多功能检测应用。