一种比率型稀土荧光探针及检测炭疽杆菌生物标志物的应用的制作方法

本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及一种双稀土金属离子掺杂的比率型荧光探针及该探针在检测炭疽杆菌生物标志物浓度的用途。

背景技术：

炭疽芽孢杆菌是革兰氏阳性形成芽孢的需氧菌，炭疽是食草动物的一种主要疾病，接触土壤中、皮毛上的芽孢可以导致感染。芽孢可以通过呼吸道、消化道和皮肤接触感染人类，以皮肤型炭疽最常见。由于炭疽芽孢在环境中的抵抗力极强，在军事方面，一直被列为是头号生物战剂，作为一个炭疽芽孢杆菌壳层的主要组成成分，2,6吡啶二羧酸（dpa）占据了约5-15%的干炭疽杆菌芽孢质量，因此可以通过定量检测dpa的含量来间接检测炭疽芽孢杆菌。

过去几十年间，国内外科学家已经采取各种各样的方法实行对dpa的定量检测，包括表面增强拉曼法，电化学检测方法等。然而，这些方法大多要求较长的时间花费，操作复杂的仪器和昂贵的试剂。因此，开发一种简单便宜，灵敏便携的检测方法对于阻止炭疽杆菌生物标志物的危害而言具有重大意义。

在仪器分析方法出现之前，就有利用比色分析原理进行待测物检测的分析方法。化学比色法利用溶液的颜色差异来确定出不同浓度，具有简便快速，大批量检测的优点。但是，该方法存在背景光线影响较大，颜色判断主观性较强，不能实现定量分析自动化等缺点。而图像处理和颜色识别技术的发展使得颜色色度量化成为可能。将图像颜色识别技术和化学比色检测结合将带来一种新的定性定量分析方法。目前，图像照片的色彩模式主要以红绿蓝（rgb）颜色标准模式为主，是通过对红（r），绿（g），蓝（b）3个颜色通道的变化及它们之间的相互叠加来得到各种颜色，这3个标准颜色几乎包括了人类视力所能感知的所有颜色，是运用最广的颜色系统之一，任何一个颜色都可以由一组rgb值来记录和表达。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供的一种稀土金属离子掺杂的比率型荧光探针及该探针用于检测dpa的应用，以克服现有检测dpa的方法中复杂的前期准备及昂贵的大型仪器使用，难以实现精确、简易、便携快速检测的缺陷。

实现本发明目的具体技术方案是：

一种比率型稀土荧光探针，特点是：将稀土铽离子溶液(tb³⁺)和吡啶二羧酸（dpa）通过反向微乳液法合成得到结构式为tb/dpa@sio2的前驱体；经离心洗涤配制浓度范围为0.5~1mg/ml水溶液后加入等摩尔比的稀土铕离子溶液eu³⁺和鸟嘌呤核糖核苷酸溶液(gmp)，经震荡反应后，离心洗涤得到结构式为tb/dpa@sio2-eu/gmp的荧光探针；利用tb³⁺的荧光强度值与eu³⁺的荧光强度值两者的比值构成比率型稀土荧光探针tb/dpa@sio2-eu/gmp。

所述反向微乳液组成为体积比例为：正己醇︰曲拉通x-100︰环己烷︰正硅酸乙酯溶液(teos)=200︰200︰800︰17。

所述稀土铕离子溶液eu³⁺和鸟嘌呤核糖核苷酸溶液(gmp)的最终反应浓度为0.5~2mm。

一种基于比率型稀土荧光探针用于炭疽杆菌生物标志物dpa的检测方法，特点是：在含tris-hcl缓冲液的溶液中加入tb/dpa@sio2-eu/gmp荧光探针，待溶液稳定后加入待测dpa溶液进行反应，发生荧光增强现象，通过时间分辨荧光分析方法来测定dpa的浓度；其中：所述荧光探针溶于水形成浓度为0.1~0.2mg/ml的tb/dpa@sio2-eu/gmp水溶液；所述缓冲液的溶液浓度为20~50mm，ph值为4～9；所述反应温度为5～35℃，所述待测dpa溶液的浓度为0.025～2μm。

所述荧光探针最低检测线为7.3nm的dpa溶液，可实现高灵敏度，高选择性的dpa浓度检测。

一种基于比率型稀土荧光探针的试纸，特点是，将普通滤纸剪成直径为5~8mm的圆形纸片，浸泡在浓度为1~5mg/ml荧光探针溶液中10~30分钟后，在自然状态下晾干，制得附有荧光探针的试纸。

一种上述试纸在可视化检测dpa浓度上的应用，特点是：所述试纸在加入不同浓度的dpa后具有不同的颜色响应，随着dpa浓度逐渐增加，试纸颜色逐渐改变，根据颜色的强度值来量化dpa的浓度，能够对dpa浓度实时在线、智能检测。

所述试纸在紫外灯照射下呈绿色，加入低浓度dpa后试纸仍为绿色，而加入高浓度dpa后试纸变为红色，通过颜色识别，扫描分析试纸颜色的红色red，绿色green，蓝色blue数值，加入低浓度dpa后试纸颜色的红r：绿g强度比值(r/g)小，加入高浓度dpa后试纸颜色的红r/g值大，根据r/g值大小确定dpa浓度。

与现有技术相比，本发明有益效果包括如下：

1.本发明改变了目前常用的检测dpa的检测模式，无需复杂的前期样品准备，不需要使用昂贵的大型仪器，节约了成本；

2.本发明是目前第一次报道采用一种双稀土金属离子掺杂的比率型荧光探针及可视化试纸途径，首次提出使用图像颜色识别手机软件来实现对dpa的定量分析检测；

3.本发明检测方法用量少，整个反应体系仅需微量级的即可，节约了探针的使用量，实现了微量低成本的检测。该荧光探针中原材料获取简单价格低廉，应用到血液中dpa的检测实用性强；

4.本发明检测方法能够有效减少环境因素的影响，使用稀土铽离子的绿色荧光作为参比信号，稀土铕离子的红色荧光作为响应信号，并且该荧光探针具有较长的荧光寿命（达到ms级），从而可以采用时间分辨荧光分析的方法，能够有效消除检测过程中的背景荧光和散射荧光的影响，从而可以显著提高灵敏度和信噪比；

5.本发明检测响应速度快，直接采用待测物质dpa敏化该荧光探针，整个检测dpa过程不超过1分钟。本发明方法测定dpa的浓度范围0.025～2μm，最低检测浓度为7.3nm，具有较高的灵敏度和选择性。

附图说明

图1是本发明荧光探针制备及检测原理图；

图2是本发明所制备荧光探针的表征图；

图3是本发明应用于检测dpa的实验结果图；

图4是本发明所制备的试纸用于可视化检测dpa浓度的实验结果图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

如图1所示，本发明的比率型稀土荧光探针是一种双稀土金属离子掺杂的比率型荧光探针：将稀土铽离子溶液(tb³⁺)和2,6吡啶二羧酸（dpa）通过反向微乳液法合成得到结构式为tb/dpa@sio2的前驱体；经离心洗涤配制为溶液后加入等摩尔比的稀土铕离子溶液eu³⁺和鸟嘌呤核糖核苷酸溶液(gmp)，经震荡反应后，离心洗涤得到结构式为tb/dpa@sio2-eu/gmp的荧光探针，利用tb³⁺的荧光强度值与eu³⁺的荧光强度值两者的比值构成比率型稀土荧光探针tb/dpa@sio2-eu/gmp，所述荧光探针可用于检测dpa。该探针中，tb/dpa@sio2被包裹进入由eu/gmp聚合物形成的网状结构中，形成双稀土掺杂的聚合物tb/dpa@sio2-eu/gmp。该探针与dpa作用后，tb/dpa@sio2由于二氧化硅壳层的保护作用发射稳定的绿色荧光作为参比信号，而dpa作为天线配体敏化eu/gmp产生红色荧光信号作为待测物的响应信号，从而实现对dpa的比率型荧光检测。

本发明包括以下步骤：

(1)制备荧光探针的方法：通过反向微乳液法制备tb/dpa@sio2-eu/gmp比率型荧光探针，其中tb的绿色荧光作为参比荧光，eu的红色荧光作响应荧光；

(2)通过时间分辨荧光检测方法实现对dpa的检测：取10μl所获得的tb/dpa@sio2-eu/gmp比率型荧光探针并加入待测的dpa标准溶液或血清样品进行反应。所述待测的dpa标准溶液的浓度为0.025～2μm。在具体实施方案中，血清样品为大鼠血清样品；

(3)制备可视化试纸：通过将滤纸浸泡在荧光探针溶液中，制附有荧光探针的试纸，进一步开发了一种便携式的试纸用于可视化检测dpa；

(4)可视化试纸检测dpa：通过颜色识别的手机软件，扫描出加入不同浓度dpa后试纸颜色的rgb值，实现dpa的定量检测。

本发明的反应体积可控制在微升级别，体积为100μl。优化实验方案可表述如下：

取10μl待测溶液加到90μl荧光探针溶液中，通过时间分辨荧光分析法进行检测。

所述荧光探针中，所述荧光探针的浓度为0.01~1mg/ml,优选地，为0.1mg/ml。

所述待测dpa溶液的反应浓度为0.025～2μm。

所述缓冲液为tris-hcl，其浓度为40mm，ph值为7.0～9.0；优选地，ph=7.4。

所述反应温度为4~40℃，优选地，为室温条件下。

所述反应时间为0~2分钟，优选地，反应时间为1分钟。

本发明方法为微量检测方法。在具体实施方案中，本发明的最低检测浓度为7.3nmdpa溶液。

荧光光谱检测：多功能酶标仪（infinitem200pro,tecan，switzerland）或同性能光谱仪，激发波长：272nm，延迟时间：50μs；积分时间：2000μs；扫描波长范围：450～750nm，使用384微孔黑板，取100μl反应液进行测定。

实施例1

首先制备荧光探针；将500μl含9.0mgedc和2.8mgnhs的无水乙醇加入600μl的20mmdpa溶液，并搅拌40分钟。接着，加入100μlaptes并反应100分钟。然后，加入200μl20mmtb(no3)3溶液到混合溶液中。将所得到的混合物作为前体。然后，用反相微乳液法制备tb/dpa@sio2。使用1ml正己醇，1ml曲拉通x-100和4ml环己烷制成微乳液并加入到300μl之前所制备的tb/dpa溶液中，40分钟持续搅拌后，在溶液中加入25μl氨水溶液(28%)和85μlteos的。搅拌反应持续24小时。等体积丙酮被用于从微乳液中分离纳米颗粒，并使用乙醇和水冲洗离心3次。为了制备氨基改性的tb/dpa@sio2-nh2，将tb/dpa@sio2悬浮于上述的微乳液。然后加入20μlaptes溶液中并搅拌反应2小时。最后，使用与上述相同的方法收集纳米颗粒。将所得到的tb/dpa@sio2-nh2在40°c干燥箱中干燥。

实施例2

将500μl2mmgmp溶液和1.0ml0.5mg/ml的tb/dpa@sio2-nh2溶液混合，然后震荡30分钟。接着，将500µl2mmeu(no3)3加入到混合溶液中并在室温下摇动100分钟。然后，在10000rpm下离心5分钟来收集该产物，并用超纯水洗涤3次，以除去未反应的试剂。最后，将tb/dpa@sio2-eu/gmp混合物保存在2mlh2o中以供进一步使用。(所制备的材料表征如图2所示，图2(a)是tb/dpa@sio2-nh2的透射扫描电镜表征图，图2(b)是tb/dpa@sio2-nh2的透射扫描电镜表征图，图2(c)是tb/dpa@sio2-nh2,tb/dpa@sio2-eu/gmp,tb/dpa@sio2-eu/gmp/dpa的红外光谱表征图，图2(d)是tb/dpa@sio2-eu/gmp/dpa的荧光激发ex和发射光谱图em)。

实施例3

以制备的荧光探针和前述检测条件对dpa进行检测。将80μltris-hcl缓冲液（ph7.4，50mm）加入到10μl所制备的tb/dpa@sio2-eu/gmp溶液中。之后，将10μl不同浓度的dpa（0.25-20µm）加入到上述溶液中。tris-hcl的最终浓度为40mm，而dpa的最终浓度是在0.025-2.0µm范围。为了探究检测dpa的比率型荧光探针的选择性，选择不同的材料进行干扰性实验，包括苯氧基乙酸（poa），对苯二甲酸（p-pa），苯甲酸（ba），半胱氨酸（cys），谷氨基酸（glu），这些物质的最终浓度为50μm。最后，在272nm波长激发下记录发射光谱。浓度0.025-2.0µm时，荧光强度与dpa浓度呈线性相关：y=1.225x+0.033，r²=0.9911，基于空白样品三倍标准偏差，得到的dpa的最低检测浓度为7.3nm（如图3所示，图3(a)为分别加入0.025~2µm浓度的dpa后的荧光谱图，图3(b)为加入0.025~2µm浓度的dpa后,在618nm波长处和548nm波长的荧光强度f618/f548比值随着dpa浓度的变化而变化的线性图，图3(c)是荧光探针的选择性实验图，图3(d)是混样竞争性实验结果图）。

实施例4

为了进一步探究该探针是否可用于生物实际样本检测，使用该探针来检测血清样品中的dpa含量。通过标准加入方法将含有不同浓度dpa的一系列血清样品加入到检测体系中。表1是本发明用于血液中检测dpa的实验结果，如表1所示，血清样品的回收率在95.70%至104.65%之间，相对标准偏差（rsd，n=3）都低于5%，证明tb/dpa@sio2-eu/gmp时间分辨比率型荧光探针可适用于复杂实际样品中dpa的分析检测。

表1

实施例5

开发一种简便的可视化试纸：通过将滤纸浸泡在荧光探针溶液中，制得附有荧光探针的试纸，用于快速检测dpa含量。如图4(a)所示，试纸在紫外灯照射下不加入dpa时试纸呈绿色，逐渐增加加入dpa的浓度，试纸由绿色变为红色，且加入高浓度dpa试纸后呈红色，如图4(b)所示，通过颜色识别手机软件，扫描分析颜色的红色red，绿色green，蓝色blue数值，加入低浓度dpa后试纸颜色的红r：绿g强度比值(r/g)小，加入高浓度dpa后试纸颜色的红r/g值大，根据r/g比值和dpa浓度的线性关系间接确定出dpa的浓度，试纸的最低可检测浓度（ldc）约为1μm。因此，用于dpa测定的tb/dpa@sio2-eu/gmp试纸和手机软件联用的方法具有快速便携，价格低廉的优点并且在实际应用中具有巨大的应用潜力。

综上结果，基于tb/dpa@sio2-eu/gmp聚合物的双稀土金属离子掺杂的时间分辨比率型荧光探针首次合成，其中tb/dpa@sio2用作稳定的内参比，eu/gmpcp用作待测物的灵敏信号响应。时间分辨比率型荧光探针显示出对dpa检测较高的灵敏度和选择性；检出限为7.3nm，线性范围为0.025～2μm，线性相关系数0.9911。用标准加入法检测大鼠血清中的dpa，血液中的其他共存物并未对其检测造成影响。本发明的实用性和生物相容性强，能够有效避免实际样品中共存物对检测的干扰。此外，使用固定有tb/dpa@sio2-eu/gmp的滤纸成功地设计了用于dpa测定的简易试纸，并且可以在uv灯下通过肉眼直接观察从绿色到红色的颜色转换。该新型简易试纸满足了快速方便检测dpa的需求，通过图像颜色识别手机软件可以根据r/g的数值间接确定dpa的浓度，避免了复杂的操作和昂贵仪器的使用，仅用手机软件便可实现快速检测。因此，该时间分辨比率荧光探针是可信，准确，灵敏的，并将在实际应用中提供更灵活简便的传感策略，促进了图像识别技术在化学分析检测方面的应用。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明范围。凡依本发明内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明保护范畴。