一种产气荚膜梭菌α毒素抗体捕获ELISA检测方法与流程

本发明涉及动物细菌学领域，本发明提供了一种产气荚膜梭菌α毒素抗体捕获ELISA检测方法。

背景技术：

产气荚膜梭菌(C.perfringens)又称魏氏梭菌(C.welchii)，广泛存在于自然环境中，并见于几乎所有温血动物的消化道内，属于人和动物肠道内正常菌群的成员。产气荚膜梭菌能引起羔羊痢疾和羔羊、牛犊、仔猪、家兔、雏鸡的坏死性肠炎、肠毒血症等疾病，发病急、死亡率高，是严重危害养殖业的重要疾病，是近年来我国家畜“猝死症”的主要病原，给各国畜牧业发展带来巨大经济损失。各型产气荚膜梭菌均产生α毒素(CPA)，本菌能引起人类气性坏疽及多种动物的肠毒血症和坏死性肠炎，当家畜被感染后其体内产生α毒素抗体，因此α毒素抗体是诊断产气荚膜梭菌病的重要依据之一。

现有技术中小白鼠毒素中和试验是检测产气荚膜梭菌毒素抗体的经典方法,虽然准确可靠,但费时、费工。而卵磷脂水解抑制试验欠敏感,且重复性差,操作繁琐,难于推广应用。近年来随着生物技术的发展，国外已经出现多种检测产气荚膜梭菌毒素抗体的商品检测试剂盒，但价格昂贵，因此为了弥补国内产气荚膜梭菌α毒素抗体检测的空白，急切需要建立快速、灵敏、特异并能大批量检测的ELISA方法，为产气荚膜梭菌病诊断、研究提供有效工具。

本发明的发明人曾经申请过的专利：“一种A型产气荚膜梭菌毒素抗体的间接ELISA检测方法”虽然公开了A型产气荚膜梭菌外毒素抗体的间接ELISA检测方法，但是由于其检测的是A型产气荚膜梭菌的所有外毒素，特异性差，无法定性的检测产气荚膜梭菌α毒素，因此难以填补现有技术的空白。

技术实现要素：

证实针对现有技术的上述情况，本发明的发明人提供了提供了一种产气荚膜梭菌α毒素抗体的捕获ELISA检测方法，该方法以制备的A型产气荚膜梭菌外毒素为抗原，一是用来免疫兔制备高免血清，二是浓缩、纯化后作为捕获ELISA的结合抗原；检测方法包括以下步骤：(1)包被(2)封闭(3)加抗原(4)加待检样品(5)加入二抗(6)显色(7)终止(8)结果判定。此方法具有特异性高、灵敏度强、可重复性好、成本低等优点，另外此方法可以大批量检测样品，为该病的检测和研究提供了有效，简便的血清学诊断方法。

与先前申请的A型产气荚膜梭菌毒素抗体的间接ELISA检测方法不同，本发明的方法可以特异性地检测产气荚膜梭菌α毒素，准确率和特异性均比先前技术有明显的提高，最终所建立的捕获ELISA检测产气荚膜梭菌α毒素抗体方法可用于大批量样品检测，为畜禽产气荚膜梭菌病的诊断及研究提供了更快速、有效的工具，并为疫苗质量和食品安全监测的研究奠定了坚实的基础。

发明人在本发明中所采用的A型产气荚膜梭菌采用现有菌种，特别选自菌种NCTC528(保藏于National Collection of Type Cultures英国国家典型培养物保藏中心，保藏号:NCTC528)，可通过现有渠道直接获得，故而该生物材料属于现有技术中可直接获得的材料，不需进行单独的生物保藏。

本发明的具体技术方案中主要含有如下几个特殊之处：

1A型产气荚膜梭菌毒素抗原的制备:

A型产气荚膜梭菌菌种NCTC528接种于血平板培养基上进行复苏，37℃厌氧培养36h，选取单个的菌落接种液体硫乙醇培养基增菌12小时，然后将增菌液按体积百分比5％接种于改良的Gordon汤中，45℃培养5h产毒，将培养物离心后用0.22um蔡氏滤器过滤除菌，得到除菌后的A型产气荚膜梭菌外毒素；取其一部分用甲醛灭活免疫家兔，剩余所获得的外毒素经硫酸铵沉淀，再经透析袋除盐，Sephadex-G25柱层析对外毒素进行除盐纯化浓缩，作为捕获ELISA的捕获抗原；

获得上述外毒素之后，发明人利用LD₅₀实验测定所产外毒素的活性。

如上所述，发明人利用其进行了如下的具体应用：

(1)甲醛灭活外毒素，得到类毒素，与弗氏佐剂乳化，作为免疫家兔的抗原；

(2)硫酸铵沉淀，再经透析袋除盐，Sephadex-G25柱层析对外毒素进行除盐纯化浓缩，作为捕获ELISA的捕获抗原。

2.抗产气荚膜梭菌α毒素杂交瘤细胞的复苏及单克隆抗体的制备纯化；

将产气荚膜梭菌α毒素的杂交瘤细胞株F12，(保藏于中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号：CGMCC No.8870)进行常规复苏、培养；选择6-8周龄雌性BALB/c小鼠10只，腹腔注射弗式不完全佐剂0.5mL/只致敏，一周后注射阳性杂交瘤细胞株F12,剂量0.5-1×10⁶个/只，7-10天后收集小鼠腹水，得到大量产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体，腹水经正辛酸-硫酸铵方法纯化，SDS-PAGE检测纯化效果。

3.抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体的制备：

选取1.0-1.5Kg健康未接种过疫苗的家兔5只，将灭活的上述外毒素2mL和弗氏完全佐剂按照体积1:1混合乳化，背部皮肤多点注射1mg/只；首免两周后，将灭活的外毒素2mL和弗氏不完全佐剂按照体积1:1混合乳化，注射剂量与方法同上；2周后同种方法进行三免；三免后2周用无佐剂抗原加强免疫，剂量与方法同上，所得高免血清作为捕获ELISA阳性对照血清；对照组注射生理盐水，并保证与实验组采取相同的免疫程序，同步进行实验，所得血清作为捕获ELISA阴性对照血清。

在获得了上述三个重要技术要素之后，发明人进一步提供了捕获ELISA检测方法如下：

(1)包被：将上述获得的产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体用抗原包被液稀释到0.3μg/ml,每孔100μL，加入到96孔酶标板，密封4℃过夜；

(2)封闭：用PBST洗涤液洗涤上述酶标板3次，每次3min，洗涤完成后，加入含5wt％脱脂奶粉的PBST溶液作为封闭液，每孔200μL，4℃封闭过夜；

(3)加抗原：用PBST溶液洗涤上述酶标板3次每次3min并拍干，每孔加入用PBS稀释至2ug/ml的捕获抗原100ul，37℃孵育1h；

(4)加待检血清：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，每孔加入用PBS缓冲液以1:160体积比稀释的被检血清，100μL/孔，同时设置阴阳性和空白对照，PBS缓冲液作为空白对照，37℃孵育1h；

(5)加二抗：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，加入用PBS缓冲液按1:8000体积比稀释的HRP标记的羊抗兔IgG,37℃孵育1h；

(6)显色：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，最后加入可溶性TMB底物显色液100μL/孔,37℃条件避光反应15min；

(7)终止：每孔加100ul2M H₂SO₄溶液终止反应，450nm处读取吸光值。

5.结果判定标准的确定

计算阴性样品平均值与标准差(SD)，求得为阳性临界值，为阴性临界值。运用建立的捕获ELISA方法测定OD_450nm，为阳性，为阴性，为可疑样品。

在上述间接ELISA检测方法中，所述的血平板培养基成分为：100ml去离子水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5％体积比脱纤绵羊血；

所述改良的Gordon汤产毒培养基成分为：蛋白胨2g，糊精1g，酵母提取物2g，l-精氨酸1.2g,葡萄糖1g，最后PBS定容至100ml，浓盐酸调节pH为7.5，高温灭菌即得；

所述的抗原包被液为：0.1M碳酸盐缓冲液，pH 9.6(该包被液的效果针对本发明的抗原包被效果最佳)；

所述的PBS缓冲液成分为：1L去离子水、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：0.27g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)：1.42g、氯化钠(NaCl)：8g、氯化钾(KCl)0.2g，pH 7.4；

所述PBST洗涤液成分为：500μL Tween-20溶解于1L的PBS中；

所述封闭液成分为：5g脱脂奶粉溶于100mlPBST中；

所述终止液(2M H₂SO₄)成分为：量取浓H₂SO₄ 27.6ml加入到450ml去离子水中，混匀后定容至1L。

采用本发明上述公开的检测方法，具有如下有益效果：

(1)特异性强：与天然α毒素血清抗体有较强的反应性，与用大肠杆菌、沙门氏菌，鸭疫里默氏杆菌抗体血清检测结果均为阴性，表明无交叉反应，特异性较强；与间接法相比间接的是测多种毒素抗体，本发明中的方法只测α毒素抗体，特异性强；

⑵敏感性高：上述所制得阳性血清测其血清滴度与经典小鼠中和实验做比较。将阳性血清按1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640连续倍比稀释后，进行ELISA检测，检测的血清滴度为1:640。小鼠中和实验结果测得出0.1ml血清能中和400个毒素对小鼠的最小致死量，结果说明所建ELISA方法敏感性较高。

⑶重复性好：分别从3次包被的96孔酶标板中随机抽取1块，检测临床上已知背景的血清10份。每份血清重复做3次，每次分别设1孔阴阳性对照。比较阴阳性血清的OD值，由批内和批间检测样品的重复性结果显示，批内变异系数为1.21％-6.53％，批间变异系数为1.78％-7.31％，两者均小于10％，说明同一样品在同批和不同批试验中变异程度小，说明该方法具有很好的重复性。因为没有动物实验的个体差异，试验的稳定性好，且有利于动物福利保护。

附图说明：

图1为A型产气荚膜梭菌粗提外毒素蛋白SDS-PAGE电泳分析图；

图中1、2泳道样品在43KD处有产气荚膜梭菌主要的外毒素(α毒素)的明显条带。

图2为小鼠腹水纯化后的SDS-PAGE分析图；

图中1、2泳道样品可以看到两条很明显的蛋白条带：53kD左右的重链和23kD左右的轻链，且并无其他杂带，结果表明其纯化的效果较好,其纯度均达到90％以上。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学等技术手段为本领域技术人员所熟知。

实施例中所用的试剂及其来源：弗式完全佐剂与弗式不完全佐剂、Tween 20均购自美国Sigma公司；羊抗兔IgG-HRP和羊抗小鼠IgG-HRP均购自杭州华安生物技术有限公司；96孔酶标板购自Solarbio公司；厌氧肉肝汤、液体硫乙醇酸盐培养基购自青岛海博生物；可溶性TMB底物显色液购自天根生化科技有限公司；抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体F12的杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏中心(保藏号：CGMCCNo.8870)；其他所用化学试剂均为分析纯。

实施例中涉及的试剂如下：

所述的血平板培养基成分为：100ml去离子水、3.7g豆粉琼脂、1g葡萄糖和5％体积比脱纤绵羊血；

所述改良的Gordon汤产毒培养基成分为：蛋白胨2g，糊精1g，酵母提取物2g，l-精氨酸1.2g,葡萄糖1g，最后PBS定容至100ml，浓盐酸调节pH为7.5，高温灭菌即得；

所述的抗原包被液为：0.1M碳酸盐缓冲液，pH 9.6；

所述的PBS缓冲液成分为：1L去离子水、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：0.27g、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)：1.42g、氯化钠(NaCl)：8g、氯化钾(KCl)0.2g，pH 7.4；

所述PBST洗涤液成分为：500μL Tween-20溶解于1L的PBS中；

所述封闭液成分为：5g脱脂奶粉溶于100mlPBST中；

所述终止液(2M H₂SO₄)成分为：量取浓H₂SO₄ 27.6ml加入到450ml去离子水中，混匀后定容至1L。

实施例1A型产气荚膜梭菌外毒素的制备与纯化

A型产气荚膜梭菌菌种(National Collection of Type Cultures-英国微生物菌种保藏中心保藏保藏号:NCTC528)接种于血平板培养基上进行复苏，37℃厌氧培养36h，挑取单个的菌落到硫乙醇酸盐营养肉汤增菌培养基中，在气体浓度为88％N₂、7％H₂、5％CO₂的厌氧环境条件下38℃厌氧培养12h。将5mL A型产气荚膜梭菌增菌液接种到100ml pH7.5的产毒培养基中(每100mL PBS缓冲液溶解2g蛋白胨、1g糊精、2g酵母提取物和1.2gL-精氨酸，1g葡萄糖)中，在厌氧环境下振荡培养，43℃培养5h高效产毒，然后在4℃8000r/min离心15min，再用孔径0.22μm的蔡氏滤器中过滤除菌，即得到除菌后的A型产气荚膜梭菌的外毒素。最终测得外毒素的LD₅₀＝2^4.25，即将外毒素稀释19.03倍，腹腔注射1ml，能够使半数小鼠死亡。

将除菌后的毒素溶液缓慢加入饱和硫酸铵溶液，最终使混合溶液中硫酸铵的体积浓度达到50％，4℃静置过夜；次日，将溶液8000r/min离心20min，弃掉上清，沉淀用适量0.05M Tris-HCL缓冲液溶解，缓慢加入饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵的最终浓度达到40％，重复上述操作，最后将沉淀溶解于Tris-HCL中；接着用Sephadex-G25柱层析对外毒素进行除盐纯化浓缩；将纯化后的毒素蛋白经SDS-PAGE电泳，分析蛋白纯度,结果显示分子量43KD处有明显条带(如图1所示)，为主要致病外毒素α毒素；用分光光度计测定260nm和280nm下的吸光度值，确定毒素蛋白浓度为：(1.45×A₂₈₀－0.74×A₂₆₀)×稀释倍数。

实施例2抗产气荚膜梭菌α毒素杂交瘤细胞的复苏及单克隆抗体的制备纯化；

将产气荚膜梭菌α毒素的杂交瘤细胞株F12，(保藏于中国微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号：CGMCC No.8870)进行常规复苏、培养；选择6-8周龄雌性BALB/c小鼠10只，腹腔注射弗式不完全佐剂0.5mL/只致敏，一周后注射阳性杂交瘤细胞株F12,剂量0.5-1×10⁶个/只，7-10天后收集小鼠腹水，得到大量产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体，腹水经正辛酸-硫酸铵方法纯化，SDS-PAGE检测纯化效果，结果如图2所示:图中1、2泳道样品可以看到两条很明显的蛋白条带：53kD左右的重链和23kD左右的轻链，且并无其他杂带，结果表明其纯化的效果较好,其纯度均达到90％以上,用分光光度计测定纯化单克隆抗体260nm和280nm下的吸光度值，确定毒素蛋白浓度为：(1.45×A₂₈₀－0.74×A₂₆₀)×稀释倍数。

实施例3抗产气荚膜梭菌α毒素多克隆抗体的制备

将实施例1中得到除菌后的A型产气荚膜梭菌的外毒素中加入甲醛使其终浓度为0.3vt％，充分混匀后，37℃灭活96h，期间每隔5-6h振荡摇晃一次；

选取1.0-1.5Kg健康未接种过疫苗的家兔5只，将灭活的上述α毒素2mL和弗氏完全佐剂按照体积1:1混合乳化，背部皮肤多点注射1mg/只；首免两周后，将灭活的外毒素2mL和弗氏不完全佐剂按照体积1:1混合乳化，注射剂量与方法同上；2周后同种方法进行三免；三免后2周用无佐剂抗原加强免疫，剂量与方法同上，所得高免血清作为捕获ELISA阳性对照血清；对照组注射生理盐水，并保证与实验组采取相同的免疫程序，同步进行实验，所得血清作为捕获ELISA阴性对照血清。

实施例3捕获ELISA检测方法的建立

通过方阵滴定法确定包被抗体(实施例2所得)及抗原(实施例1所得)的最佳配对稀释浓度，以及被检抗体的最佳稀释浓度和酶标抗体的最佳稀释浓度，并对ELISA条件进行摸索和优化，最终确定如下体系：

(1)配对抗体及抗原最佳浓度的确定

初步选择实施例2复苏并纯化的抗产气荚膜梭菌α毒素单抗F12作为捕获抗体，实施例1所提取纯化的外毒素作为结合抗原。为了确定包被抗体及抗原最佳浓度，先确定待检血清最佳稀释倍数及酶标二抗最佳稀释倍数的情况下，通过方阵实验进行最佳抗体配对的选择。将捕获抗体用包被液按体积比1:100稀释加入96孔酶标板第一列，并用包被液向下1:2倍比稀释至第十列，100μL/孔，4℃包被过夜，PBST洗涤3次，每次3min，拍干。每孔加封闭液200μL，4℃封闭过夜，PBST洗涤3次，每次3min，拍干。将α毒素蛋白用PBS按体积1:250稀释加入96孔酶标板第一行并用PBS向下1:2倍比稀释至第八行每孔100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，每次3min，拍干。将阳性抗体血清用PBS缓冲液按体积比1：160稀释加入96孔酶标板每孔100μL并设置阴性对照。37℃孵育1h，PBST溶液洗涤3次，每次3min，拍干。加入用PBS缓冲液按1:8000体积比稀释的HRP标记的羊抗兔IgG,37℃孵育1h。加入可溶性TMB底物显色液，避光37℃显色15min，每孔加入100μL 2M H2SO4终止反应，在450nm处用酶标仪测定每孔OD值。以P/N值作为选择抗体和抗原最佳配对浓度的依据。

最终确定捕获抗体：抗产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体最佳稀释倍数为1:6400即0.3ug/ml；抗原最佳工作浓度为2ug/mL。

(2)最佳包被液的选择

96孔酶标板第一二列用0.01mol/L碳酸盐缓冲液，第三四列用0.05mol/L碳酸盐缓冲液，第五六用0.1mol/L碳酸盐缓冲液，第七八用0.2mol/L碳酸盐缓冲液分别包被抗体。1 3 5行加入阳性样品，2 4 6行加入阴性样品对照。根据p/N值确定最佳包被条件。

最终确定可得用0.1mol/L的碳酸盐缓冲液作为包被液效果最佳。

(3)包被抗体最佳孵育时间的确定

将抗体用包被液稀释至工作浓度，同时设置阴性对照，分别置于37℃1h+4℃12h,4℃12h,37℃2h条件下孵育。根据p/N值确定抗体最佳包被条件。

经比较和分析可得在包被抗体最佳孵育时间为4℃12h。

(4)最佳封闭条件的确定

96孔酶标板第一二列用5％脱脂奶粉，第三四列用5％胎牛血清，第五六用1％BSA，1、3、5行加入阳性对照，2、4、6行加入阴性血清对照。根据p/N值确定最佳封闭条件。

5％的脱脂奶粉作为封闭液效果最佳。

(5)最佳封闭时间的确定

分别包被三个酶标板，每个酶标板的前四行加入阳性对照，后四行加入阴性对照，分别置于4℃12h,37℃2h,37℃1h+4℃12h条件下孵育。根据p/N值确定抗体最佳包封闭时间。

最终确定最佳封闭时间为4℃12h。

(6)抗原最佳孵育时间的确定

分别包被三个酶标板，每个酶标板的前四行加入阳性对照，后四行加入阴性对照，分别置于37℃30min,37℃1h,37℃2h条件下孵育。根据p/N值确定抗原最佳孵育时间。

最终确定37℃1h是其最佳孵育时间。

(7)被检血清最佳稀释度的确定

为了确定血清的最佳浓度，将阳性血清和阴性血清分别按1:20,1:40,1:80,1:160,1:320,1:640,1:1280,1:2560,1:5120,1:10240,1:20480,1:40560分别稀释到两个96孔板，加入96孔板1-12列，每个稀释度分别加一列8孔。测OD值，根据P/N值确定被检血清。

通过阴阳性比值可确定当被检血清稀释倍数为1:160时P/N最大，那么1：160即为它的最佳稀释倍数。

(8)被检血清最佳反应时间的确定

将阳性血清和阴性血清按最佳稀释度稀释后加入包被好的96孔酶标板中，分别置于37℃30min,37℃2h,37℃1h条件下孵育。根据p/N值确定抗体最佳包封闭时间。

最终通过阴阳性比值可确定被检血清的最佳孵育时间为37℃1h.

(9)酶标二抗最佳稀释倍数的确定

分别按所摸索的最佳条件进行包板，将阳性血清和阴性血清按最佳稀释度加入到包被好的96孔酶标板孵育后，酶标二抗分别按1:5000,1:8000,1:10000进行稀释测OD值，根据p/N值确定抗体最佳包封闭时间。

最终通过阴阳性比值可确定酶标二抗最佳稀释倍数为1:8000；

(10)酶标二抗孵育时间的确定

分别按所摸索的最佳条件进行包板，将阳性血清和阴性血清按最佳稀释度加入到包被好的96孔酶标板孵育后，加上最佳稀释倍数的酶标二抗分别置于37℃30min,37℃1h,37℃2h条件下孵育。根据p/N值确定抗体最佳孵育时间。

通过阴阳性比值可确定酶标二抗最佳孵育时间为37℃1h.

(11)最佳显色时间的确定

分别按所摸索的最佳条件进行包板孵育等过程，加显色液避光于室温下下孵育10min,15min,20min,37℃条件下孵育10min,15min,20min。并设立阴性对照，根据p/N值确定抗体最佳孵育时间。

通过阴阳性比值可确定最佳显色时间为37℃15min.

(12)利用方阵滴定实验对捕获ELISA检测条件进行优化，最终确定如下反应体系：

(1)包被：将上述获得的产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体用抗原包被液稀释到0.3μg/ml,每孔100μL，加入到96孔酶标板，密封4℃过夜；

(2)封闭：用PBST洗涤液洗涤上述酶标板3次，每次3min，洗涤完成后，加入含5wt％脱脂奶粉的PBST溶液作为封闭液，每孔200μL，4℃封闭过夜；

(3)加抗原：用PBST溶液洗涤上述酶标板3次每次3min并拍干，每孔加入用PBS稀释至2ug/ml的捕获抗原100ul，37℃孵育1h；

(4)加待检血清：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，每孔加入用PBS缓冲液以1:160体积比稀释的被检血清，100μL/孔，同时设置阴阳性和空白对照，PBS缓冲液作为空白对照，37℃孵育1h；

(5)加二抗：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，加入用PBS缓冲液按1:8000体积比稀释的HRP标记的羊抗兔IgG,37℃孵育1h；

(6)显色：用PBST溶液洗涤3次每次3min并拍干，最后加入可溶性TMB底物显色液100μL/孔,37℃条件避光反应15min；

(7)终止：每孔加100ul2M H₂SO₄溶液终止反应，450nm处读取吸光值。

实施例4捕获ELISA检测方法临界值的确定

用包被好的96孔板测33份阴性血清，按优化后的条件进行操作，进行ELISA检测。测OD值，计算平均值与标准差，求得为阳性临界值，为阴性临界值。运用建立的捕获ELISA方法测定OD450nm，为阳性，为阴性，为可疑样品。

计算其平均值与标准差SD＝0.015，求得值为0.273，,值为0.288，所以当被检血清OD450nm<0.273时为阴性，OD450nm>0.288时为阳性，0.273<OD450nm<0.288时为可疑。

实施例5捕获ELISA方法性能评价

(1)特异性试验:运用建立好的捕获ELISA方法，检测产气荚膜梭菌α毒素抗体有较强的反应性，与用大肠杆菌、沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌分别免疫兔子所得血清进行捕获ELISA检测无交叉反应。

(2)灵敏度实验：上述所制得阳性血清测其血清滴度，与经典小鼠中和实验做比较。将阳性血清按1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640连续倍比稀释后，进行ELISA检测，检测的血清滴度为1：640。

将上述经除盐纯化的α外毒素分别用生理盐水倍比稀释，腹腔注射0.5mL，使全部小鼠死亡的最大稀释倍数时毒素的含量为小鼠的最小致死量。测得制备的毒素对小鼠的MLD为2uL。

2倍致死量毒素与0.2mL 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1000稀释的高免血清混合，用生理盐水定容到1mL，放于37℃温箱2h，取0.5mL腹腔注射小鼠，观察小鼠存活情况。结果得出0.1mL血清能中和400个毒素对小鼠的最小致死量。

(3)重复性实验：分别从3次包被的96孔酶标板中随机抽取1块，检测临床上已知背景的血清10份。每份血清重复做3次，每次分别设1孔阴阳性对照。比较阴阳性血清的OD值，由批内和批间检测样品的重复性结果显示，批内变异系数为1.21％-6.53％，批间变异系数为1.78％-7.31％，两者均小于10％，说明同一样品在同批和不同批试验中变异程度小，说明该方法具有很好的重复性。

实施例7具体应用

1.运用建立好的捕获ELISA方法对来自山东泰安某兔场内100份血清检测产气荚膜梭菌α毒素抗体，采用间接ELISA检测产气荚膜梭菌外毒素抗体方法作对照(孙佳芝，2014)。检测结果显示：间接ELISA检测90只兔的血清样品检测为阴性，10只为阳性，阳性率为10％；捕获ELISA法检测到92只兔的血清样品为阴性，8只为阳性，阳性率为8％。

2.取上述利用间接ELISA方法所得8份阳性血清测其血清滴度与经典小鼠中和实验做比较。将阳性血清按1：10，1：20，1：40，1：80，1：160，1：320，1：640连续倍比稀释后，进行ELISA检测，检测的血清滴度分别为1：320,1:320,1:160,1:160,1:160,1:320,1:320,1:320。

将上述经除盐纯化的α外毒素分别用生理盐水倍比稀释，腹腔注射0.5mL，使全部小鼠死亡的最大稀释倍数时毒素的含量为小鼠的最小致死量。2倍致死量毒素(MLD上述已测得为2ul)与0.2mL 1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶800、1∶1000稀释的高免血清混合，用生理盐水定容到1mL，放于37℃温箱2h，取0.5mL腹腔注射小鼠，观察小鼠存活情况。结果得出0.1mL血清分别能中和200个，200个，100个，50个，100个，200个，100个，200个毒素对小鼠的最小致死量。

综上说明该方法与间接ELISA方法相比较其检测阳性率稍低,但其特异性检测产气荚膜梭菌α毒素抗体，其阳性率较低是与事实相符的，说明其特异性强，对其他外毒素无反应，而间接ELISA检测产气荚膜梭菌外毒素抗体，且所针对的目标物为多种抗体的混合物，其阳性率高但是特异性差，因此结果是合理的；与经典小鼠中和实验进行比较，其敏感性较高；结果说明：所建立的捕获ELISA检测产气荚膜梭菌α毒素抗体方法可用于大批量样品检测，为畜禽产气荚膜梭菌病的诊断及研究提供了更快速、有效的工具，并为疫苗质量和食品安全监测的研究奠定了坚实的基础。