一种抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体及免疫吸附剂、免疫亲和柱及其制备方法与流程

本发明涉及一种抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体及免疫吸附剂及其制备方法，还涉及一种制备该免疫吸附剂的免疫亲和柱的制备方法，属于食品科学
技术领域：
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背景技术：
：黄曲霉毒素m1（aflatoxinm1,afm1）主要存在于乳中，因此最初被称为“牛奶毒素”，由deiongh等发现后发表在1964年的nature杂志上。随着研究的深入发现，afm1是黄曲霉毒素b1（aflatoxinb1,afb1）是在体内经细胞色素p450系列酶的作用下经羟基化所形成的，一般认为afb1的羟基代谢物是毒素的解毒形式。然而afm1不能被看作是afb1的解毒产物，有许多实验研究表明afm1都具有细胞毒性和致癌性，是目前影响乳制品安全性的重要有害物之一。由于黄曲霉毒素m1（简称afm1）耐高温而且稳定性强，在乳制品的加工过程中通常无法通过高温杀菌工艺直接去除，因此，目前还没有通过直接技术手段去除乳中afm1的污染的方法，控制乳中afm1的措施只有采用严格的法定残留限量标准和精密检测技术来进行，一旦超标就需要将污染afm1的乳液进行销毁，常造成巨大的经济损失。典型案例就是2011年国家质检总局公布了蒙牛乳业（眉山）有限公司和福建长富乳品有限公司生产的液体奶中含超标afm1后引起了社会极大的恐慌，同时也对乳业公司造成了巨大的经济损失。技术实现要素：本发明要解决的技术问题在于提供一种抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体，该抗体具有很高的分泌特异性和亲和力，能够特异性结合乳中afm1。本发明要解决的第二个技术问题在于提供一种由上述抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体制备的免疫吸附剂及其制备方法。本发明要解决的第三个技术问题在于提供一种由上述抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体制备的免疫亲和柱及其制备方法。本发明要解决的技术问题是由如下方案实现的：1、一种抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体的重链为igg2b型，轻链为λ型，所述轻链氨基端前15个氨基酸序列为gvtqesalttspggt，所述重链氨基端前15个氨基酸序列为evilvesggglvkpg，分子量为150kd；所述抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体与黄曲霉毒素m1、黄曲霉毒素m2、黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素g2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和bsa的交叉反应率分别为100%、4.5%、21.5%、1.0%、16.6%、1.0%、0%、0%，亲和常数为5.5×10-10mol/l。所述黄曲霉毒素m1单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：（1）抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体的杂交瘤细胞株系的获得该杂交瘤细胞株系是用完全抗原afm1-bsa免疫小鼠后所得的脾脏细胞与骨髓瘤细胞sp2/0融合得到，传代30代分泌抗体活性无差别，杂交瘤细胞在无血清培养基中能稳定分泌抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体，在co2培养箱中培养至细胞全部死亡后培养基中抗afm1的抗体浓度可达0.15mg/ml；（2）抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体的杂交瘤细胞株系的筛选所述抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选采用高通量对比elisa方法，筛选过程包括以下步骤：选择免疫效价超过10-5以上的小鼠脾脏细胞进行追加免疫，3天后取脾细胞与sp2/0细胞按1：1的比例在分子量为1450的50%peg作用下进行细胞融合，融合细胞利用hat培养基调整细胞密度后均匀分配到45块96孔板中，在5%的co2和37℃的培养箱培养10天；10天后在吸取上清液进行阳性孔的筛选，筛选采用在预先准备好的bsa和afm1-bsa包被板各45块96孔板利用全自动加样器、transtar-96等设备移液、洗板、加2抗、加显色液、加终止液后用酶标仪测定od值，依据拖孔数和在afm1-bsa包被板中的显阳性而在bsa包被板中显隐性的细胞孔为第一次筛选对象，利用显微操作技术分别吸取阳性孔的各个融合细胞集落转入新的96孔培养板中培养，培养基变色后进行亚克隆，获得稳定分泌抗afm1单克隆抗体的细胞株系；（3）抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体的制备采用蛋白a/g纯化，包括以下具体步骤：首先以105/ml的初始密度将筛选的杂交瘤细胞在1升旋转瓶中进行培养，培养细胞全部死亡后利用大容量离心机离心收集上清液，经缓冲液1：1稀释后利用蛋白a/g纯化柱纯化，收集洗脱液并利用amicon搅拌式超滤装置经3万分子量的透析膜浓缩纯化抗体，浓缩抗体经过nd1000型超微量紫外分光光度计定量后获得抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体；抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体的杂交瘤细胞株系在申请日之前的文献中公众可以获得：该文献为：《应用hts-elisa筛选方法制备抗黄曲霉毒素m1单抗》.微生物学报.isticpku-2010年10期.裴世春、何娜、张立军、陆梅生。公众可以按照上述文献的方法制得；也可以按照本发明方法制得。2、一种抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体免疫吸附剂及其制备方法：一种抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体免疫吸附剂，所述免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体，所述固相载体为含有环氧基团的活化树脂。上述抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体免疫吸附剂的制备方法为：具体包括以下步骤：1）聚合物微球的制备：将聚乙烯吡咯烷酮溶于无水乙醇与去离子水混合液加入到三口瓶中，搅拌成均相体系后，通入氮气排空，并升至所需反应温度70℃；一次性加入溶有引发剂偶氮二异丁腈的苯乙烯与甲基丙烯酸缩水甘油酯单体，在搅拌和氮气保护下反应24h后终止反应；将聚合产物进行离心沉降，弃去清液，加入无水乙醇重新分散，再沉降，反复多次，再加入去离子水重新分散，沉降，反复多次，而后真空干燥，获得高分子树脂；1）活化树脂：将高分子树脂用蒸馏水充分溶胀后，抽干，按照1g/2l加入浓度为2mol/l的naoh溶液，边搅拌边加环氧氯丙烷，在40~50℃反应24h，抽干后，用丙酮和蒸馏水洗涤树脂，即得到活化树脂；2）偶联：将活化树脂用大于5倍凝胶体积的偶联缓冲液（0.1mol/l，nahco3，ph8.4）抽洗5次，迅速转移至含有黄曲霉毒素m1单克隆抗体的偶联缓冲液（0.1mol/l，nahco3，ph8.4）中，室温1h或4℃过夜温和搅拌，使黄曲霉毒素m1单克隆抗体与活化树脂充分偶联，静置，收集偶联树脂；3）封闭：将偶联树脂加入平衡缓冲液（0.1mol/l，ph8.0，tris-hcl），中室温封闭2h；4）洗涤：然后用200ml的醋酸溶液（0.1mol/l，ph4.0）和平衡缓冲液（0.1mol/l，tris-hcl，ph8.0）先后交替洗涤4～6次，洗涤后用平衡缓冲液（0.1mol/lph8.0，tris-hcl）平衡，即制得抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体免疫吸附剂。3.一种装载抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体免疫吸附剂的免疫亲和柱的制备方法，具体包括以下具体步骤：取柱管，垫好筛板，将权利要求3制备的偶联抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体的免疫吸附剂装入柱管中，滴入平衡缓冲液（0.1mol/l，ph8.0，tris-hcl）使胶面稳定，封住口底。本发明的有益效果是：本发明所述抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体是一种具有分泌高特异性和高亲和力的抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体与黄曲霉毒素m1、黄曲霉毒素m2、黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素g2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和bsa的交叉反应率分别为100%、4.5%、21.5%、1.0%、16.6%、1.0%、0%、0%，亲和常数为5.5×10-10mol/l。利用该特异性抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体和特殊载体材料制备的本发明免疫吸附剂是高效专一的体外免疫吸附剂，抗afmi单克隆抗体与活化树脂的偶联率为93.4%，黄曲霉毒素m1的吸附容量为100ug/mg抗体，该免疫吸附剂可应用于鲜乳加工中在无损鲜乳营养基础上去除黄曲霉毒素m1，进而保障乳制品的安全性。附图说明以下结合附图和具体实施方式对本发明加以详细说明。图1为实施例3中的单抗sds-page图片。图2为实施例4中抗afm1单抗亚类的鉴定图片。图3为实施例5中不同毒素对afm1单抗的抑制率曲线。图4为实施例6中抗afm1单抗亲和力鉴定结果曲线。具体实施方式（1）材料与仪器本发明实验所需主要试剂、耗材以及实验仪器如表1所示。（2）免疫动物与细胞sp2/0细胞购至英国剑桥大学mrc，babl/c小鼠购于哈尔滨兽医研究所。表1实验所需试剂耗材以及仪器设备试剂与仪器来源黄曲霉毒素m1，m2，b1，b2，g1，g2sigma公司aflatoxinm1-bsa全抗原sigma公司牛血清白蛋白bsa、卵清蛋白ovasigma公司弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂sigma公司超滤膜(30,000nmwl，直径44.5mm)millipore,ultracelym-30hat和ht培养基sigma公司pegsigma公司鼠单抗分型检测试剂sigma公司md6无血清培养基大庆麦伯康生物技术有限公司新生牛血清、胎牛血清hyclone公司96孔酶标板和细胞培养板costar公司超微量紫外可见分光光度计ge公司，nanovue微孔板分液器ufill型美国biotek公司酶标仪elx808型美国biotek公司全自动加样机英国genetix公司qfill3™96孔移液器corning公司细胞培养生物反应器荷兰applikon洗板机美国sim公司co2培养箱美国sim公司生物安全柜美国sim公司实施例1一种抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体，所述抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体的重链为igg2b型，轻链为λ型，所述轻链氨基端前15个氨基酸序列为gvtqesalttspggt，所述重链氨基端前15个氨基酸序列为evilvesggglvkpg，分子量为150kd；所述抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体与黄曲霉毒素m1、黄曲霉毒素m2、黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素g2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和bsa的交叉反应率分别为100%、4.5%、21.5%、1.0%、16.6%、1.0%、0%、0%，亲和常数为5.5×10-10mol/l。上述抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体的制备过程及鉴定如下所示：1、动物免疫方案选用8只6周龄babl/c小鼠进行免疫，免疫原为完全抗原afm1-bsa，每次免疫剂量为20μg/只，皮下及腹腔注射，每两周免疫一次。初次免疫采用弗氏完全佐剂乳化完全抗原，2-3次免疫采用弗氏不完全佐剂乳化完全抗原。第3次免疫10天后断尾采血，用间接elisa法检测血清效价。用包被液（碳酸盐缓冲液）将afm1-bsa稀释到0.1μg/ml浓度后，按每孔100μl/孔包被酶标板，常温过夜后用洗涤液（含0.05%吐温-20的pbs）洗板3次。加封闭液（1%牛血清蛋白液）100μl/孔，37℃温育1h，洗涤3次。待检血清样品倍比稀释后，100μl/孔，37℃温育1h，洗涤3次。酶标二抗以1：5000倍稀释后加入100μl/孔，37℃温育1h，洗涤3次。加入tmb底物溶液100μl/孔，避光静置10min，加终止液（2m的h2so4）50μl/孔,采用酶标仪测定450nm处od值。当od值大于或等于阴性对照od值2倍时的最高血清稀释倍数为血清效价。第3次免疫后小鼠血清平均效价可达到1：0.5x105以上。2、细胞融合、筛选与克隆方案（1）sp2/o骨髓瘤细胞的准备：融合前36-48h将培养好处于对数生长期的骨髓瘤细胞扩大培养，融合前用弯头吸管将细胞从细胞培养瓶壁上吹下，收集于50ml离心管中，1200rpm离心4分钟，弃上清。再加入20ml1640培养液，重新混匀，1200rpm离心4分钟，弃上清，加10ml1640培养液，混匀。取细胞悬液0.1ml，再加入0.9ml1%台盼兰，混匀，滴于计数板上显微镜下计数，备用。（2）脾细胞的准备：选择抗血清效价1：0.5x105以上的babl/c小鼠于融合前3天腹腔加强免疫1次，免疫原为afm1-bsa，20ug/只，不加佐剂。融合前摘小鼠眼球放血，颈部脱臼处死，75%酒精浸泡消毒，然后将小鼠固定于生物安全柜的鼠板上。无菌打开腹腔，取出脾脏，于含10ml1640培养液的平皿中洗涤两次，去掉周围的脂肪组织与结缔组织，置于含10ml1640培养液的平皿中。取200目网筛放于平皿中，加1640培养液至浸没网筛，将脾脏置于网筛上培养液中，用l型棒轻轻挤压脾脏，使脾细胞完全进入培养液中。将脾细胞液吸入50ml离心管中，1400rpm离心4分钟，弃上清液，再加10ml1640培养液，混匀。同上细胞计数，备用。（3）细胞融合：取小鼠脾脏细胞计数结果为8.47×107，与骨髓瘤细胞融合后，利用添加1%hat和10%fbs的1200mlmd6哺乳细胞无血清培养基稀释融合细胞后280ul/孔均分到45块96孔平底细胞培养板中，在5%co2和37℃的培养箱中封闭培养10-12天。10-12天后利用transtar-96移液器在物菌净化操作台内分别取上清液50µl/孔分别转移到预先准备好的与细胞培养板相对应的并包被有afm1-bsa和bsa的各45块elisa板中，利用高通量检测方法筛选阳性杂交瘤细胞孔。（4）阳性克隆的筛选和克隆：10天后在吸取上清液进行阳性孔的筛选，筛选采用在预先准备好的bsa和afm1-bsa包被板各45块96孔板分别添加上清液后孵育，基于经典的间接elisa的洗板、加2抗、加显色液、加终止液后用酶标仪测定od值，选择在afm1-bsa包被板中的显阳性而在bsa包被板中显隐性的细胞孔为第一次筛选对象，利用显微操作技术分别吸取阳性孔的各个融合细胞集落转入新的96孔培养板中培养，培养基变色后进行confirm-elisa，收集确认的阳性细胞株进行培养，取单个克隆的孔细胞上清液进行抗体检测，检测结果为阳性的克隆继续扩大培养后冻存以及用于制备抗体。其结果如表2所示。表2获得的阳性克隆杂交瘤细胞3、抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体的制备和纯化方案（1）无血清培养基制备抗体：将确认的阳性细胞株扩大培养后转入1升转瓶中培养14天，收集培养液离心后1：1与pbs缓冲液混合过蛋白a柱，用ph3.7的洗脱液进行洗脱，通过amicon搅拌式超滤装置利用3万分子量的超滤膜进行浓缩，浓缩液利用ge公司的超微量紫外分光光度计定量后分装后进行冷冻干燥并保存。（2）小鼠腹水法制备腹水抗体：取10周龄产后的健康balb/c小鼠，腹腔注射500μl灭菌石蜡油，七天后小鼠腹腔注射106杂交瘤细胞/只，待7天后小鼠腹部肿胀，收集腹水并纯化。（3）sds-page:将通过腹水法制备的抗afm1单抗、无血清培养法制备的抗afm1单抗，以及纯化后的无血清培养的单抗分别进行sds-page，结果如图1所示，由该图可见腹水法制备的单抗杂蛋白较多，而无血清培养的抗体则纯度较高，纯化效果良好。4、抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体亚类的鉴定方案根据sbaclonotypingsystem/hrp抗体亚型测定试剂盒，利用分泌抗afm1单抗的杂交瘤细胞上清进行亚类鉴定。方法为：将包被原afm1-bsa按1、0.5、0.25mg/l包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜；1.5%的bsa封闭后，将单抗从1mg/l开始梯度稀释后进行间接非竞争elisa检测。其结果如图2所示，可见得到的抗afm1单抗重链为igg2b型、轻链为λ链，抗体轻链氨基端前15个氨基酸序列为gvtqesalttspggt，重链氨基端前15个氨基酸序列为evilvesggglvkpg，分子量为150kd。5、抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体单克隆抗体与其他毒素之间交叉反应率的测定方案以包被原afm1-bsa包被酶标板，100ul/孔，4℃过夜，倒出孔内液体，洗涤液（含0.05%吐温20的pbs液）洗涤3次。加封闭液（1%牛血清蛋白液）100ul/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤3次。取不同稀释浓度（1000ng/ml、100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/ml、0.001ug/ml、0.0001ug/ml）的黄曲霉毒素m1、黄曲霉毒素m2、黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素g2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和bsa标准品与等体积适度浓度（0.1ug/ml）的单抗混合添加到包被板中，100ul/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤三次。再加酶标二抗（1：2000倍稀释），100ul/孔，37℃温育1h，洗涤3次。加入tmb底物溶液150ul/孔，避光静置10min，加终止液（2mh2so4）50ul/孔，采用酶标板测定450nm处各孔的吸光率（a）。根据公式：竞争抑制率=（阳性对照孔a值-阻断孔的a值）/阳性对照孔a值*100%计算竞争抑制率，再根据公式：交叉反应率=抑制率为50%时afm1浓度/抑制率为50%时竞争物浓度*100%计算交叉反应率。结果如图4所示，抗体与黄曲霉毒素m1、黄曲霉毒素m2、黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素b2、黄曲霉毒素g1、黄曲霉毒素g2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和bsa的交叉反应率分别为100%、4.5%、21.5%、1.0%、16.6%、1.0%、0%、0%。6、抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体亲和力的测定方案将包被原afm1-bsa分别以1、0.5、和0.25ug/ml的浓度包被酶标板，100ul/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，用洗涤液（含0.05%吐温20的pbs液）洗涤3次.再加入倍比系列稀释（1：400、1：1600、1：6400、1：25600、1：102400、1：409600、1：1638400）的单克隆抗体，100ul/孔，37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤3次。加酶标二抗（1：1000倍稀释）100ul/孔，37℃温育1h，洗涤3次。加入tmb底物溶液100ul/孔，避光静置10min，加终止液（2mh2so4）50ul/孔，采用酶标板测定450nm处各孔的吸光率（a）。以抗体浓度（ab）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制三条不同包被浓度的曲线图，如图4所示。分别找出3条曲线的50％odmax所对应的抗体浓度分别是1.12×10-11mol/l、1.26×10-11mol/l、1.35×10-11mol/l，根据公式kaff=(n-1)/2(n[ab’]t-[ab]t)共求出3个kaff值分别是4.0×1010m-1、3.0×1010m-1、9.0×1010m-1，取其平均值即为单抗的亲和常数为5.5×1010m-1。实施例2一种抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体免疫吸附剂，所述免疫吸附剂包括固相载体和与该固相载体偶联的抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体，所述固相载体为含有环氧基团的活化树脂。上述抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体免疫吸附剂的制备方法为：具体包括以下步骤：1）聚合物微球的制备：将聚乙烯吡咯烷酮溶于无水乙醇与去离子水混合液加入到三口瓶中，搅拌成均相体系后，通入氮气排空，并升至所需反应温度70℃；一次性加入溶有引发剂偶氮二异丁腈的苯乙烯与甲基丙烯酸缩水甘油酯单体，在搅拌和氮气保护下反应24h后终止反应；将聚合产物进行离心沉降，弃去清液，加入无水乙醇重新分散，再沉降，反复多次，再加入去离子水重新分散，沉降，反复多次，而后真空干燥，获得高分子树脂；1）活化树脂：将高分子树脂用蒸馏水充分溶胀后，抽干，按照1g/2l加入浓度为2mol/l的naoh溶液，边搅拌边加环氧氯丙烷，在40~50℃反应24h，抽干后，用丙酮和蒸馏水洗涤树脂，即得到活化树脂；2）偶联：将活化树脂用大于5倍凝胶体积的偶联缓冲液（0.1mol/l，nahco3，ph8.4）抽洗5次，迅速转移至含有黄曲霉毒素m1单克隆抗体的偶联缓冲液（0.1mol/l，nahco3，ph8.4）中，室温1h或4℃过夜温和搅拌，使黄曲霉毒素m1单克隆抗体与活化树脂充分偶联，静置，收集偶联树脂；3）封闭：将偶联树脂加入平衡缓冲液（0.1mol/l，ph8.0，tris-hcl），中室温封闭2h；4）洗涤：然后用200ml的醋酸溶液（0.1mol/l，ph4.0）和平衡缓冲液（0.1mol/l，tris-hcl，ph8.0）先后交替洗涤4～6次，洗涤后用平衡缓冲液（0.1mol/lph8.0，tris-hcl）平衡，即制得抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体免疫吸附剂。实施例3一种装载有抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体免疫吸附剂的免疫亲和柱，其制备方法包括以下具体步骤：取柱管，垫好筛板，将权利要求3制备的偶联抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体的免疫吸附剂装入柱管中，滴入平衡缓冲液（0.1mol/l，ph8.0，tris-hcl）使胶面稳定，封住口底。实施例4免疫吸附剂的吸附性能测定方案添加有100ng、200ng、300ng、400ngafm1鲜乳溶液500ml全部通过偶联有1mg抗黄曲霉毒素m1单克隆抗体的免疫吸附剂的免疫亲和柱，每个浓度3次重复，洗涤、洗脱、收集洗脱液,ic-elisa检测收集液中的afm1含量，最后计算免疫吸附容量，由表3可知添加afm1含量在200ng以下时吸附率在90%以上，吸附容量接近100ug/mg抗体。表3afm1单克隆抗体免疫亲吸附剂的最大吸附量添加量(ng)自制免疫吸附剂的吸附率（%）10093.120092.630081.5当前第1页12