一种基于核酸适配体的卡那霉素快速检测试纸及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种基于核酸适配体的卡那霉素快速检测试纸及其制备方法和应用，属于分析化学及医药、环境和食品安全检测领域。

背景技术：

卡那霉素（kanamycin）是一种广谱型氨基糖苷类抗生素，分子式为c18h36n4o11，分子量为582.58，能有效的治疗由革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌所引起的感染。然而，过度使用卡那霉素或过度消费含有卡那霉素的动物源性食品，会导致卡那霉素通过食物链在人体内累积，并且可能引起一些相当严重的副作用，如影响耳蜗神经、诱发耳毒症、导致永久性的听力损失；同时对神经肌肉和造血系统也可能产生一定的影响；此外，卡那霉素亦可引起对肾脏的损害，发生肾功能衰竭。因此，应尽快建立一种能够用于检测食品中卡那霉素残留的有效方法，进一步提高动物源性食品的安全性。

现在已经研究出多种用于检测卡那霉素残留的方法，例如酶联免疫吸附测定（elisa）、毛细管电泳（cze）、高效液体色谱（hplc）、表面等离子体共振（spr）和电化学方法等。然而，上述方法的应用仍然部分受限，如耗时长、需要大型仪器设备和消耗相对大量的试剂、成本高、易受干扰物的影响、对操作人员要求较高、不适合现场应用等。因此，建立一种卡那霉素简单，快速，经济和超灵敏检测的方法十分重要，而检测试纸的研制为快速检测提供了可能。

技术实现要素：

本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种基于核酸适配体的卡那霉素快速检测试纸及其制备方法和应用，将胶体金标记层析试纸条技术、纳米生物材料构建技术及核酸适配体等诸多技术的优势联合起来，制备一种用于简便、快速、成本低、灵敏度高的卡那霉素残留的检测试纸并应用于样品检测。

本发明的技术方案：一种基于核酸适配体的卡那霉素快速检测试纸，包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、pvc底板、检测线和质控线；所述pvc底板上依次粘贴样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，其中样品垫搭接金标垫，硝酸纤维素膜直接设置于pvc底板上，硝酸纤维素膜一端搭接金标垫，硝酸纤维素膜另一端搭接吸水垫；所述硝酸纤维素膜上依次还设有检测线和质控线。

所述样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、各搭接部重叠段为2mm。

所述金标垫的制备过程为：分别制备金、银纳米粒子并分别通过au-s键和ag-s键的共价作用将apt、dna1与金、银纳米颗粒偶联形成功能化的纳米粒子；

其中apt及dna1序列如下：

适配体apt：5’-hs-(ch2)6-tgggggttgaggctaagccga-biotin-3’；

dna1：5’-hs-(ch2)6-tcagtcggcttagccgtccaacgtcagatcc-3’。

所述在硝酸纤维素膜上靠近金标垫的一端用预先孵育过的链霉亲和素和生物素修饰dna2来划检测线，在靠近吸水垫一端用链霉亲和素来划质控线；

其中dna2：5’-biotin-ccgatggatctgacgt-3’。

所述基于核酸适配体的卡那霉素快速检测试纸的制备方法，步骤如下：金纳米粒子的制备及功能化、银纳米粒子的制备及功能化、金标垫和样品垫的预处理、硝酸纤维素膜的预处理、试纸条的组装、检测试纸条显色情况；具体步骤为：

（1）金纳米粒子的制备及功能化：

制备金纳米粒子之前所有的玻璃仪器均用王水浸泡30min，然后用蒸馏水洗净，超纯水浸泡12h，烘干备用；将100ml质量浓度0.01%的氯金酸加入250ml圆底烧瓶中，搅拌并加热至沸腾，在剧烈搅拌下快速加入3.5ml质量浓度1%的柠檬酸三钠，继续加热搅拌15min后溶液变成酒红色，停止加热，继续搅拌30min后静置，室温自然冷却，得到粒径13nm的金纳米粒子溶液，4℃保存备用；

将上述金纳米粒子溶液在沸水浴条件下继续加热并不断搅拌，使水分蒸发，直至烧瓶内的溶液为20ml后停止沸水浴，室温自然冷却，得到浓缩的金纳米粒子，4℃保存备用；

将15µl1mmol/l的三(2-羧乙基)膦tcep与30µl100µmol/l的适配体apt混合，进行巯基化反应，然后加入到1ml浓缩的金纳米粒子中，室温下搅拌1h；接着将30µl15mmol/l的三磷酸脱氧腺苷datp加入到上述溶液中，室温搅拌35min；震荡完成后加入20µl1mol/l的nacl溶液室温放置30min，4℃保存6h来增加结合的稳定性；4℃、8000r/min离心10min去除多余的试剂；重悬于1ml含0.5%tween-20、5%bsa、2%蔗糖、0.5%tritonx-100的20mmol/l的na3po4缓冲液中，4℃避光保存备用；

（2）银纳米粒子的制备及其功能化：

分别配制0.2mmol/l的硝酸银，2.0mmol/l的脱氧胆酸钠及20mmol/l的硼氢化钠，将硝酸银和脱氧胆酸钠溶液以1︰2的摩尔比在ph7的条件下陈化24h；将陈化后的溶液加入到圆底烧瓶中，在冰浴条件剧烈搅拌作用下逐滴滴加新鲜配制的硼氢化钠反应10min，反应后得到黄色胶体银溶液，4℃避光保存备用；

取1ml胶体银溶液于1.5ml的离心管中，在4℃、12000r/min条件下离心10min去除上清，用200µl含0.5%tween-20、5%bsa、2%蔗糖、0.5%tritonx-100的20mmol/l的na3po4缓冲液重悬后即可得到5倍浓缩的胶体银溶液。

将15µl1mmol/l的tcep与20µl100µmol/l的dna1混合，进行巯基化反应，然后加入到1ml5倍浓缩的胶体银溶液，室温下搅拌1h；接着将30µl15mmol/l的datp加入到上述溶液中，室温搅拌35min；震荡完成后逐滴滴加20µl1mol/l的nacl溶液室温放置30min，4℃保存6h来增加结合的稳定性；4℃、8000r/min离心10min去除多余的试剂，重悬于1ml含0.5%tween-20、5%bsa、2%蔗糖、0.5%tritonx-100的20mmol/l的na3po4缓冲液，4℃避光保存备用；

（3）样品垫、金标垫预处理：

将金标垫及样品垫裁剪成合适的大小后在含1%nacl、0.5%tween-20、1%bsa、2%蔗糖，1%tritonx-100的0.1mol/ltris-hcl(ph8.2)缓冲液中完全浸泡30min，然后放到37℃恒温干燥箱中烘干后，干燥条件保存、备用；

在处理好的金标垫上滴加功能化金、银纳米粒子，即aunps-apt和agnps-dna1，其中dna1与apt部分互补，37℃恒温干燥箱中烘干，干燥条件保存，备用；

（4）硝酸纤维素膜预处理：

将链霉亲和素与生物素修饰的dna2以1︰4的摩尔比例混合均匀后在4℃的条件下放置2h，使链霉亲和素和dna2上修饰的生物素充分结合；取结合好的sa-biotin-dna21µl在硝酸纤维素膜上靠近金标垫一端划检测线t线；取1µl链霉亲和素sa在硝酸纤维素膜上靠近吸水垫一端划质控线c线，将划好t、c线的硝酸纤维素膜在37℃下烘干0.5h，干燥条件下保存备用；

（5）试纸条的组装：胶体金层析试纸条的组成材料主要包括pvc底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫五部分，先将硝酸纤维素膜粘贴到pvc底板的对应位置上，轻压，使二者紧密结合，将处理过的样品垫、金标垫，分别粘贴在pvc底板的对应位置上，样品垫与金标垫，金标垫与硝酸纤维素膜各重叠2mm，最后将吸水垫与硝酸纤维素膜重叠2mm粘贴到pvc底板上，多余部分裁掉；然后各部分粘贴牢固，裁成规格为65mm×4mm的试纸条，干燥条件保存，备用。

所述基于核酸适配体的卡那霉素快速检测试纸的检测方法，首先将制备好的试纸条置于试纸条卡盒中，在加样孔滴加待检测的溶液于样品垫上后，液体随毛细管作用向吸水垫移动，液体经过硝酸纤维素膜上的检测线和质控线；待试纸条显色完全后，肉眼观察t线颜色深浅可定性或半定量分析，或将试纸条置于胶体金定量仪中进行扫描，得到检测线和质控线的峰面积值，根据标准曲线定量测定出检测液的卡那霉素浓度。

具体步骤如下：将制备好的试纸条在样品垫一端滴加检测液，由于毛细管的虹吸作用检测液会从样品垫不断向吸水垫移动经过硝酸纤维素膜，在t线和c线的位置聚集金纳米粒子从而在硝酸纤维素膜上形成两条红色条带；

当检测液中不存在目标物卡那霉素时，t线上的dna2会与dna1杂交且dna1与apt部分互补，因此在t线上会捕获到功能化的金纳米粒子而显色，c线上的链霉亲和素可以根据链霉素-生物素作用使金纳米粒子在c线上聚集而显色，此时，t、c线均显色；

当检测液中存在卡那霉素时，apt会改变其空间构象特异性地与卡那霉素结合，而不再与dna1结合，aunps-apt会被置换下来，使t线显色变浅或不显色，apt与卡那霉素结合后其3’端生物素依然暴露在外，因此可以被c线上的链霉亲和素捕获从而显色，此时，t线显色较浅或完全褪色、c线显色正常；

最后将试纸条置于胶体金定量仪中检测其t、c线的显色强度，可以根据t线的显色情况来判断所检测的卡那霉素的浓度。

本发明的有益效果：①该方法利用金、银纳米粒子易于制备修饰并且可以将信号双重放大以及适配体的构象变化实现检测线的光学信号的强弱变化，进而实现对卡那霉素的检测；②试纸法检测卡那霉素简便快速，可随时随地检测，结果可视化，检测时间短，采用本方法，只需把试纸条样品垫一端插入到检测液中，10min内即可获得实验结果，可以大幅度的提高检测效率；③通过胶体金定量仪读数可进行定量分析，对动物源性食品中卡那霉素残留检测具有重要意义。

附图说明

图1本发明试纸条组装图。1、样品垫；2、金标垫；3、硝酸纤维素膜；4、吸水垫；5、pvc底板；6、检测线；7、质控线。

图2基于核酸适配体的卡那霉素胶体金快速检测试纸检测阴性原理图。

图3基于核酸适配体的卡那霉素胶体金快速检测试纸检测阳性原理图。

图4用试纸条对不同浓度卡那霉素标准溶液的检测图。

图5在标准检测液中，t线峰面积与卡那霉素浓度的标准曲线图。

图6用试纸条对含不同浓度卡那霉素的牛奶样品的检测图。

具体实施方式

实施例1一种基于核酸适配体的卡那霉素快速检测试纸

金纳米粒子的制备及功能化、银纳米粒子的制备及功能化、金标垫和样品垫的预处理、硝酸纤维素膜的预处理、试纸条的组装、检测试纸条显色情况。具体步骤为：

（1）金纳米粒子的制备及功能化：

制备金纳米粒子之前所有的玻璃仪器均用王水浸泡30min，然后用蒸馏水洗净，超纯水浸泡12h，烘干备用；将100ml0.01%的氯金酸加入250ml圆底烧瓶中，搅拌并加热至沸腾，在剧烈搅拌下快速加入3.5ml1%的柠檬酸三钠，继续加热搅拌15min后溶液变成酒红色，停止加热，继续搅拌30min后静置，室温自然冷却，得到粒径13nm的金纳米粒子溶液，4℃保存备用；

将上述金纳米粒子溶液在沸水浴条件下继续加热并不断搅拌，使水分蒸发，直至烧瓶内的溶液为20ml后停止沸水浴，室温自然冷却，得到浓缩的金纳米粒子，4℃保存备用；

将15µl1mmol/l的三(2-羧乙基)膦tcep与30µl100µmol/l的适配体apt混合，进行巯基化反应，然后加入到1ml浓缩的金纳米粒子中，室温下搅拌1h；接着将30µl15mmol/l的三磷酸脱氧腺苷datp加入到上述溶液中，室温搅拌35min；震荡完成后加入20µl1mol/l的nacl溶液室温放置30min，4℃保存6h来增加结合的稳定性；4℃、8000r/min离心10min去除多余的试剂；重悬于1ml含0.5%tween-20，5%bsa，2%蔗糖，0.5%tritonx-100的20mmol/l的na3po4缓冲液中，4℃避光保存备用；

（2）银纳米粒子的制备及其功能化：

分别配制0.2mmol/l的硝酸银，2.0mmol/l的脱氧胆酸钠及20mmol/l的硼氢化钠，将硝酸银和脱氧胆酸钠溶液以1︰2的摩尔比在ph7的条件下陈化24h；将陈化后的溶液加入到圆底烧瓶中，在冰浴条件剧烈搅拌作用下逐滴滴加新鲜配制的硼氢化钠反应10min，反应后得到黄色胶体银溶液，4℃避光保存备用；

取1ml胶体银溶液于1.5ml的离心管中，在4℃、12000r/min条件下离心10min去除上清，用200µl含0.5%tween-20，5%bsa，2%蔗糖，0.5%tritonx-100的20mmol/l的na3po4缓冲液重悬后即可得到5倍浓缩的胶体银溶液。

将15µl1mmol/l的tcep与20µl100µmol/l的dna1混合，进行巯基化反应，然后加入到1ml5倍浓缩的胶体银溶液，室温下搅拌1h；接着将30µl15mmol/l的datp加入到上述溶液中，室温搅拌35min；震荡完成后逐滴滴加20µl1mol/l的nacl溶液室温放置30min，4℃保存6h来增加结合的稳定性；4℃、8000r/min离心10min去除多余的试剂，重悬于1ml含0.5%tween-20，5%bsa，2%蔗糖，0.5%tritonx-100的20mmol/l的na3po4缓冲液，4℃避光保存备用；

（3）样品垫、金标垫预处理：

将金标垫及样品垫裁剪成合适的大小后在含1%nacl，0.5%tween-20，1%bsa，2%蔗糖，1%tritonx-100的0.1mol/ltris-hcl(ph8.2)缓冲液中完全浸泡30min，然后放到37℃恒温干燥箱中烘干后，干燥条件保存、备用；

在处理好的金标垫上滴加功能化金、银纳米粒子，即aunps-apt和agnps-dna1，其中dna1与apt部分互补，37℃恒温干燥箱中烘干，干燥条件保存，备用；

（4）硝酸纤维素膜预处理：

将链霉亲和素与生物素修饰的dna2以1︰4的摩尔比例混合均匀后在4℃的条件下放置2h，使链霉亲和素和dna2上修饰的生物素充分结合；取结合好的sa-biotin-dna21µl在硝酸纤维素膜上靠近金标垫一端划检测线t线；取1µl链霉亲和素sa在硝酸纤维素膜上靠近吸水垫一端划质控线c线，将划好t、c线的硝酸纤维素膜在37℃下烘干0.5h，干燥条件下保存备用；

（5）试纸条的组装：胶体金层析试纸条的组成材料主要包括pvc底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫五部分，先将硝酸纤维素膜粘贴到pvc底板的对应位置上，轻压，使二者紧密结合，将处理过的样品垫、金标垫，分别粘贴在pvc底板的对应位置上，样品垫与金标垫，金标垫与硝酸纤维素膜各重叠2mm，最后将吸水垫与硝酸纤维素膜重叠2mm粘贴到pvc底板上，多余部分裁掉；然后各部分粘贴牢固，裁成规格为65mm×4mm的试纸条，干燥条件保存，备用。

实施例2用试纸条对卡那霉素标准溶液的测定

用2ml离心管分别将卡那霉素稀释到不同的浓度，每管100µl。将按上述方法制备好的试纸条样品垫一端分别插入到不同浓度卡那霉素标准溶液中，室温下反应10min。从图4中可以看出，在卡那霉素浓度0～1nmol/l和35～400nmol/l之间t线颜色基本没有变化，而在1～35nmol/l之间t线颜色随卡那霉素浓度的增大而变浅，且在35nmol/l以后检测线基本没有颜色。因而该试纸对卡那霉素的肉眼检出限为35nmol/l。将反应好的试纸条放到塑料卡中用胶体金定量仪检测t、c线的显色情况，得到如图5所示检测线峰面积与卡那霉素浓度的变化关系曲线。其中在1～30nmol/l浓度范围内，t线显色强度与浓度存在线性关系，线性回归方程为y=-44.5115x+2295.2893，r²=0.9830，式中y为检测线峰面积，x为卡那霉素的浓度（nmol/l）。

实施例3牛奶样品中卡那霉素残留的检测

此处采用向牛奶中添加标准浓度卡那霉素制备人工污染牛奶的方式分别获得含5nmol/l、10nmol/l、20nmol/l、30nmol/l、50nmol/l、100nmol/l、200nmol/l卡那霉素的牛奶样品。往牛奶样品中逐滴加入20%三氯乙酸，调节ph4.6，45℃水浴10min沉淀酪蛋白，以10000r/min的转速离心25min除去凝结的蛋白质和脂肪，用0.22µm的滤膜过滤，最后再调节ph到中性，得到经预处理后的牛奶样品。按上述操作步骤来检测含不同浓度的卡那霉素的牛奶样品。得到图6所示含不同浓度卡那霉素的牛奶样品的试纸条检测图。在图6中可以看出随着卡那霉素浓度的增大，t线的颜色变浅，当卡那霉素达到100nmol/l后t线基本已经没有颜色，因此我们设定100nmol/l为试纸条对牛奶样品中卡那霉素的可视化检测下限。实验证明该检测方法可以检测到经过预处理后的牛奶中基质的卡那霉素。