一种优质乳中过氧化物酶的快速检测方法与流程

本发明涉及一种过氧化物酶检测方法，特别涉及一种巴氏杀菌牛奶中乳过氧化物酶含量快速检测方法，属于乳制品检测分析领域。本发明还涵盖了对于牛乳的巴氏杀菌处理情况的快速分析验证方法，能够快速的验证牛乳的巴氏杀菌的处理温度以及处理效果，确保巴氏杀菌的效果最佳，营养成分损失尽可能的减少。
背景技术：
：乳过氧化物酶(lactoperoxidase，lp)是天然存在于乳汁中的一种血红素蛋白，在初乳中含量尤其丰富。lp具有抑菌活性，在没有冷藏的条件下，可以很好的延长鲜乳的保质期。但是巴氏杀菌、超高温杀菌的热处理工艺会导致乳过氧化物酶失活，导致常温乳制品在杀菌以后的反而失去了天然的保护。因此，监控乳制品中的乳过氧化物酶可以控制乳制品的品质，延长乳制品的安全保存期限。多数国家判断巴氏杀菌上限的指示物是lp，lp是一种对热比较稳定的内原酶。牛乳中过氧化物酶体系不仅可以在一定时间内对某些细菌有抑制作用，同时还可以杀灭沙门氏菌、假单孢菌等革兰氏阴性菌。目前没有对应的快速检测方法来判定乳过氧化物酶是否有保留和保留的比例，也无方法快速对比判断巴氏杀菌乳的受热强度。虽然，也有一些研究报道关于食品中的过氧化物酶的检测分析方法，这些检测方法大致可以分为：abts检测法、tmb检测法和愈创木酚检测法。上述三种检测方法属于规范化的检测分析方法，对于过氧化物酶均具有较好的检测作用，具有较高精确度，但是其检测过程都需要使用到大型装置设备，检测分析的过程也极度繁杂，不利于快速分析的需要。也有人尝试设计试纸检测方法进行过氧化物酶的检测分析，但是试纸应用的成分多而复杂，存在稳定性较差，检测效果受到试纸品质波动影响。提供高品质的检测试纸通常意味着更高的成本，对于大量进行鲜乳制品生产的企业而言，往往难以将这样的检测试纸应用到每一批次的产品检测当中。事实上，也没有人对于乳过氧化物酶的存在和牛乳巴氏杀菌热处理过程中进行关联研究，虽然知道巴氏杀菌过程中会导致乳过氧化物酶失活，却没有提出足够的重视。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术中所存在的乳过氧化物酶的快速检测分析方法缺失，以及对于乳过氧化物酶的检测分析的应用不足的缺陷，提供一种牛乳中过氧化物酶的快速检测方法。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：一种牛乳中过氧化物酶的快速检测方法，乳过氧化物酶检测方法，包括以下步骤：(1)预处理：取牛乳分成多份，进行不同的热处理构成多个不同处理的样品。优选地，将多份牛乳样品分别不加热或加热至60-85℃，构成多个不同处理的样品。优选地，加热方式是水浴加热。(2)冷却：样品处理完成后，冷却至40℃以下。(3)显色记录：加入双氧水和对苯二胺反应，记录各个样品随时间变化，呈现的不同颜色，记录步骤1处理的条件和最终牛乳样品的颜色，并一一对应。优选地，还可以将测试结果与标准比色卡比较，记录成可查询数据表格。(4)测试并比对：取经过巴氏杀菌的牛乳，加入双氧水和对苯二胺，加入双氧水和对苯二胺的比例与步骤3相同；摇匀，反应1-10分钟。和步骤3得到的颜色数据以及预处理条件进行对比，得到巴氏杀菌过程中牛乳的受热程度，以及过氧化物酶残留量。进一步，取牛奶/生乳样品加入双氧水和对苯二胺，加入双氧水和对苯二胺的比例与步骤3相同；摇匀，反应1-10分钟；和步骤3得到的颜色数据以及预处理条件进行对比，得到生乳样品是否受过热处理及热处理程度，以及过氧化物酶残留量。得到的结果是基于颜色对比得出的样品是否热处理的定性结论，以及热处理强度在某一个已知(步骤3测试样品预处理)强度范围区间之内，通过这个结论可以指导优化牛奶巴氏杀菌热处理的强度。本发明的过氧化物酶的快速检测方法，抛开了现有技术中的常规纯化处理、大型设备检测分析工艺，直接利用生牛乳中具有活性的过氧化物酶分解双氧水而与对苯二胺反应立即变成青蓝色的特点进行检测分析。通过颜色对比推算得到巴氏杀菌牛奶中的过氧化物酶的含量，得到的结果可能是一个区间范围的结果，和传统的色谱法、仪器法存在一定的差异或不同。虽然结果可能是一个区间范围(基于比色结果介于已知的某两个数据显色结果之前)，却可以大致的反映出物料的受热处理的程度，其中的过氧化物酶的残留量。根据生牛乳加热到一定温度，过氧化物酶被破坏失活，无颜色变化，但随着放置时间变长，残留的少量过氧化物酶反应又逐渐变成浅青灰色等重要特性。取同一原料奶分别不加热、加热至不同的温度，根据冷却后的颜色变化及变色时间，记录重要的特征得出标准比色方案，再将实际检测的显色情况与比色卡比较，定性反映生乳是否受过热处理或受热处理程度、巴氏奶的受热程度及过氧化物酶残留量。虽然检测结果的精确度不及大型设备检测分析结果，但是相对于大型检测设备检测过程繁琐、冗余的检测周期，实现了快速高效的检测，故可以称之为快速检测方法，更具有实际应用价值。进一步，步骤1，取牛乳分成多份以后，至少分成4-15份以上，其中至少含有一份是不加热处理的。优选地，分成7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17份，设置多个不同的加热处理的温度点，进行广泛的差异化的预处理。进一步，步骤1，取牛乳分成多份以后，分别按照不加热、水浴加热到60℃、70℃、75℃、79℃、80℃、81℃、82℃、85℃设置样品并进行预处理。设置的样品点在巴氏杀菌的温度附近设置较多的处理温度参数点，可以更好的实现对于精确控制的需要。重点监测的乳过氧化物酶的变性温度范围，实现对于检测结果的精确控制。80-85℃区间内设置较多的温度点，在此区间范围内牛乳变色差异大，过氧化物酶的残留量因为温度波动敏感，更多的温度点更有利于后续对于数据的区分、比较。进一步，步骤2，处理完成以后快速冷却至37-45℃以下，优选冷却至40℃以下，防止牛乳温度降低过程中过氧化物酶在热处理温度至降温后的温度区间内停留时间过程引起更多的不可控的变质破坏，提高检测建立过氧化物酶的精确度、一致性，避免热处理的温度更高的样品受到更长时间的热变质破坏。在低于40℃的温度范围，一般过氧化物酶具有很好的生物稳定性，不易变质破坏。冷却至40℃以下的时间应当不超过5-300秒，优选不超过10-200秒，优选地冷却速率为10-60秒之内将样品冷却至目标温度以下。例如冷却速率可以是在10、12、15、18、20、23、25、28、30、35或40秒内冷却至目标温度以下。优选地，最好是采用水冷的方式进行冷却，水冷具有简单方便易实施的特点，并且冷却速度快、效果好。优选例如，可以采用流水冲刷的方式进行冷却。流水冲刷可以用自来水进行冲刷，流水冲刷降温速度快，简单易行。进一步，步骤2，冷却过程的降温速率和生产牛乳过程中的巴氏杀菌处理的温度变化速率保持一致，或者接近牛乳生产过程中的控制参数条件。控制降温的速率，使之与生产相一致，更好的和生产变化情况相对应，提高对于生产过程中快速检测需要的精确度，保证生产牛乳的品质。即按照巴氏杀菌的降温时间完成相应的冷却至40℃以下。进一步，每隔1-6个月，更新步骤1-3，总结记录处理的条件和最终牛乳样品的颜色的对应关系。不同的时间或不同批次的牛乳内过氧化物酶在巴氏杀菌过程中存在的变性失活可能存在一定的差异，每隔一段时间进行重现校验，可以提高检测方法的精确度，同时提高监测分析人员对于数据的敏感性，提高对于检测误差的查找和更正。同时，还提供一种根据乳过氧化物酶的快速检测分析进行研究验证巴氏杀菌程度/效果的乳制品巴氏杀菌情况(温度、时间)的快速分析验证方法。巴氏杀菌的主要特点就在于杀菌温度相对较低，可以很好的保持牛乳中的营养成分不被破坏流失，提高乳制品的营养价值。但是任何加热处理都会导致某些营养成分的流失，所以，一般希望巴氏杀菌的温度控制在尽可能低的范围内，减少营养成分的流失。但是，巴氏杀菌的温度又不能太低，以保证巴氏杀菌完全杀灭牛乳中的微生物。为了研究巴氏杀菌和上述的牛乳中的过氧化物酶的保留量的协同，实现乳制品能够尽可能的保留过氧化物酶，提高牛乳的固有的储存过程中固有的抑菌/杀菌性能，提供更好的鲜乳的保质期，减少保存条件的要求或者减少抑菌成分的使用。亟需一种能够反向分析巴氏杀菌效果的检测方法，研究巴氏杀菌的最佳条件参数。或者，精确反向分析生产过程中巴氏杀菌温度的方法。一种巴氏杀菌温度检测方法，采用上述过氧化物酶的快速检测方法的步骤1-3建立起反应的温度和最后处理的牛乳的显色关系对照图表，通过分析巴氏杀菌以后的牛乳的显色情况，得出巴氏杀菌的温度，验证杀菌的真实温度，提高生产的效果以及产品的一致性。一种巴氏杀菌温度检测方法，包括以下步骤：(1)预处理：取牛乳分成多份，进行不同的热处理构成多个不同处理的样品。优选地，将多分牛乳样品分别加热至60-85℃，构成多个不同处理的样品。优选地，加热方式是水浴加热。优选地，热处理过程中的处理时间和巴氏杀菌的时间相同。或者热处理时间和巴氏杀菌的时间相差在1-10秒之内，最好是误差在2-8秒内，如控制在4、5、6、7秒之内的误差等。(2)冷却：样品处理完成后，冷却至40℃以下。优选地，冷却的时候，冷却的速率和巴氏杀菌过程中的冷却速率一致，或者误差在1％-40％以下，最好是冷却速率相差1％-30％以下。优选地，采用水冷方式进行冷却。(3)显色记录：加入双氧水和对苯二胺反应，记录随时间变化，各个样品呈现的不同颜色，记录步骤1处理的条件和最终牛乳样品的颜色，并一一对应。(4)测试并比对：取经过巴氏杀菌的牛乳，加入双氧水和对苯二胺，加入双氧水和对苯二胺的比例与步骤3相同；摇匀，反应1-10分钟；和步骤3得到的颜色数据以及预处理条件进行对比，推算出巴氏杀菌的温度。本发明对于巴氏杀菌温度的检测方法，根据过氧化物酶的变质特性，先设计样品预处理实现精确的已知的热处理温度的牛乳样品，然后将已经的样品进行双氧水、对苯二胺显色反应，记录得到特征性的反应参数。最后根据这些特征性的反应参数和实际的巴氏杀菌牛乳进行显色对比，推算出生产过程中巴氏杀菌的强度。通过本发明的推算方法可以精确的知道巴氏杀菌的强度(温度、时间)，进而调整巴氏杀菌的参数，实现对于乳制品加工工艺的进一步优化，提供更好的优质乳产品。与现有技术相比，本发明的有益效果：1、本发明的过氧化物酶的快速检测方法省略了现有的大型设备检测分析方法的弊端，采用比色法快速的验证牛乳中的过氧化物酶的保留量，具有很好的针对性，牛乳中过氧化物酶的检测效率得到大幅度的改善提升。2、本发明的过氧化物酶的快速检测方法可以用于研究优质乳的巴氏杀菌强度，更好的优化巴氏杀菌参数，使得牛乳中的营养物质更好的保留下来，减少高温处理过程中的营养成分流失。3、本发明的检测方法可以判定生乳样品是否受过热处理及热处理程度，以及过氧化物酶残留量，为检测牛奶品质提供新的可靠的检测方法。附图说明：图1是实施例1中过氧化物酶的快速检测结果。图2是实施例2中过氧化物酶的快速检测结果。图3是实施例3中过氧化物酶的快速检测结果。图4是实施例4中过氧化物酶的快速检测结果。图5是实施例5中过氧化物酶的快速检测结果。图6是实施例6中过氧化物酶的快速检测结果。具体实施方式下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本
发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。【实施例1】牛乳中过氧化物酶的快速检测建立关系式：取90ml牛乳分成9等份，置于9个试管中，不加热或水浴加热到60℃、70℃、75℃、79℃、80℃、81℃、82℃、85℃，保持15秒。然后，自来水龙头下流水冲刷冷却至40℃以下。分别加入0.5ml双氧水和0.5ml对苯二胺反应，记录随时间变化，各个样品呈现的不同颜色，记录显色状态和显色时间和之前的加热处理温度相对应。表1：过氧化物酶检测结果加热温度(℃)颜色变化过氧化物酶结果变色时间不加热变成深蓝色阳性立即变色60变成深蓝色阳性立即变色70变成深蓝色阳性立即变色75变成浅蓝色阳性立即变色79变成浅蓝色阳性立即变色80不变色阴性放3-4min开始变浅灰色81不变色阴性放5min开始变浅灰色82不变色阴性放10min开始变浅灰色85不变色阴性放20min开始变浅灰色巴氏奶**不变色阴性放20min开始变浅灰色*80-85℃：加试剂后统一放置10min或20min观察颜色差异。**巴杀奶：经85±2℃，15s巴杀。结果如图1所示。测试并比对：取经过巴氏杀菌的牛乳或生牛乳10ml，加入0.5ml双氧水和0.5ml对苯二胺，摇匀，反应1-20分钟；观察期显色情况和上述记录的显色状态和时间数据进行对比，得到巴氏杀菌过程中牛乳的受热程度，以及过氧化物酶残留量。不同温度处理的牛奶，加试剂反应后颜色，实际检测时可将颜色与比色卡对比快速判断巴氏奶受热处理的强度和对巴氏奶有益的过氧化物酶的失活程度。【实施例2】牛乳中过氧化物酶的快速检测建立关系式：取80ml牛乳分成8等份，置于8个试管中，不加热或水浴加热到60℃、65℃、72℃、78℃、80℃、82℃、85℃，保持15秒，同时检测市售灭菌乳。然后，自来水龙头下流水冲刷冷却至40℃以下。加入0.2ml双氧水和0.2ml对苯二胺反应，记录随时间变化，各个样品呈现的不同颜色，记录显色状态和显色时间和之前的加热处理温度相对应。表2：过氧化物酶检测结果加热温度(℃)颜色变化过氧化物酶结果变色时间不加热变成深蓝色阳性立即变色60变成深蓝色阳性立即变色65变成深蓝色阳性立即变色72变成浅蓝色阳性立即变色78变成浅蓝色阳性立即变色80不变色阴性放3-4min开始变浅灰色82不变色阴性放10min开始变浅灰色85不变色阴性放20min开始变浅灰色uht奶**不变色阴性放20min开始变浅灰色**uht奶：市售灭菌乳(uht奶)。测试并比对：取经过高温杀菌的牛乳或生牛乳10ml，加入0.2ml双氧水和0.2ml对苯二胺，摇匀，反应1-20分钟；观察期显色情况和上述记录的显色状态和时间数据进行对比，得到巴氏杀菌过程中牛乳的受热程度，以及过氧化物酶残留量。结果如图2所示。【实施例3】牛乳中过氧化物酶的快速检测建立关系式：取50ml牛乳分成10等份，置于10个试管中，不加热或水浴加热到60℃、70℃、75℃、77℃、79℃、81℃、83℃、85℃及90℃，保持10秒。然后，自来水龙头下流水冲刷冷却至40℃以下。分别加入0.2ml双氧水和0.2ml对苯二胺反应，记录随时间变化，各个样品呈现的不同颜色，记录显色状态和显色时间和之前的加热处理温度相对应。表3：过氧化物酶检测结果测试并比对：取经过巴氏杀菌的牛乳或生牛乳10ml，加入0.2ml双氧水和0.2ml对苯二胺，摇匀，反应1-20分钟；观察期显色情况和上述记录的显色状态和时间数据进行对比，得到巴氏杀菌过程中牛乳的受热程度，以及过氧化物酶残留量。结果如图3所示。【实施例4】牛乳中过氧化物酶的快速检测建立关系式：取50ml牛乳分成10等份，置于10个试管中，不加热或水浴加热到70℃、75℃、77℃、79℃、81℃、83℃、85℃、87℃、90℃，保持5秒。然后，自来水龙头下流水冲刷冷却至40℃以下。分别加入0.5ml双氧水和0.5ml对苯二胺反应，记录随时间变化，各个样品呈现的不同颜色，记录显色状态和显色时间和之前的加热处理温度相对应。表4：过氧化物酶检测结果加热温度(℃)颜色变化过氧化物酶结果变色时间不加热变成深蓝色阳性立即变色70变成深蓝色阳性立即变色75变成浅蓝色阳性立即变色77变成浅蓝色阳性立即变色79变成浅蓝色阳性立即变色81不变色阴性放3-4min开始变浅灰色83不变色阴性放5min开始变浅灰色85不变色阴性放10min开始变浅灰色87不变色阴性放20min开始变浅灰色90不变色阴性放20min开始变浅灰色测试并比对：取经过巴氏杀菌的牛乳，加入双氧水和对苯二胺，加入双氧水和对苯二胺的比例与建立关系式过程中添加用量比例一致；摇匀，反应1-20分钟；观察期显色情况和上述记录的显色状态和时间数据进行对比，得到巴氏杀菌过程中牛乳的受热程度，以及过氧化物酶残留量。结果如图4所示。【实施例5】牛乳中过氧化物酶的快速检测建立关系式：取60ml牛乳分成6等份，置于6个试管中，不加热或水浴加热到77℃、79℃、81℃、82℃、85℃，保持10秒，冷却至40℃以下，同时检测uht灭菌乳。分别加入0.5ml双氧水和0.5ml对苯二胺反应，记录随时间变化，各个样品呈现的不同颜色，记录显色状态和显色时间和之前的加热处理温度相对应。表5：过氧化物酶检测结果加热温度(℃)颜色变化过氧化物酶结果变色时间不加热变成深蓝色阳性立即变色77变成浅蓝色阳性立即变色79变成浅蓝色阳性立即变色81不变色阴性放3-4min开始变浅灰色82不变色阴性放5min开始变浅灰色85不变色阴性放10min开始变浅灰色uht灭菌乳不变色阴性放20min开始变浅灰色测试并比对：取经过高温杀菌的牛乳或生牛乳10ml，加入0.5ml双氧水和0.5ml对苯二胺，摇匀，反应1-20分钟；观察期显色情况和上述记录的显色状态和时间数据进行对比，得到巴氏杀菌过程中牛乳的受热程度，以及过氧化物酶残留量。结果如图5所示。【实施例6】牛乳中过氧化物酶的快速检测建立关系式：取90ml牛乳分成9等份，置于9个试管中，不加热或水浴加热到70℃、75℃、77℃、78℃、80℃、82℃、83℃、85℃，保持10秒，冷却至40℃以下，同时检测uht灭菌乳。分别加入0.5ml双氧水和0.5ml对苯二胺反应，记录随时间变化，各个样品呈现的不同颜色，记录显色状态和显色时间和之前的加热处理温度相对应。表6：过氧化物酶检测结果加热温度(℃)颜色变化过氧化物酶结果变色时间不加热变成深蓝色阳性立即变色70变成深蓝色阳性立即变色75变成深蓝色阳性立即变色77变成深蓝色阳性立即变色78变成浅蓝色阳性立即变色80不变色阴性放3-4min开始变浅灰色82不变色阴性放5min开始变浅灰色83不变色阴性放10min开始变浅灰色85不变色阴性放20min开始变浅灰色uht灭菌乳不变色阴性放20min开始变浅灰色测试并比对：取经过高温杀菌的牛乳或生牛乳10ml，加入0.5ml双氧水和0.5ml对苯二胺，摇匀，反应1-20分钟；观察期显色情况和上述记录的显色状态和时间数据进行对比，得到巴氏杀菌过程中牛乳的受热程度，以及过氧化物酶残留量。结果如图6所示。上述多个实施例的实验结果表明可以通过取牛乳/牛奶进行预先的类似于巴氏杀菌温度范围内进行模拟热处理，用双氧水和对苯二胺进行显色反应，建立起可靠的样品显色变化对照关系表。然后，对特点的牛奶/牛乳样品进行同样的显色反应，对比显色情况，分析牛奶/牛乳样品中的过氧化物酶的残留量，对提升牛奶/牛乳品质具有重要的指导意义。采用上述实施例收集的数据，对现有的巴氏杀菌牛奶进行同样的显色处理，比较颜色变化情况，分析巴氏杀菌牛奶的热处理强度，优化巴氏杀菌强度以及波动变化情况，提高生产中杀菌效果稳定性以及产品的一致性。当前第1页12