一种测定工业用纤维素酶酶活力的方法与流程

本发明涉及酶工程领域，具体涉及一种测定工业用纤维素酶酶活力的方法。
背景技术：
：纤维素酶广泛应用与诸多领域，在纺织工业中，可以用来抛光及牛仔布洗色；在造纸工业中，可以用于纤维质前处理或打浆，还可以用于废纸回收的脱墨工艺；饲料工业中，可以用于饲料用酶的复配，提高动物对饲料的消化率等等。然而目前纤维素酶的酶活力评价主要以可溶性的羧甲基纤维素钠(简称cmc钠盐)为底物，但在纤维素酶的实际应用中，其底物往往比可溶性的cmc钠盐要复杂的多，通常是不溶性的纸张、纤维质、棉纤维等。所以通过cmc钠盐检测的纤维素酶活性很难真正反馈出酶对不溶性底物的活性，从而影响在实际工业应用中评估纤维素酶的应用潜力。国标滤纸酶活法只针对饲用纤维素酶(完整的酶系)，针对纺织、造纸等以内切葡聚糖酶为主的纤维素酶样品，评估能力有限，尤其是酶活较低的样品，很难完成评估。因此，探索并建立一种更为科学、客观和简便评估纤维素酶对不溶性底物酶活力的体外检测方法是迫切需要的。技术实现要素：鉴于此，有必要针对上述问题提供一种快速测定工业用纤维素酶酶活力的方法。与cmc法和国标滤纸酶活法对比，本法能更准确地评估工业纤维素酶的实际应用效果及潜力。本发明是通过以下技术方案实现的：一种测定工业用纤维素酶酶活的方法，包括下列步骤：1)试剂及材料准备；2)制作标准曲线；3)纤维素酶样品处理；4)设置实验组和对照组，分别加入纤维素酶底物和纤维素酶样品；5)进行酶解反应；6)以对照组为空白对照，测试5)中各组反应上清液的吸光度；7)根据2)所制得的标准曲线计算出纤维素酶酶活。进一步的，步骤3)中纤维素酶样品处理包括：纤维素酶样品用ph6.0-8.0磷酸缓冲液梯度稀释至合适浓度，以使吸光度保持在0.27-0.3之间即可。进一步的，步骤4)中纤维素酶底物为定量滤纸、棉布或其他纤维质材料；优选不溶性定量滤纸；更优选whatman定量滤纸。进一步的，步骤5)中酶解反应为：水浴振荡摇床中反应酶解，反应时间控制在1h内(酶解时间可根据酶活调整延长或缩短)，优选30min，然后分别加dns溶液终止反应。进一步的，步骤5)的酶解反应体系ph为6.0-8.0，反应温度50-70℃；优选ph6.0，反应温度50℃。进一步的，所述方法反应总体系为4ml；优选步骤4)加入1ml样品酶液、步骤5)加入3mldns终止液，不再做稀释处理，可以检测更低的酶活样品。进一步的，所述方法在工业用纤维素酶酶活评估的应用。本发明有益效果：本发明以不溶性的底物替代羧甲基纤维素钠，优选whatman定量滤纸作为不溶性纤维素酶底物，相对国标法的whatman1号定性滤纸而言，杂质干扰较小；以不溶性的定量滤纸替代羧甲基纤维素钠及定性滤纸作为为纤维素酶底物，更能反馈出工业用纤维素酶的实际应用环境。优化反应体系的温度、ph等使测定的结果更能科学地反馈纤维素酶对不溶性底物的亲和力及效价，从而更客观地反应出纤维素酶的应用效果及潜力；本发明优化后的反应体系中，酶解ph为6-8、反应温度50-70℃，更接近工业纤维素酶使用环境；优选4ml体系，即1ml酶液和3mldns终止液，不再做稀释处理，可以检测更低的酶活样品。本发明通过抛光实验实际应用试验来体现本发明方法评估纤维素酶酶活的潜力，相对于传统的cmc钠盐测定方法，更能有效反馈出纤维素酶对不溶性底物的水解活性，即更能有效反馈出酶在各工业领域的应用潜力；本发明优化后的体系相对于国标法具有更低的检测限。对比样品cmc活性、国标法滤纸活性及本法滤纸酶活，相同cmc酶活的不同样品，其滤纸活性差异较大，实际抛光应用试验说明滤纸酶活更能准确地反馈出纤维素酶的应用潜力及效价。附图说明图1：ph6.0葡萄糖标准曲线；其中纵坐标为光密度、横坐标为葡萄糖标准管的葡萄糖终含量。具体实施方式为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。实施例1本发明方法纤测定维素酶酶活一、试剂及材料准备1)制备所需ph值的磷酸缓冲液(磷酸缓冲液ph值与反应体系ph值一致)。2)定量滤纸准备：取whatman定量滤纸于80℃烘干4h备用。3)葡萄糖标准溶液制备：称取1.000g无水葡萄糖(sigma)，溶于50.0mlph6.0的磷酸缓冲液中，混匀定容至100ml，标明为一号标准液。取一号标准液10.0ml用ph6.0的磷酸缓冲液定容至100ml，标明为二号标准液。两种溶液4℃下密封可保存1个月。4)dns试剂制备：溶解10.0g3,5--二硝基水杨酸，16.0gnaoh和300.0g酒石酸钾钠于700ml蒸馏水中，定容至1000ml，混匀后盛于棕色试剂瓶中,暗处放置一周后使用。二、标准曲线制作1)取6支试管按表1加入葡萄糖标准溶液，再在每管中加入3mldns试剂，充分混匀后置沸水浴中水浴5min,再经冷水冷却5min；2)以试管1作0对照，在540nm下测光密度，再以光密度为纵坐标，葡萄糖标准管的葡萄糖终含量为横坐标，绘出标准曲线(图1)。表1葡萄糖标准溶液配制表序号(试管号)123456缓冲液加入量(μl)10009008007507006502号标准液加入量(μl)0100200250300350葡萄糖终含量(μg)0100200250300350序号(试管号)123456三、本发明方法测定纤维素酶样品1的酶活1)纤维素酶样品处理：纤维素酶样品用ph6.0磷酸缓冲液梯度稀释至合适浓度(稀释了20倍)，以使吸光度保持在0.27-0.3之间即可；2)酶对照组：在试管中加入50mg的剪碎的定量滤纸，再加入1ml高温处理致失活的酶样品；3)酶实验组：在试管中加入50mg的剪碎的定量滤纸，再加入1ml50℃预热3min的酶样品；4)对照组与实验组反应体系ph为6.0，一同置于50℃的水浴振荡摇床中反应酶解30min，分别加3ml的dns溶液终止反应；5)将上述对照组与实验组试管一同置于沸水浴中5min，然后冷水浴冷却5min；将试管内样品转移至离心管中，12000rpm高速离心，将滤纸屑沉淀，上清用于吸光度检测；6)以对照组为空白对照，测定实验组540nm下的吸光度为0.283，根据标准曲线读出实验组中酶解后产生的葡萄糖当量a(样品1对应葡萄糖当量a为115.72)；7)纤维素酶酶活计算：酶活性(u/ml)＝a×d/t×1.0，a为通过标准曲线读出的葡萄糖当量(μg)，d为样品的稀释倍数，t为酶解时间(min)，1.0为加入的待测酶液量(ml)。8)酶活定义：单位时间内，水解滤纸产生1μg还原糖定义为1个酶活单位，以μ/ml表示。计算本实施例中样品1的酶活约为77.14(u/ml)。实施例2本发明方法纤测定维素酶样品2的酶活一、试剂及材料准备(同实施例1)。二、标准曲线制作(同实施例1)。三、本发明方法纤测定维素酶酶活1)纤维素酶样品处理：纤维素酶样品用ph8.0磷酸缓冲液梯度稀释至合适浓度(稀释了7倍)，使吸光度保持在0.27-0.3之间即可；2)酶对照组：在试管中加入50mg的剪碎的定量滤纸，再加入1ml高温处理失活的酶样品；3)酶实验组：在试管中加入50mg的剪碎的定量滤纸，再加入1ml50℃预热3min的酶样品；4)对照组与实验组反应液ph为8，二者一同置于70℃的水浴振荡摇床中反应酶解30min，分别加3ml的dns溶液终止反应；5)将上述对照组与实验组试管一同置于沸水浴中5min，然后冷水浴冷却5min；将试管内样品转移至离心管中，12000rpm高速离心，将滤纸屑沉淀，上清用于吸光度检测；步骤6-8同实施例1。本实施例中样品2对应葡萄糖当量a为120.52，计算样品2的酶活约为28.12(u/ml)。实施例3本发明方法纤测定维素酶样品3的酶活一、试剂及材料准备(同实施例1)。二、标准曲线制作(同实施例1)。三、本发明方法纤测定维素酶酶活1)纤维素酶样品处理：纤维素酶样品用ph,7.0磷酸缓冲液梯度稀释至合适浓度(稀释了10倍)，使吸光度保持在0.27-0.3之间即可；2)酶对照组：在试管中加入50mg的剪碎的定量滤纸，再加入1ml高温处理失活的酶样品；3)酶实验组：在试管中加入50mg的剪碎的定量滤纸，再加入1ml50℃预热3min的酶样品；4)对照组与实验组反应液ph为7.0，二者一同置于65℃的水浴振荡摇床中反应酶解30min，分别加3ml的dns溶液终止反应；5)将上述对照组与实验组试管一同置于沸水浴中5min，然后冷水浴冷却5min；将试管内样品转移至离心管中，12000rpm高速离心，将滤纸屑沉淀，上清用于吸光度检测；步骤6-8同实施例1。本实施例中样品3对应葡萄糖当量a为112.52，计算样品2的酶活约为37.5(u/ml)。实施例4纤维素酶的筛选及应用评估1)这里以本实验室筛选的纤维素酶(内切葡聚糖酶)ma5、sc5、ma1、an5、au3及市面产品n25为例说明本测定方法的优势。首先用传统的cmc钠盐作为纤维素酶的底物来测定ma5、sc5、ma1、an5、au3及n25的酶活性，然后将ma5、sc5、ma1、an5、au3及n25酶样梯度稀释至cmc活性为1800u/ml；然后，用本发明实施例1的方法测定cmc活性都为1800u/ml的ma5、sc5、ma1、an5、au3及n25的滤纸活性，见表2。2)取相同cmc活性(1800u/ml)的纤维素酶做纺织抛光实验，对比ma5、sc5、ma1、an5、au3及n25纤维素酶的实际抛光应用效果；抛光实验：分别称取100g烘干的棉布加入ph6.0的8公斤水中，将水与布一起倒入洗衣机中，分别添加相同cmc活性(1800u/ml)的ma5、sc5、ma1、an5、au3及n25纤维素酶液，机器温度控制在50℃，转速180rpm，运行时间1h；对照组用清水替代酶液，其他条件不变。抛光完成后，将布匹完全烘干，称重，计算失重率。表2纤维素酶的定量滤纸酶活及抛光效果结果分析：1)表2显示cmc活性一致的纤维素酶样品，其滤纸活性相差却较大，即其对不溶性底物的亲和力及水解活性是存在差异的；2)在相同的cmc酶活下，ma5、sc5、ma1、an5、au3及n25的实际抛光效果相差较大，抛光效果即失重率n25>tt5>sc5>ma5>ma1>an5、au3>水，与本发明方法测定的滤纸酶活性趋势相一致，说明本法相对于传统的cmc钠盐测定方法，更能有效反馈出纤维素酶对不溶性底物的水解活性，即更能有效反馈出酶在各工业领域的应用潜力。实施例5饲用纤维素酶滤纸酶活国标法与本发明方法区别1)国标法所用ph为5.5，温度为37℃，这只符合饲料的使用特征；2)其所用的滤纸为whatman1号定性滤纸，含有灰分，相对定量滤纸而言，其含有较多灰分，在酶解后，有很多杂质干扰吸光度的测量，稳定性相对较差(表3)；3)取ma5样品，稀释至吸光度0.27-0.3左右，对比国标法与本发明实施例1的方法测定吸光度的稳定性，同时做8个平行进行评估540nm下的吸光度(表3)。表3滤纸酶活法的稳定性比较12345678国标法0.2250.2760.2410.3120.2670.2810.2290.302实例1方法0.3120.3310.3220.3170.3280.3090.3170.326针对低酶活的样品vv2,本法测定的滤纸酶活为4.3u/ml，吸光度为0.316，而用饲用纤维素酶滤纸酶活国标法测定的吸光度为0.03-0.06，该数值太低，误差较大，即其检测限相对于本法而言较高。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12