本发明涉及生物医药
技术领域：
，具体而言，涉及一种核蛋白的染色试剂盒及应用和核蛋白染色方法。
背景技术：
：精液检查是估测男性生育能力最重要、最实用的检查，在大多数有关生殖及计划生育的科学研究中，多是以精液参数作为金标准，分析实验结果，探讨与其的相关性。精液是由睾丸、附睾及附属性腺，如前列腺、精囊和尿道球腺所产生的混合分泌物，由精子和精浆组成。当睾丸、附睾、输精管、前列腺、精囊等附属性腺结构和功能障碍时，对精液质量均有影响。目前的精液检测中，检测方法复杂，过程繁琐；因此需要一种简单高效的检查方法。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种核蛋白的染色试剂盒，该染色试剂盒含有可以对核蛋白进行染色的染色液，方便对精细胞等进行染色的操作。本发明的第二目的在于提供上述核蛋白的染色试剂盒在核蛋白染色中的应用。本发明的第三目的在于提供一种核蛋白染色方法，通过该方法，可以快速完成对精细胞等含有核蛋白的细胞进行染色，染色过程简单，方便操作，且染色效果较佳。为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：一种核蛋白的染色试剂盒，染色试剂盒包括固绿染色液，曙红y染色液以及苯胺蓝染色液。上述核蛋白的染色试剂盒在核蛋白染色中的应用。一种核蛋白染色方法，包括以下步骤：取待检精液样本用第一缓冲溶液吹打，离心得到精细胞沉淀团；将精细胞沉淀团用第二缓冲溶液溶解，得到精细胞溶液，取精细胞溶液涂片，静置并晾干，得到玻片样本；用固绿染色液染色玻片样本，再用曙红y染色液初染，以及苯胺蓝染色液复染，得到核蛋白染色样本。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的核蛋白的染色试剂盒含有多种特异性的染色试剂，能与核蛋白高效、稳定的结合，准确地、特异地参与反应，运用上述染色试剂盒的核蛋白染色方法，可以通过简单的实验步骤，快速实现核蛋白的染色，具有较大的使用价值和社会价值。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本发明实施例的一种核蛋白的染色试剂盒及应用和核蛋白染色方法进行具体说明。精子核占头部65％，由鱼精蛋白及dna构成。精子细胞阶段，dna和组蛋白通常结合成为核蛋白复合体形式，染色质纤维连接鱼精蛋白核组蛋白。当圆形的精子细胞拉长变形演化形成精子时，首先合成过渡蛋白取代原来的组蛋白-dna复合体。到了晚期精子细胞、过渡蛋白又被高度浓聚的鱼精蛋白-dna复合体所代替，即为成熟的精子核，但仍保留了少量的组蛋白和过渡蛋白(组蛋白约占15％，鱼精蛋白约占85％)，鱼精蛋白分子中富含精氨酸和胱氨酸，一般不含赖氨酸；组蛋白和过渡蛋白中含有丰富的赖氨酸。苯胺蓝可与富含赖氨酸的组蛋白结合而成蓝色，以此来显示精子核蛋白组型转换。一种核蛋白的染色试剂盒，染色试剂盒包括固绿染色液，曙红y染色液以及苯胺蓝染色液。进一步地，本发明的较佳实施例中，固绿染色液为固绿的甲醇溶液，固绿染色液中固绿与甲醇的料液比为1-5:1000000。进一步地，本发明的较佳实施例中，曙红y染色液主要由曙红y溶解于pbs溶液制得，曙红y与pbs溶液的料液比1-100:10000。进一步地，本发明的较佳实施例中，苯胺蓝染色液主要由苯胺蓝溶解于醋酸制得，苯胺蓝与醋酸的料液比为1-4:100。不同的氨基酸带有不同化学性质的侧链基团，有的带有碱性侧链，有的带有酸性侧链，由此组成的蛋白质具有不同数目的碱性基团和酸性基团，这些基团会使蛋白质在不同的ph溶液中带有不同的净电荷，整个蛋白质分子带正电荷多，即为碱性蛋白。碱性固绿染色液是利用碱性蛋白质与带有负电荷的碱性染料固绿结合进行染色，细胞中含量最为丰富的碱性蛋白为组蛋白，主要存在于细胞核中，因此染色后细胞核大部分被染成绿色。苯胺蓝染色液，水溶液呈蓝色，加氢氧化物溶液呈棕红色、浓硫酸中呈红黄色，稀释后析出蓝色沉淀；生物染色剂，用于神经组织、细胞、结蒂组织的染色；酸碱指示剂。染色液能够将核成熟的精子的头部染成红色，核不成熟的精子的头部染成蓝色，以红色和蓝色来区分精子是否成熟，颜色对比鲜明，区分度高。固绿染色液具有固定的作用，可以将样本中的精细胞固定在载玻片上，方便镜检和实验。上述核蛋白的染色试剂盒在核蛋白染色中的应用。一种核蛋白染色方法，包括以下步骤：取待检精液样本用第一缓冲溶液吹打，离心得到精细胞沉淀团；将精细胞沉淀团用第二缓冲溶液溶解，得到精细胞溶液，取精细胞溶液涂片，静置并晾干，得到玻片样本；用固绿染色液染色玻片样本，再用曙红y染色液初染，以及苯胺蓝染色液复染，得到核蛋白染色样本。进一步地，本发明的较佳实施例中，第一缓冲溶液和第二缓冲溶液为生理盐水或者pbs溶液。通过将生理盐水或者pbs溶液作为第一缓冲溶液和第二缓冲溶液，将精细胞保存在缓冲液中，保存精细胞的环境稳定，避免精细胞失活。进一步地，本发明的较佳实施例中，离心的转速为1800-2500rpm，离心的时间为3-6min。进一步地，本发明的较佳实施例中，固绿染色液进行染色的时间为1-10min；曙红y染色液进行染色的时间0.2-5min，苯胺蓝染色液的进行染色的时间为0.2-5min。进一步地，本发明的较佳实施例中，苯胺蓝染色液染色结束后还包括用水冲洗核蛋白染色样本1-5次。以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供一种核蛋白的染色试剂盒，该染色试剂盒的染色试剂包括固绿染色液，曙红y染色液以及苯胺蓝染色液。其中，固绿染色液为固绿的甲醇溶液；将1g的固绿染料粉末溶解于100ml的甲醇溶液中；制得固绿甲醇母液；在使用的时候，按照1:1000000的比例制备固绿染色液的工作液，取10μl的固绿甲醇母液添加到99.99ml的甲醇溶液中，制得固绿染色液的工作液。曙红y染色液由曙红y溶解于pbs溶液制得，将1g的曙红y染料粉末溶解于100ml的pbs溶液中，制得曙红y染色液。苯胺蓝染色液有苯胺蓝染料粉末溶解于醋酸制得，将1g的苯胺蓝粉末溶解于100ml的醋酸溶液中，制得苯胺蓝染色液。本实施例还提供一种核蛋白染色方法，具体步骤如下：1.1样本制备，采集精液样本，静置2h液化；1.2取0.2ml液化的精液加入到1ml作为第一缓冲溶液的生理盐水中，反复吹打数次，至混合均匀，得到精液混合样本；1.3在1800rpm的转速条件下，离心精液混合样本6min，得到精细胞沉淀团；1.4将精细胞沉淀团加入到0.5ml的作为第二缓冲溶液的pbs溶液中，混合精细胞沉淀团，得到精细胞溶液；1.5取3μl的精细胞溶液均匀涂片在载玻片上，得到玻片样本；1.6将玻片样本置于制得固绿染色液的工作液中，染色10min，然后将载玻片取出放入曙红y染色液，染色0.2min；1.7取出玻片样本用清水冲洗1次；1.8将经过步骤1.7处理的玻片样本用苯胺蓝染色液染色5min；1.9取出玻片样本用清水冲洗玻片样本5次，晾干，制得核蛋白染色样本进行镜检或实验。实施例2本实施例提供一种核蛋白的染色试剂盒，该染色试剂盒的染色试剂包括固绿染色液，曙红y染色液以及苯胺蓝染色液。其中，固绿染色液为固绿的甲醇溶液；将5g的固绿染料粉末溶解于100ml的甲醇溶液中；制得固绿甲醇母液；在使用的时候，按照5:1000000的料液比制备固绿染色液的工作液，取10μl的固绿甲醇母液添加到99.99ml的甲醇溶液中，制得固绿染色液的工作液。曙红y染色液由曙红y溶解于pbs溶液制得，将1g的曙红y染料粉末溶解于100ml的pbs溶液中，制得曙红y染色液母液，取1ml曙红y染色液母液加入到99ml的pbs溶液中，制得曙红y染色液的工作液。苯胺蓝染色液有苯胺蓝染料粉末溶解于醋酸制得，将4g的苯胺蓝粉末溶解于100ml的醋酸溶液中，制得苯胺蓝染色液。本实施例还提供一种核蛋白染色方法，具体步骤如下：1.1样本制备，采集精液样本，静置1h液化；1.2取0.5ml液化的精液加入到1ml作为第一缓冲溶液的pbs溶液中，反复吹打数次，至混合均匀，得到精液混合样本；1.3在2500rpm的转速条件下，离心精液混合样本3min，得到精细胞沉淀团；1.4将精细胞沉淀团加入到0.2ml的作为第二缓冲溶液的pbs溶液中，混合精细胞沉淀团，得到精细胞溶液；1.5取15μl的精细胞溶液均匀涂片在载玻片上，得到玻片样本；1.6将玻片样本置于制得固绿染色液的工作液中，染色1min，然后将载玻片取出放入曙红y染色液，染色5min；1.7取出玻片样本用清水冲洗5次；1.8将经过步骤1.7处理的玻片样本用苯胺蓝染色液染色0.2min；1.9取出玻片样本用清水冲洗玻片样本1次，晾干，制得核蛋白染色样本进行镜检或实验。实施例3本实施例提供一种核蛋白的染色试剂盒，该染色试剂盒的染色试剂包括固绿染色液，曙红y染色液以及苯胺蓝染色液。其中，固绿染色液为固绿的甲醇溶液；将2g的固绿染料粉末溶解于100ml的甲醇溶液中；制得固绿甲醇母液；在使用的时候，按照2:1000000的料液比制备固绿染色液的工作液，取10μl的固绿甲醇母液添加到99.99ml的甲醇溶液中，制得固绿染色液的工作液。曙红y染色液由曙红y溶解于pbs溶液制得，将1g的曙红y染料粉末溶解于100ml的pbs溶液中，制得曙红y染色液母液，取0.5ml曙红y染色液母液加入到99.5ml的pbs溶液中，制得曙红y染色液的工作液。苯胺蓝染色液有苯胺蓝染料粉末溶解于醋酸制得，将2g的苯胺蓝粉末溶解于100ml的醋酸溶液中，制得苯胺蓝染色液。本实施例还提供一种核蛋白染色方法，具体步骤如下：1.1样本制备，采集精液样本，静置1.5h液化；1.2取0.3ml液化的精液加入到1ml作为第一缓冲溶液的pbs溶液中，反复吹打数次，至混合均匀，得到精液混合样本；1.3在2000rpm的转速条件下，离心精液混合样本5min，得到精细胞沉淀团；1.4将精细胞沉淀团加入到0.4ml的作为第二缓冲溶液的pbs溶液中，混合精细胞沉淀团，得到精细胞溶液；1.5取10μl的精细胞溶液均匀涂片在载玻片上，得到玻片样本；1.6将玻片样本置于制得固绿染色液的工作液中，染色8min，然后将载玻片取出放入曙红y染色液，染色2min；1.7取出玻片样本用清水冲洗3次；1.8将经过步骤1.7处理的玻片样本用苯胺蓝染色液染色2min；1.9取出玻片样本用清水冲洗玻片样本3次，晾干，制得核蛋白染色样本进行镜检或实验。实验例1本实验例通过使用实施例1-3提供的核蛋白的染色试剂盒和核蛋白染色方法分别对3批次，每个批次50个待检样本进行染色并检测。在普通光学显微镜下观察精子着色情况。着色为红色的精子是核蛋白成熟的精子；着色为蓝色的精子为核蛋白不成熟的精子。至少观察200个精子，计数核蛋白不成熟的精子数量并计算百分率。(核蛋白不成熟的精子数/观察的精子总数)×100％＝核蛋白不成熟的精子百分率；正常参考值为：核蛋白不成熟精子百分率≤30％。实施例1提供的核蛋白的染色试剂盒和核蛋白染色方法检测第一批次待检样本，实施例2提供的核蛋白的染色试剂盒和核蛋白染色方法检测第二批次待检样本，实施例3提供的核蛋白的染色试剂盒和核蛋白染色方法检测第三批次待检样本，对3个批次的待检样本的检测情况如表1-3所示。表1实施例1的检测结果表表2实施例2的检测结果表样本批次第二批次不成熟样本数29与实际符合度100％表3实施例3的检测结果表样本批次第三批次不成熟样本数15与实际符合度100％从表1-3的结果可以看出，采用本发明提供的核蛋白的染色试剂盒和核蛋白的对待检的精液样本进行检测，检测结果与实际情况完全吻合，说明本实施例的染色试剂盒和染色方法能较好的完成任务。实验例2本实验例使用实施例3提供的试剂盒对100份样本分别用临床检查的方法和本发明提供的试剂盒进行检测，以验证检测试剂盒中检测试剂的稳定性和检测方法的可靠性。100份样本的具体实验检验结果见表4，具体实验方法参考实施例3。表4100样本的重复检验结果从表4的结果可以看出，通过对比100份样本通过实施例3提供的试剂盒的检测的阳性率数据和临床实验检测的阳性率数据，可以看出，实施例3提供的试剂盒检测的数据与临床实验数据基本吻合，说明本发明提供的试剂盒检测结果可靠，由于发明提供的试剂盒检测方法简单，流程节约，实验过程缩短，具有结果稳定可靠，检测效率高的特点。综上所述，本发明实施例提供的核蛋白的染色试剂盒具有简单的染色试剂，通过合理的不同配偶比的染色液的制备，可以较好的染色核蛋白；本是发明提供的核蛋白染色方法通过使用上述染色液，能得到较为准确的染色结果，具有较高的实用性和较高的推广应用价值。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。当前第1页12