一种福沙匹坦双葡甲胺原料或制剂及其杂质的检测方法与流程

本发明属于药物及其杂质的化学检测的技术领域。

背景技术：

福沙匹坦双葡甲胺(fosaprepitantdimeglumine 商品名：EMEND)，化学名为2-S-(1-R-3,5-三氟甲基苯基乙基)-3-S-4-氟苯基-4-（1-苄基磷酰基-3-氧-4-氢-1,2,4-三氮唑）-甲基吗啉双葡甲胺盐（分子式：C23H22F7N4O6P•2C7H17NO5），是由默克制药有限公司(Merck KGaA)开发的一种称作人P物质/神经激肽1(NK-1)选择性高亲和性受体阻断剂，主要通过阻断大脑恶心和呕吐信号新颖的作用机制发挥作用。阿瑞匹坦对5-羟色胺(5-HT3)、多巴胺和糖皮质激素受体极微弱或无亲和性，用于治疗化疗诱导的恶心和呕吐及术后恶心和呕吐。

由于受生产工艺和控制水平的限制，生产所得的福沙匹坦双葡甲胺产品中，往往存在有多种杂质，例如，[3-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基] -3-(4-氟苯基)-吗啡啉-4-甲基]-5-氧-4,5-二氢-[1,2,4]三唑-1-基]-磷酸二苄酯、[3-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基] -3-(4-氟苯基)-吗啡啉-4-甲基]-5-氧-4,5-二氢-[1,2,4]三唑-1-基]-磷酸-单苄酯、5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基] -3-(4-氟苯基)-4-吗啡啉]甲基]-1,2-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮等，严重影响福沙匹坦双葡甲胺的产品质量和患者的用药安全。

然而，现有技术中未有针对福沙匹坦双葡甲胺及上述多种杂质的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种福沙匹坦双葡甲胺原料或制剂及其杂质的检测方法。

本发明的技术方案如下：一种福沙匹坦双葡甲胺原料或制剂及其杂质的检测方法，使用高效液相色谱对福沙匹坦双葡甲胺原料或制剂样品溶液进行检测分析，检测所用色谱柱的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相包括流动相A及流动相B，其中流动相A包括磷酸缓冲液，流动相B包括乙腈，由流动相A及流动相B在0~50min内对福沙匹坦双葡甲胺原料或制剂样品溶液进行梯度洗脱；检测波长200-300nm；根据高效液相色谱结果对目标物质进行定性或定量即可；所述目标物质包括福沙匹坦双葡甲胺；对照品与目标物质相对应。

使用该技术方案，可以将福沙匹坦双葡甲胺与其杂质A~G等7种杂质有效分离，排除了上述杂质在HPLC检测过程中对福沙匹坦双葡甲胺定性或定量检测的影响，为更加准确地实现对主药成分的检测提供了新方法。

杂质A~G的结构如下：

杂质A的名称为磷酸二苄酯；

杂质B的名称为二苄酯磷酸铵；

杂质C的名称为三苯氧磷；

杂质D的名称为[3-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基] -3-(4-氟苯基)-吗啡啉-4-甲基]-5-氧-4,5-二氢-[1,2,4]三唑-1-基]-磷酸二苄酯；

杂质E的名称为[3-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基] -3-(4-氟苯基)-吗啡啉-4-甲基]-5-氧-4,5-二氢-[1,2,4]三唑-1-基]-磷酸-单苄酯；

杂质F的名称为5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基] -3-(4-氟苯基)-4-吗啡啉]甲基]-1,2-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮；

杂质G的名称为焦磷酸四苄酯。

当然，基于上述色谱分离效果，上述检测方法中除了可以实现对主药成分的定性或定量控制，同时也可以实现对上述各杂质的定性或定量检测。因此，进一步地，所述目标物质还包括如下杂质中的一种或多种：磷酸二苄酯、二苄磷酸铵、三苯氧磷、[3-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基] -3-(4-氟苯基)-吗啡啉-4-甲基]-5-氧-4,5-二氢-[1,2,4]三唑-1-基]-磷酸二苄酯、[3-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基] -3-(4-氟苯基)-吗啡啉-4-甲基]-5-氧-4,5-二氢-[1,2,4]三唑-1-基]-磷酸-单苄酯、5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基] -3-(4-氟苯基)-4-吗啡啉]甲基]-1,2-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮、焦磷酸四苄酯。

本发明中所述“对照品与目标物质相对应”，是指根据目标物质选取该化合物相对应的对照品，如目标物质为福沙匹坦双葡甲胺，则对应的就是福沙匹坦双葡甲胺对照品；若目标物质为磷酸二苄酯，则对应的就是磷酸二苄酯对照品。

本发明中所述对照品，均满足色谱级纯度要求。

另外，本发明还提供了一种福沙匹坦双葡甲胺原料或制剂中杂质的检测方法，使用高效液相色谱对福沙匹坦双葡甲胺原料或制剂样品溶液进行检测分析，检测所用色谱柱的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相包括流动相A及流动相B，其中流动相A包括磷酸缓冲液，流动相B包括乙腈，梯度洗脱；检测波长200-300nm；根据高效液相色谱结果对杂质进行定性或定量即可。

所述杂质包括磷酸二苄酯、二苄磷酸铵、三苯氧磷、[3-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基] -3-(4-氟苯基)-吗啡啉-4-甲基]-5-氧-4,5-二氢-[1,2,4]三唑-1-基]-磷酸二苄酯、[3-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基] -3-(4-氟苯基)-吗啡啉-4-甲基]-5-氧-4,5-二氢-[1,2,4]三唑-1-基]-磷酸-单苄酯、5-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基] -3-(4-氟苯基)-4-吗啡啉]甲基]-1,2-二氢-3H-1,2,4-三唑-3-酮、焦磷酸四苄酯中的一种或多种；对照品与杂质相对应。

使用该技术方案，可有效检测出福沙匹坦双葡甲胺上述杂质A~G中的一种或多种。

本发明一个具体实施方式中，可以分别或同时对福沙匹坦双葡甲胺原料或制剂样品溶液中杂质A~G中的一种或多种进行定性或定量检测,且各杂质峰的分离度良好。

本发明中定性检测，可以使用常规方法进行，例如选用对照品通过外标法进行对应分析，又或者通过HPLC将各成分分开以后，通过常规鉴定手段进行定性分析，如质谱、薄层、紫外等等。

本发明中定量检测，可以使用外标法、面积归一法等常规方法进行含量计算。

在定量分析时，若使用外标法，采用常规手段制作标准曲线进行计算即可；但在定性分析时，则无需制作标准曲线，可以通过保留时间来判定。

本发明一个具体实施方式中，上述各检测方法的梯度洗脱的条件为：

其中，所述磷酸缓冲液中含有磷酸二氢根离子和磷酸根离子，pH为2~3进一步地，所述磷酸缓冲液为磷酸二氢铵-磷酸缓冲液。

本发明一个具体实施方式中，磷酸二氢铵浓度为20~50mM，优选50 mM。

本发明一个具体实施方式中，缓冲液pH为2.2。

流动相B中含有乙腈，可以是纯乙腈，也可以是同时含有乙腈和其他助剂的混合液，这些助剂或许可以帮助乙腈改善出峰效果，本发明一个具体实施方式中，流动相B选自乙腈。

本发明一个具体实施方式中，所述色谱柱长度为250nm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm。

本发明检测波长，可以在前述公开的范围内通过常规手段进行调节选择。在寻找最佳检测波长时，可以使用紫外分光光度法、HPLC配套使用的全波段扫描等方式进行，再配合HPLC检测器的检测效果（如避免溶剂干扰等），采用常规技术授权找到适宜的检测波长。本发明一个具体实施方式中，检测波长选自210-220nm，例如在215nm。

本发明中，柱温、流速、进样量等参数可以在常见范围内选择。

所述色谱柱的柱温可以选自20℃～40℃，例如20、25、30、35、40℃等。

所述流动相的流速为0.8ml/min～1.2ml/min，例如1.0ml/min等。

所述进样体积为10μl～50μl，例如进样体积为10、20μl等。

本发明中，福沙匹坦双葡甲胺原料或制剂样品溶液是由福沙匹坦原料或制剂样品溶于乙腈或乙腈-水混合液制备得到；进一步地，乙腈-水混合液中，乙腈体积比在40%以上，可进一步选自50%。

本发明中，将对照品制备对照品溶液以乙腈或乙腈-水混合液为溶剂；乙腈-水混合液中，乙腈体积比在40%以上，可进一步选自50%。本发明中福沙匹坦双葡甲胺及其杂质A~G各色谱峰之间的分离度高，相互之间无干扰，可以同时实现对福沙匹坦双葡甲胺、杂质A~G的准确检测，如在本发明的一个实施例中经对照测试，杂质A与杂质B的分离度为27.567；杂质B与福沙匹坦双葡甲胺的分离度为4.544；福沙匹坦双葡甲胺与杂质C的分离度为4.08；杂质C与杂质E的分离度为26.961；杂质E与杂质F的分离度为16.455；杂质F与杂质G的分离度为33.266；杂质G与杂质D的分离度为19.741。

在进一步与标准对照溶液通过外标法，以峰面积计算，或者根据峰面积与浓度之间的标准曲线计算，可以得到准确的福沙匹坦双葡甲胺样品中的杂质含量，如在本发明的标准曲线和线性范围实施例中检测得到：杂质A在0.0409μg/ml～2.0437μg/ml范围内，线性方程为y=43803.6818x+716.2411 (R=0.9996)，其峰面积与测定浓度呈良好的线性关系；杂质B在0.0410μg/ml～2.0486μg/ml范围内，线性方程为y=48310.1758x-97.6981 (R=1.0000)，其峰面积与测定浓度呈良好的线性关系；杂质C在0.0418μg/ml～2.0889μg/ml范围内，线性方程为y=120408.1584x+1266.6445 (R=0.9998)，其峰面积与测定浓度呈良好的线性关系；杂质D在0.0402μg/ml～2.0114μg/ml范围内，线性方程为y=35128.1845x+184.4510 (R=1.0000)，其峰面积与测定浓度呈良好的线性关系；杂质E在0.0398μg/ml～1.9891μg/ml范围内，线性方程为y=30822.6781x-422.0519(R=0.9996)，其峰面积与测定浓度呈良好的线性关系；杂质F在0.21μg/ml～10.5μg/ml范围内，线性方程为y=34192.4773x-1277.1516 (R=1.0000)，其峰面积与测定浓度呈良好的线性关系；证明本发明的杂质的含量的检测方法方法线性范围广，准确度高。

此外，本发明的福沙匹坦双葡甲胺及其杂质检测方法的专属性强，如在本发明的实施例1中显示，福沙匹坦双葡甲胺样品及福沙匹坦双葡甲胺样品中的其它杂质对杂质A、B、C、D、E、F、G的测定无干扰。

此外，本发明的福沙匹坦双葡甲胺及其杂质检测方法的精密度高，如在本发明的精密度实施例中显示，使用HPLC检测分析，杂质A峰面积的RSD为：1.78%，杂质B峰面积的RSD为：0.21%，杂质C峰面积的RSD为：0.11%，杂质D峰面积的RSD为：1.09%，杂质E峰面积的RSD为：0.45%，杂质F峰面积的RSD为：0.06%，证明本发明的检测方法精密度优异。

此外，本发明的灵敏度高，如在本发明的灵敏度实施例中显示，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E和杂质F的峰高均约为基线噪音的10倍，按信噪比S/N=10计，可得杂质A的定量限为0.4087ng，杂质B的定量限为0.4097ng，杂质C的定量限为0.1253ng，得杂质D的定量限为0.4023ng，杂质E的定量限为0.3978ng，杂质F的定量限为0.6300ng，证明本发明方法的检测灵敏度高，可以充分满足杂质定量测定的要求。

此外，本发明的可重复性良好，如在本发明的重复性实施例中显示，在多次检测中，福沙匹坦双葡甲胺杂质的含量数值基本保持一致。

此外，本发明的样品回收率高，检测结果准确、可靠，如在回收率实施例中显示，杂质A的回收率在93.37%～102.60%之间，相对标准偏差为2.65%；杂质B的回收率在99.17%～100.18%之间，相对标准偏差为0.32%；杂质C的回收率在99.85%～100.99%之间，相对标准偏差为0.59%；杂质D的回收率在101.31%～104.47%之间，相对标准偏差为1.00%；杂质E的回收率在98.96%～103.41%之间，相对标准偏差为1.31%；杂质F的回收率在101.68%～114.16%之间，相对标准偏差为4.05%；杂质G的回收率在95.34%～99.86%之间，相对标准偏差为1.74%；各有关物质在低、中、高三个浓度水平的回收率均在80%~120%之间，回收率高，准确度良好。

此外，本发明操作简便，容易控制，检测成本低。结合其具有的良好的线性关系、专属性、精密度、稳定性、灵敏度和重复性，极高的加样回收率，检测结果准确、可靠性，为监控福沙匹坦双葡甲胺药物中主药或/和杂质提供了行之有效的检测方法，进保证了福沙匹坦双葡甲胺的产品质量和患者的用药安全。

附图说明

图1为实施例1中杂质A的标准对照溶液的HPLC图；

图2为实施例1中杂质B的标准对照溶液的HPLC图；

图3为实施例1中杂质C的标准对照溶液的HPLC图；

图4为实施例1中杂质D的标准对照溶液的HPLC图；

图5为实施例1中杂质E的标准对照溶液的HPLC图；

图6为实施例1中杂质F的标准对照溶液的HPLC图；

图7为实施例1中杂质G的标准对照溶液的HPLC图；

图8为实施例1中福沙匹坦双葡甲胺样品溶液的HPLC图；

图9为实施例1中所述对比样品溶液的HPLC图；

图10为实施例2中所述福沙匹坦双葡甲胺配制样品溶液的HPLC图；

图11为对比实施例1中所述福沙匹坦双葡甲胺配制样品溶液中杂质C的HPLC图；

图12为实施例3-波长选择实施例中福沙匹坦双葡甲胺样品溶液的紫外光谱图；

图13为实施例4-标准曲线和线性范围实施例中杂质A的浓度-峰面积标准曲线图；

图14为实施例4中杂质B的浓度-峰面积标准曲线图；

图15为实施例4中杂质C的浓度-峰面积标准曲线图；

图16为实施例4中杂质D的浓度-峰面积标准曲线图；

图17为实施例4中杂质E的浓度-峰面积标准曲线图；

图18为实施例4中杂质F的浓度-峰面积标准曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

本发明中使用的杂质A~G对照品可以通过购买市售产品获得，或者通过现有技术制备得到。

以下全部实施例中所用杂质A~G的对照品均通过成都百裕科技制药有限公司获得，其中杂质A的对照品纯度为99.79%以上，杂质B的对照品纯度为98.68%以上，杂质C的对照品纯度为99.0%%以上，杂质D的对照品纯度为97.45%以上，杂质E的对照品纯度为99.06%以上，杂质F的对照品纯度为99.85 %以上，杂质G的对照品纯度为99.70%以上。

实施例1

使用以下步骤进行检测：

（1）分别取杂质A、B、C、D、E、F、G的对照品，将体积比为50:50的乙腈和水混合后作为溶剂溶解这些对照品，配制成每1mL含杂质各5μg的标准对照溶液；

（2）取福沙匹坦双葡甲胺样品，将体积比为50:50的乙腈和水混合后作为溶剂溶解该样品，配制成每1mL约含1.0mg该样品的样品溶液；

（3）取部分由步骤（2）配制得到的样品溶液，及部分由步骤（1）配制得到的杂质A、B、C、D、E、F、G的标准对照溶液，将两者混合均匀后得到对比样品溶液；

（4）将所得的标准对照溶液、样品溶液及对比样品溶液按以下条件进行HPLC检测，记录色谱图：

色谱柱：ACE C₁₈，4.6mm×250mm，5µm；

柱温：30℃；检测波长：215nm；

进样体积：20μL。

流动相：以磷酸调节pH至2.2的50mM磷酸二氢铵缓冲液作流动相A，乙腈为流动相B，流速：1.0ml/min；

按下表进行梯度洗脱：

梯度洗脱程序

所得色谱图如附图1~9所示。

其中附图1~7为实施例中杂质A~G的标准对照溶液的HPLC图，从HPLC图中可知杂质A的保留时间为3.942min；杂质B的保留时间为10.639min，杂质C的保留时间为14.993min，杂质D的保留时间为40.034min，杂质E的保留时间为23.590min，杂质F的保留时间为27.164min,杂质G的保留时间为34.540min。

附图8为实施例中福沙匹坦双葡甲胺样品溶液的HPLC图；其中福沙匹坦双葡甲胺主峰的保留时间为12.613min。

附图9为实施例中对比样品溶液的HPLC图，从图中可看出，对比样品溶液中福沙匹坦双葡甲胺的保留时间为13.246min，杂质A的保留时间为3.885min，杂质B的保留时间为11.139min，杂质C的保留时间为15.358min，杂质D的保留时间为40.800min，杂质E的保留时间为24.000min，杂质F的保留时间为27.651min，杂质G的保留时间为35.207min。

进一步计算可知，杂质A与杂质B的分离度为27.567；杂质B与福沙匹坦双葡甲胺的分离度为4.544；福沙匹坦双葡甲胺与杂质C的分离度为4.08；杂质C与杂质E的分离度为26.961；杂质E与杂质F的分离度为16.455；杂质F与杂质G的分离度为33.266；杂质G与杂质D的分离度为19.741。

由上述检测结果可知，在本实施例的检测条件下，福沙匹坦双葡甲胺与杂质之间的分离度高，可以实现对福沙匹坦双葡甲胺及多种杂质含量的同时检测。

同时附图1~9也显示了在本实施例的检测条件下，福沙匹坦双葡甲胺样品及福沙匹坦双葡甲胺中其余杂质对杂质A、B、C、D、E、F、G的测定无干扰，证明该检测方法的专属性强。

实施例2

使用以下步骤进行检测：

（1）取杂质A、B、C、D、E、F、G的对照品及福沙匹坦双葡甲胺样品，将体积比为50:50的乙腈和水混合后作为溶剂溶解，配制成每1mL约含杂质A、B、C、D、E、F、G 0.5mg、福沙匹坦双葡甲胺样品1.0mg的福沙匹坦双葡甲胺配制样品溶液；

（2）将所得福沙匹坦双葡甲胺配制样品溶液按以下条件进行HPLC检测，记录色谱图：

色谱柱：ACE C₁₈，4.6mm×250mm，5µm；

柱温：30℃；检测波长：215nm；

进样体积：20μL。

流动相：以磷酸调节pH至2.2的20mM磷酸二氢铵缓冲液作流动相A，乙腈为流动相B，流速：1.0ml/min；

按下表进行梯度洗脱：

梯度洗脱程序

所得色谱图如附图10所示。

附图10显示，其中福沙匹坦双葡甲胺的保留时间为13.964min，杂质A的保留时间为7.313min，杂质B的保留时间为10.341min，杂质C的保留时间为20.753min。杂质D的保留时间为40.041min。杂质E的保留时间为27.409min。杂质F的保留时间为30.667min。杂质G的保留时间为34.505min。

进一步计算可知杂质A与杂质B的分离度为3.155；杂质B与福沙匹坦双葡甲胺的分离度为7.477；福沙匹坦双葡甲胺与杂质C的分离度为10.137；杂质C与杂质E的分离度为12.464；杂质E与杂质F的分离度为7.176；杂质F与杂质G的分离度为8.480；杂质G与杂质D的分离度为13.246。

对比实施例1

使用以下步骤进行检测：

（1）取杂质A、B、C、D、E、F、G的对照品及福沙匹坦双葡甲胺样品，将体积比为50:50的乙腈和水混合后作为溶剂溶解，配制成每1mL约含杂质A、B、C、D、E、F、G 0.5mg、福沙匹坦双葡甲胺样品1.0mg的福沙匹坦双葡甲胺配制样品溶液；

（2）将所得福沙匹坦双葡甲胺配制样品溶液按以下条件进行HPLC检测，记录色谱图：

色谱柱：ACE C₁₈，4.6mm×250mm，5µm；

柱温：30℃；检测波长：215nm；

进样体积：20μL。

流动相：以体积比为80:20的缓冲盐溶液-乙腈作流动相A，其中缓冲盐溶液由1.96g磷酸、0.34g四丁基硫酸氢铵、1.0g磷酸二氢钾加水1000ml溶解制得；以同样的、但体积比为20:80缓冲盐溶液-乙腈为流动相B，流速：1.0ml/min；

按下表进行梯度洗脱：

梯度洗脱程序

附图11为该福沙匹坦双葡甲胺配制样品溶液中杂质C的HPLC谱图，从中可以看出杂质C的保留时间为15.565min，杂质C峰形拖尾严重。

进一步结合实施例1、2的比较，可以看出实施例2中杂质分离度稍差于实施例1，实施例1的色谱条件为更优选择。

实施例3 波长选择实施例

取福沙匹坦双葡甲胺样品，用溶剂溶解并稀释制成适宜浓度的溶液，按照紫外-可见分光光度法（中国药典2010年版二部附录IVA）在200～400nm范围内进行光谱扫描，得到如附图12所示的紫外光谱图，可知各杂质在264 ±3nm与末端区均有较大吸收，在264 ±3nm下各杂质吸收均较小，因此在末端区选择210nm与215nm进行进一步比较测试，并选出215nm作为最优波长采用。

以下实施例4~9 均采取如下的检测条件（以下简称统一检测条件）：

柱温：30℃；检测波长：215nm；

进样体积：20μL。

流动相：以磷酸调节pH至2.2的50mM磷酸二氢铵缓冲液作流动相A，乙腈为流动相B，流速：1.0ml/min；

按下表进行梯度洗脱：

梯度洗脱程序

实施例4 标准曲线和线性范围实施例

取杂质A、B、C、D、E、F、G的对照品，将体积比为50:50的乙腈和水混合后作为溶剂溶解，并混合，配制成不同浓度的混合标准对照品溶液，按统一检测条件进行HPLC检测，记录色谱图，并测定峰面积，得到如表1所示的检测结果：

表1

以混合标准对照溶液的浓度为横坐标X，以其峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得到如附图13~18所示的浓度-峰面积标准曲线，分别线性回归方程及相关系数r，可知：该实施例中杂质A在0.0409μg/ml～2.0437μg/ml范围内，线性方程为y=43803.6818x+716.2411 (R=0.9996)，其峰面积与测定浓度呈良好的线性关系；杂质B在0.0410μg/ml～2.0486μg/ml范围内，线性方程为y=48310.1758x-97.6981 (R=1.0000)，其峰面积与测定浓度呈良好的线性关系；杂质C在0.0418μg/ml～2.0889μg/ml范围内，线性方程为y=120408.1584x+1266.6445 (R=0.9998)，其峰面积与测定浓度呈良好的线性关系；杂质D在0.0402μg/ml～2.0114μg/ml范围内，线性方程为y=35128.1845x+184.4510 (R=1.0000)，其峰面积与测定浓度呈良好的线性关系；杂质E在0.0398μg/ml～1.9891μg/ml范围内，线性方程为y=30822.6781x-422.0519(R=0.9996)，其峰面积与测定浓度呈良好的线性关系；杂质F在0.21μg/ml～10.5μg/ml范围内，线性方程为y=34192.4773x-1277.1516 (R=1.0000)，其峰面积与测定浓度呈良好的线性关系。

以上证明本发明的检测方法线性范围广，准确度高。

此外，从附图的标准曲线方程中可以看出，各曲线斜率远远大于截距，曲线端点接近原点，说明各杂质的含量测定适合于本发明的外标一点法。

实施例5 精密度实施例

取对照品溶液，注入高效液相色谱仪中，连续进样6次，每次20µL，按统一检测条件检测，并分别测定峰面积，得到如表2所示的检测数据：

表2

进一步计算得到杂质A峰面积的RSD为：1.78%，杂质B峰面积的RSD为：0.21%，杂质C峰面积的RSD为：0.11%，杂质D峰面积的RSD为：1.09%，杂质E峰面积的RSD为：0.45%，杂质F峰面积的RSD为：0.06%，证明该检测方法精密度优异。

实施例6 定量限实施例

取对照品溶液，加入流动相进行稀释，精密量取20μL注入高效液相色谱仪中，按统一检测条件检测，并测定峰面积及基线噪音，得到如表3所示的检测数据：

表3

实施例7重复性实施例

（1）分别取杂质A、B、C、D、E、F、G的对照品，将体积比为50:50的乙腈和水混合后作为溶剂溶解这些对照品，配制成每1mL含杂质各5μg的标准对照溶液；

（2）精密称取福沙匹坦双葡甲胺样品6份，各约10mg，分别置10mL量瓶中，将体积比为50:50的乙腈和水混合后作为溶剂，加溶剂溶解并稀释至刻度，得到样品溶液；

（3）精密量取上述6份样品溶液、标准对照溶液各20μL，按统一检测条件检测，记录色谱图，并测定峰面积；

（4）根据标准曲线，使用外标法以峰面积计算杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E和杂质F的含量，检测结果如表4所示：

表4

由上述结果可知，该检测方法的重复性良好。

实施例8 回收率实施例

平行称取福沙匹坦双葡甲胺样品9份，每3份分别按照80%、100%、120%的质量百分比加入混合杂质A~G的对照溶液，制得测试样品溶液，所述对照溶液由杂质A~G对照品溶于体积比为50:50的乙腈和水混合液制得，将所述测试样品溶液按统一检测条件检测，记录色谱图，根据标准曲线，使用外标法以峰面积计算杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G的测得量，并根据以下公式计算回收率：

其中：a为福沙匹坦双葡甲胺样品中所含杂质的量（mg）；

b为杂质对照品的加入量（mg）；

c为杂质的测得量（mg）；

得到如表5~11所示的检测结果：

表5

该结果显示本检测方法测定的福沙匹坦双葡甲胺中的杂质A的回收率在93.37%～102.60%之间，相对标准偏差为2.65%，回收率好，准确度高。

表6

该结果显示本检测方法测定的福沙匹坦双葡甲胺中的杂质B的回收率在99.17%～100.18%之间，相对标准偏差为0.32%，回收率好，准确度高。

表7

该结果显示本检测方法测定的福沙匹坦双葡甲胺中的杂质C的回收率在99.85%～100.99%之间，相对标准偏差为0.59%，回收率好，准确度高。

表8

该结果显示本检测方法测定的福沙匹坦双葡甲胺中的杂质D的回收率在101.31%～104.47%之间，相对标准偏差为1.00%，回收率好，准确度高。

表9

该结果显示本检测方法测定的福沙匹坦双葡甲胺中的杂质E的回收率在98.96%～103.41%之间，相对标准偏差为1.31%，回收率好，准确度高。

表10

该结果显示本检测方法测定的福沙匹坦双葡甲胺中的杂质F的回收率在101.68%～114.16%之间，相对标准偏差为4.05%，回收率好，准确度高。

表11

该结果显示本检测方法测定的福沙匹坦双葡甲胺中的杂质G的回收率在95.34%～99.86%之间，相对标准偏差为1.74%，回收率好，准确度高。

上述结果表明，各有关物质低、中、高三个浓度水平的回收率均在80%~120%之间，方法准确度良好。

实施例9溶液稳定性实施例

精密称取福沙匹坦双葡甲胺样品10.0mg，置于10mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，溶剂为体积比为50:50的乙腈和水混合液，得到样品溶液，分别于配制后0h、1h、2h、4h、6h、8h、10h和12h进样20μL，按统一检测条件检测，并记录色谱图，考察测得的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E和杂质F的稳定性情况，以其中杂质F为例，结果如表12所示：

表12

从上述数据可知，从上面数据可知，在12小时内供试品溶液中杂质F随着时间延长而增加、单个杂质及总杂质几乎无变化，杂质个数并未增加，可知供试品溶液在配制后12小时内不稳定，建议临用新配。

综上所述，本发明提供了一种福沙匹坦双葡甲胺原料或制剂及其杂质的检测方法，操作简便，容易控制，检测成本低，具有的良好的线性关系、专属性、精密度、稳定性、灵敏度和重复性，极高的加样回收率，检测结果准确、可靠。