本发明涉及一种以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，属于大分子检测领域。
背景技术：
甲壳素(Chitin)又名几丁质，化学名称为(1，4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡聚糖，它广泛存在于低等植物菌类细胞壁、虾、蟹、昆虫等甲壳动物的外壳中。甲壳素经浓碱处理脱去其中的乙酰基就变成可溶性甲壳素，又称壳聚糖(Chitosan)，其化学名称为(1，4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖胺，是自然界中存在的唯一的碱性多糖，可溶于醋酸等无机酸的稀溶液中。壳聚糖及其衍生物一般不与体液或者体内组织发生免疫反应，性质比较稳定，具有良好的生物相容性和生物降解性，同时具有止血、抑菌、抗肿瘤，抗凝血，减肥降脂和增强免疫力等功能。因此，壳聚糖在纺织工业、生物医学、日用环保等领域都有着广阔的应用前景。
随着壳聚糖在食品领域的广泛应用，市面上的壳聚糖保健品参差不齐，配方不一，壳聚糖所占的含量直接影响到其功能的发挥，因此，壳聚糖的准确定量显得十分重要。目前，国内外用于壳聚糖定量分析的方法有分光光度法、高效液相色谱法、电化学法、荧光猝灭法，还有利用阴离子表面活性剂、阴离子染料、金属离子等作为探针的共振瑞利散射法(RRS)等。
共振瑞利散射法应用于壳聚糖定量分析的研究比较少，它是近年来发展起来的一项简便、快速、灵敏的分析技术。虽然目前国内外壳聚糖含量的测定方法很多，但开发出更简便、快速、灵敏度更高的测定壳聚糖含量的新方法成为一种趋势。基于此，本发明提供一种以活性红4为探针运用共振瑞利散射技术测定壳聚糖含量的方法。
技术实现要素：
为了克服现有技术中对于成品中壳聚糖的含量难以定量，操作技术繁琐的技术不足，本发明提供一种通过十二烷基硫酸钠增敏的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，本发明利用弱酸环境下，活性红4与壳聚糖分子结合形成的缔合物呈电中性，在此基础上加入十二烷基硫酸钠形成三元缔合物，缔合物体积增大，且疏水性大大提高，可导致在结合产物与水之间形成界面而产生一种表面增强的散射效应，从而使共振瑞利散射强度响应值有明显的提升。且在一定浓度范围内，共振瑞利散射强度与壳聚糖含量在一定的浓度范围内呈线性关系，以此作为壳聚糖的定量基础，建立了测定壳聚糖的共振瑞利散射法。本方法测定受壳聚糖的分子量和脱乙酰度的影响，具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作简便等优点。
一种以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：
1)绘制△I和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线
向10mL比色管中加入1.0mL一定浓度梯度的壳聚糖标准溶液，1.0mL缓冲溶液，2.0mL浓度为1.72×10-3mol/L的十二烷基硫酸钠溶液，以及1.0mL浓度为2.00×10-5mol/L的活性红4溶液，使用三次蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀，将其置于室温室温10min，取1ml混合溶液加入石英比色皿，于F-2500型荧光分光光度计上，以λex＝λem进行同步扫描，分别记录含壳聚糖的各检测体系在最大共振瑞利散射波长λ＝370nm处体系的共振散射强度值I，其中试剂空白在λ＝370nm处体系的共振散射强度值I0，并计算ΔI＝I-I0，建立ΔI与低分子壳聚糖浓度的标准曲线C1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔI与中分子壳聚糖浓度的标准曲线C2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔI与高分子壳聚糖浓度的标准曲线C3；
在最佳的实验条件下，考察该体系对不同分子量的壳聚糖的测定结果。分别考察了低分子量、中分子量和高分子量的壳聚糖。经过统计学分析，不同分子量的壳聚糖结果存在显著差异性，该方法测定壳聚糖含量受不同分子量的影响。
2)10μg/mL的样品工作液的制备：将壳聚糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液。
3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)中检测方法绘制ΔI和样品工作液的标准曲线，并将其与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的ΔI和样品工作液的标准曲线的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的回归方程；
4)样品中壳聚糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)检测方法进行测定，在λ＝370nm处测定其共振散射强度值I，并计算ΔI＝I-I0，将ΔI代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。
如上所述的以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，所述缓冲液为B-R缓冲溶液、HAc-NaAc缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液中的一种；申请人通过实验发现，缓冲溶液的酸度对该反应体系有着显著的影响，在pH＝5.5时散射值较大；并且体系在柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中灵敏度最高，散射值最大，故最佳缓冲溶液选择为pH＝5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。
如上所述的以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，步骤1中试剂的加入顺序为首先加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，其次加入壳聚糖溶液，再次加入活性红4溶液，最后加入十二烷基硫酸钠溶液。
如上所述的以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，步骤1)中壳聚糖的浓度范围0.005-2.50μg/mL。
样品前处理：将壳聚糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液。
取样品工作液1mL，按实验方法进行测定，在370nm处测定其共振瑞利散射强度值I，并计算ΔI＝I-I0，将ΔI代入线性回归方程，求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。
试验例：
1.十二烷基硫酸钠-活性红4-壳聚糖体系的共振瑞利散射图谱
图1为体系的共振散射光谱图。如图1，从下至上1为十二烷基硫酸钠-活性红4；2-6为十二烷基硫酸钠-活性红4-壳聚糖(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5μg/mL)复合物。由图1可知，未加入壳聚糖的十二烷基硫酸钠-活性红4本身的共振散射非常弱，但是与壳聚糖结合后共振瑞利散射明显增强，这也由于在弱酸环境下，壳聚糖的氨基阳离子与活性红4形成缔合物时呈电中性，在此基础上加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠，形成三元离子缔合物，缔合物体积增大，且疏水性大大提高，可导致在结合产物与水之间形成界面而产生一种表面增强的散射效应，有利于RRS增强，在370nm处呈特征性共振瑞利散射峰。此共振瑞利散射强度与壳聚糖浓度呈线性相关。因此，后续实验选择该波长作为测定波长。
2.不同表面活性剂对于体系共振瑞利散射强度的影响
实验分别考察了溴化十六烷基、十二烷基硫酸钠、吐温20、吐温80、OP以及聚乙烯醇这六种表面活性剂对共振瑞利散射强度ΔIRRS的影响，结果(见图2)可看出十二烷基硫酸钠对活性红4-壳聚糖二元体系具有增敏效果，故实验采用十二烷基硫酸钠作为增敏剂。
3.十二烷基硫酸钠加入量对于体系共振瑞利散射强度的影响
已知十二烷基硫酸钠的临界胶束浓度为0.0086mol/L，其形成胶束的温度条件是40℃，本实验在临界胶束条件下考察十二烷基硫酸钠加入量在0-1.0mL之间对本体系共振瑞利散射强度ΔIRRS的影响，实验结果(见图3)，当十二烷基硫酸钠加入量为0.2mL时的ΔIRRS达到最高，随加入量的增大ΔIRRS呈下降趋势。该浓度下，体系形成三元缔合物。故后续实验选择的十二烷基硫酸钠加入量为0.2mL，浓度即为1.72×10-3mol/L。
4.缓冲溶液及pH对于体系共振瑞利散射强度的影响
在实验条件下分别考察了B-R缓冲溶液、HAc-NaAc缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲溶液四种缓冲溶液对共振瑞利散射强度ΔIRRS的影响，发现在B-R和柠檬酸-柠檬酸钠两种缓冲溶液体系中，共振瑞利散射强度差值ΔI较高并且差距不大(见图4-1)，但是由于B-R体系空白值很高，柠檬酸-柠檬酸钠空白值相对低得多，故后续实验选择柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。在pH 3.5-6.5之间，采用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液考察pH对共振瑞利散射强度ΔIRRS的影响，在pH值为5.5时ΔI达到最大值(见图4-2)。故最终最佳酸度条件确定在pH＝5.5处。
5.缓冲溶液用量对于体系共振瑞利散射强度的影响
在实验条件下考察了pH＝5.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液加入量对共振瑞利散射强度的影响。结果显示(见图5)当柠檬酸-柠檬酸钠加入1.0mL时，体系的共振瑞利散射强度差值ΔI最大。
6.活性红4浓度对于体系共振瑞利散射强度的影响
在实验条件下考察了活性红4浓度对共振瑞利散射强度IRRS的影响。实验结果表明(见图6)，当活性红4溶液加入量为2.00×10-5mol/L(即为1.0mL)时，体系共振瑞利散射强度差值ΔI最大。故本实验中选用活性红4浓度为2.00×10-5mol/L。
7.反应温度的对于体系共振瑞利散射强度的影响
实验考察了温度在20℃(常温)，40℃，60℃，80℃，100℃情况下对共振瑞利散射强度的影响(见图7)，结果表明温度对体系的共振瑞利散射强度影响不大，故后续实验选择在常温下进行。
8.试剂加入顺序对于体系共振瑞利散射强度的影响
实验考察了十二种试剂加入顺序(见表1)对结果的影响。当试剂加入顺序为：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、壳聚糖、活性红4、十二烷基硫酸钠(即第7组)时，体系比较稳定并且共振瑞利散射强度差值ΔI最大(见图8)，故将以上试剂加入顺序作为本实验的最佳加入顺序。
表1试剂加入顺序
9.稳定时间对于体系共振瑞利散射强度的影响
实验考察了240min内体系的稳定性，实验表明(见图9)，在5-150min内体系共振瑞利散射强度差值ΔIRRS基本恒定，之后，随着反应时间延长，ΔIRRS稍有上升并且重现性变差。
10.不同脱乙酰度的壳聚糖结果比较
在最佳的实验条件下，考察该体系对不同脱乙酰度的壳聚糖的测定结果差异。分别考察了脱乙酰度为85％，90％和95％分子量为60的壳聚糖。见图10，可初步推断，以十二烷基硫酸钠增敏的活性红4为探针的共振瑞利散射法受到壳聚糖脱乙酰度的影响。
11.离子强度对于体系共振瑞利散射强度的影响
在实验条件下考察浓度分别为0、0.001、0.003、0.005、0.007、0.01、0.03、0.05、0.07、0.10、0.30mol/LNaCl溶液对体系的影响(见图11)。
由图可知，NaCl浓度在小于0.05mol/L时，共振瑞利散射强度基本保持稳定，当NaCl浓度大于0.05mol/L，共振散射强度逐渐下降。所以，在实际测定壳聚糖样品时，应控制NaCl浓度在0.05mol/L以内。
12.共存物质的干扰
目前，市场上含有CTS的常见保健品如甲壳素胶囊，其主要辅料成分有葡萄糖、抗坏血酸、淀粉和糊精等。
共振瑞利散射法于壳聚糖质量浓度为1.00μg/mL的溶液中，加入试样中可能存在的共存物质，进行干扰试验测定，与未加干扰物质的壳聚糖标准液测定结果相对照，计算产生约±5％相对误差时加入各共存物质的浓度(见表2)。
表2共存物质干扰试验结果
结果表明，甲壳素胶囊中可能的共存物质如抗坏血酸、葡萄糖、β-环糊精、各氨基酸及钾、钠等微量元素对测定结果干扰较小，部分金属离子如Ca2+、Fe3+对壳聚糖的测定影响较大，可以通过在样品中加入1.0mL的10mg/mL维生素C和4％酒石酸掩蔽剂来消除金属离子的干扰，Ca2+、Fe3+浓度分别在5μg/mL、10μg/mL以内时，酒石酸的抗干扰能力较好。
本发明与现有技术相比具有如下技术优势：
1)线性好、检出限低：在最佳实验条件下，按照实验方法测定不同浓度的壳聚糖对应的ΔI，绘制标准曲线，结果表明，壳聚糖在浓度0.005-2.50μg/mL范围内与ΔI存在良好的线性关系，线性范围宽，检出限为0.0250μg/mL。
2)本方法测定受壳聚糖的分子量和脱乙酰度的影响，在实际样品测定中，需考虑采用相近分子量和脱乙酰度的标准品做定量标准，具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好和操作简便等优点。
附图说明
图1活性红4-SDS-壳聚糖体系的共振瑞利散射图谱。
图2不同表面活性剂对体系共振瑞利散射强度的影响图。
图3十二烷基硫酸钠加入量对体系共振瑞利散射强度的影响图。
图4不同缓冲溶液对体系共振瑞利散射强度的影响图。
图5缓冲溶液pH对体系共振瑞利散射强度影响图。
图6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液加入量对体系共振瑞利散射强度影响图。
图7活性红4浓度对体系共振瑞利散射强度影响图。
图8反应温度对体系共振瑞利散射强度影响图。
图9试剂加入顺序对体系共振瑞利散射强度影响图。
图10稳定时间对体系共振瑞利散射强度影响图。
图11壳聚糖脱乙酰度对体系共振瑞利散射强度影响图。
图12离子强度对体系共振瑞利散射强度影响图。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述发明并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。
实施例
一种以活性红4为探针的共振瑞利散射法测定壳聚糖含量的方法，其包括下述步骤：
1)绘制ΔI和不同分子量的壳聚糖浓度的标准曲线
向10mL比色管中加入1.0mL一定浓度梯度的壳聚糖标准溶液，1.0mLpH＝5.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，2.0mL浓度为1.72×10-3mol/L的十二烷基硫酸钠溶液，以及1.0mL浓度为2.00×10-5mol/L的活性红4溶液，使用三次蒸馏水定容至刻度，并充分摇匀，将其置于室温10min，取1ml混合溶液加入石英比色皿，于F-2500型荧光分光光度计上，以λex＝λem进行同步扫描，分别记录含壳聚糖的各检测体系在最大共振瑞利散射波长λ＝370nm处体系的共振散射强度值I，其中试剂空白在λ＝370nm处体系的共振散射强度值I0，并计算ΔI＝I-I0，建立ΔI与低分子壳聚糖浓度的标准曲线C1；使用中分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔI与中分子壳聚糖浓度的标准曲线C2；使用高分子量壳聚糖溶液替换低分子壳聚糖溶液，建立ΔI与高分子壳聚糖浓度的标准曲线C3；
表3不同分子量的壳聚糖结果
2)10μg/mL的样品工作液的制备：将壳聚糖胶囊去胶囊壳，称取0.04g于100mL容量瓶中，用0.5mol/L冰醋酸溶解，定容得样品储备液。用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经6000r/min，离心机离心20min，取上清液2.5mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为10μg/mL的样品工作液。
3)根据壳聚糖分子量选择标准曲线：使用步骤1)中检测方法绘制ΔI和样品工作液的标准曲线，并将其与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，根据样品的ΔI和样品工作液的标准曲线的回归方程确定样品中的壳聚糖的分子量的大小，根据所对应的壳聚糖的分子量的大小确定所使用的回归方程；
用样品工作液按实验方法绘制样品曲线，与不同分子量的壳聚糖标准曲线比较，结果为样品的线性回归方程是ΔI＝612.74c+72.67，相关系数0.9975，结果与高分子量的壳聚糖标准曲线接近，采用高分子量壳聚糖的标准曲线作为定量标准曲线。
4)样品中壳聚糖含量确定：取样品工作液1mL，按步骤1)检测方法进行测定，在λ＝370nm处测定其共振散射强度值I，并计算ΔI＝I-I0，将ΔI代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。
取样品工作液1mL，按实验方法进行测定，在370nm处测定其散射值I，并计算ΔI＝I-I0，将ΔI代入线性回归方程求得样品中壳聚糖的含量，同时做加标回收试验。结果为：澳利维壳聚糖胶囊中壳聚糖的含量为938.37mg/g，RSD为1.99％。加标回收率见表4。
表4加标回收率
线性关系与检出限
在最佳的实验条件下，按照实验方法测定不同浓度的壳聚糖对应的ΔI，绘制标准曲线，结果表明，在0.005-2.50μg/mL的浓度范围内，线性方程为：ΔI＝612.74c+72.67(c，μg/mL)，R2＝0.9975，检出限为0.0250μg/mL。