本发明涉及一种基于核酸适配体检测三聚氰胺的生物传感器，具体涉及一种基于目标诱导的核酸适配体构象变化及λ-核酸外切酶辅助循环放大检测三聚氰胺的电化学生物传感器，属于电化学生物传感器技术领域。
背景技术：
三聚氰胺（Me）俗称蛋白精，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。婴儿食用Me含量超标的奶粉会造成肾结石。国际上为牛奶中Me含量设定了新标准，每公斤液态牛奶中Me含量不得超过0.15mg。目前报道的检测Me的方法包括高效液相色谱法，毛细管电泳法，表面等离子体共振方法和荧光共振方法。这些方法有检测成本高，仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺点，因此，建立一个操作简便、灵敏的高特异性的方法，在食品安全分析中检测Me是至关重要的。
技术实现要素：
为了解决以上现有技术中检测三聚氰胺的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本发明提供了一种操作简便、特异性和灵敏度高、成本低的基于目标物诱导的核酸适配体构象变化及λ-核酸外切酶辅助循环放大检测三聚氰胺的电化学生物传感器。
本发明另一目的在于提供一种上述电化学生物传感器的制备方法和在检测三聚氰胺中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种检测三聚氰胺的电化学生物传感器，包括：
Aptamer（适体），Primer（引物），HAP1（发卡引物1），血红素，钾离子（K+），过氧化氢（H2O2），λ-核酸外切酶和修饰HAP2（发卡引物2）的金电极；
所述Aptamer的序列如SEQ No.1所示；
Primer的序列如SEQ No.2所示；
HAP1的序列如SEQ No.3所示，其5’端修饰磷酸根（PO42-）；
HAP2的序列如SEQ No.4所示，其5’端修饰磷酸根（PO42-），3’端修饰巯基（-SH）。
所述电化学生物传感器还包括含钾离子（K+）的缓冲液，所述缓冲液pH为7.0-7.6。上述缓冲液优选为磷酸盐缓冲液（PB）或者磷酸缓冲生理盐水（PBS）。
所述修饰HAP2的金电极采用以下方法制备获得：
a）金电极抛光处理；
b）将HAP2溶液滴在上述处理后的金电极表面，保温孵育。
所述抛光处理为将金电极依次在0.3 µm和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光至镜面，ddH2O反复冲洗。
可选地，所述HAP2浓度为1-20 μM，优选为1-10 μM，最优选为10 μM。
所述孵育温度为37 ℃，孵育时间为2 h。
所述Aptamer优选的终浓度为1µM。
所述Primer优选的终浓度为1µM。
所述HAP1的终浓度为1-20µM，优选为10-20µM，最优选为10µM。
所述血红素优选的终浓度为5µM。
所述K+优选的终浓度为10µM。
所述H2O2优选的终浓度为10μM。
所述λ-核酸外切酶优选的浓度为500U/mL。
一种利用上述电化学生物传感器检测三聚氰胺的方法，包括以下步骤：
（1）将Aptamer与Primer在缓冲液中杂交成探针（Probe）；
（2）将探针、HAP1、10×的λ-核酸外切酶缓冲液、λ-核酸外切酶和待测液或系列浓度的三聚氰胺标准溶液混合后恒温孵育；
（3）将步骤（2）中的混合溶液与λ-核酸外切酶一同滴加到修饰HAP2的金电极上，然后恒温孵育；
（4）将血红素溶液滴加到步骤（3）所得的溶液中，然后恒温孵育；
（5）以缓冲溶液漂洗步骤（4）中的电极；
（6）在含H2O2的缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电信号变化；
（7）根据三聚氰胺标准溶液的电信号作标准曲线，计算回归方程，根据回归方程与待测液电信号计算待测液中三聚氰胺的浓度。
所述杂交过程为Aptamer与Primer在缓冲液95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温。
所述方法中恒温温度为37℃。
所述步骤（6）中优选的参数为：电位0到-0.6 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 s。
所述待测液的三聚氰胺浓度优选为0.78 pM-10 nM，更优选为1 pM-10 nM。
上述电化学生物传感器的工作原理如下：
Aptamer是一段富含胸腺嘧啶T的序列能够与Primer结合成拱形探针（Probe）。当目标物存在时，aptamer能够与三聚氰胺通过“胸腺嘧啶-三聚氰胺-胸腺嘧啶”特异性结合，并释放出Primer，Primer与HAP1碱基互补，形成平末端的双链结构以便λ-核酸外切酶切割，释放出Primer和P2（SEQ No.5：5’-AACGACTTGAGGGTAGCATC-3’）。HAP2自身可形成发夹结构并且3’端修饰-SH，通过Au-S共价键将HAP2固定在金电极表面，P2与HAP2结合后形成5’平末端的双链结构，在λ-核酸外切酶的作用下将与P2互补的HAP2的一段序列消化，释放出P2，实现了P2的循环；剩余的HAP2是富含G的序列能够在K+和血红素存在的条件下折叠形成G-四联体，可催化H2O2发生氧化还原反应，从而产生电信号变化，在一定范围内，电信号与H2O2呈线性正相关，通过测量电化学信号来间接定量检测三聚氰胺。
本发明具有以下优点：
本发明的电化学生物传感器利用了“T-Me-T”的特异型识别，实现了对目标物三聚氰胺的高特异性检测；利用具有识别切割功能的λ-核酸外切酶，实现了primer的循环利用，放大了检测信号，提高了检测的灵敏度；利用了λ-核酸外切酶的特异性的识别和切割作用实现了第二步循环放大，降低了操作的复杂性，进一步提高了检测的灵敏度；该传感器的反应条件温和，反应速度快；由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中三聚氰胺的检测和生物传感器产业化的实际应用；制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。
附图说明
图1为本电化学生物传感器的工作原理示意图；
图2为修饰不同浓度HAP2的金电极测定的电信号曲线图；
图3为不同浓度HAP1测定的电信号曲线图；
图4为系列三聚氰胺标准溶液的电信号图；
图5为测定三聚氰胺的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例中，10×的λ-核酸外切酶缓冲液中含67mM Glycine-KOH，2.5mM MgCl2，50 mM BSA，pH为9.4。
PBS缓冲液含Na2HPO4 (10 mM)，NaH2PO4 (10 mM)，NaCl (140 mM)，KCl (1 mM)，MgCl2 (1 mM)，CaCl2 (1 mM)，pH值为7.4。
实施例1 修饰HAP2的金电极的制备。
a）金电极抛光处理：将金电极依次在0.3 µm和0.05 µm的氧化铝浆中进行抛光至镜面，H2O反复冲洗5次；
b）将10 μL HAP2溶液（终浓度为1 μM，2 μM，5 μM，10 μM，15 μM，20 μM）滴在上述处理后的金电极表面，37 ℃恒温孵育2h，得修饰HAP2的金电极S1-S6。
实施例2 不同HAP2浓度对检测三聚氰胺的影响。
（1）将Aptamer（10 μM）与Primer（10 μM）在PBS缓冲液中95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温，杂交成Probe（10 μM）；
（2）将步骤（1）中的探针、HAP1（10 μM）、10×的λ-核酸外切酶缓冲液、λ-核酸外切酶和三聚氰胺溶液（10000pM）混合后37 ℃恒温孵育2h；
（3）将步骤（2）中的混合溶液与λ-核酸外切酶一同滴加到修饰不同浓度HAP2的金电极S1-S6上，然后37 ℃恒温孵育2h；
（4）将10 μL血红素溶液（10 μM）滴加到步骤（3）所得的溶液中，然后37 ℃恒温孵育1h；
（5）以PBS缓冲溶液漂洗步骤（4）中的电极3次；
（6）在含H2O2（10 μM）的PBS缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电流变化，电位0到-0.6 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 s。
以HAP2浓度为横坐标，以电流值为纵坐标，作修饰不同浓度HAP2的金电极测定的电信号曲线图，如图2所示。由图2可知，检测到的电流信号随着HAP2的浓度在0-10 μM区间内增大而增大，当浓度超过10 μM后，电流趋于稳定。
实施例3 不同HAP1浓度对检测三聚氰胺的影响。
（1）将Aptamer（10 μM）与Primer（10 μM）在PBS缓冲液中95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温，杂交成Probe（10 μM）；
（2）将步骤（1）中的探针、HAP1（终浓度为1 μM，2 μM，5 μM，10 μM，15 μM，20 μM）、10×的λ-核酸外切酶缓冲液、λ-核酸外切酶和三聚氰胺溶液（10000pM）混合后37 ℃恒温孵育2h；
（3）将步骤（2）中的混合溶液与λ-核酸外切酶一同滴加到修饰HAP2的金电极S4上，然后37 ℃恒温孵育2h；
（4）将10 μL血红素溶液（10 μM）滴加到步骤（3）所得的溶液中，然后37 ℃恒温孵育1h；
（5）以PBS缓冲溶液漂洗步骤（4）中的电极3次；
（6）在含H2O2（10 μM）的PBS缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电流变化，电位0到-0.6 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 s。
以HAP1浓度为横坐标，以电流值为纵坐标，作修饰不同浓度HAP1的金电极测定的电信号曲线图，如图3所示。由图3可知，检测到的电流信号随着HAP1的浓度在0-10 μM区间内增大而增大，当浓度超过10 μM后，电流趋于稳定。
实施例3 对三聚氰胺的检测
（1）将Aptamer（10 μM）与Primer（10 μM）在PBS缓冲液中95℃下孵育5min，缓慢冷却至室温，杂交成Probe（10 μM）；
（2）将步骤（1）中的探针、HAP1（10 μM）、10×的λ-核酸外切酶缓冲液、λ-核酸外切酶和三聚氰胺溶液（终浓度为1、5、10、100、500、1000、5000、10000 pM）或待测液混合后37 ℃恒温孵育2h；
（3）将步骤（2）中的混合溶液与λ-核酸外切酶一同滴加到修饰HAP2的金电极S4上，然后37 ℃恒温孵育2h；
（4）将10 μL血红素溶液（10 μM）滴加到步骤（3）所得的溶液中，然后37 ℃恒温孵育1h；
（5）以PBS缓冲溶液漂洗步骤（4）中的电极3次；
（6）在含H2O2（10 μM）的PBS缓冲溶液中，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法测量电流变化，电位0到-0.6 V，脉冲宽度0.05 V，扫描速率0.06 s；
（7）根据三聚氰胺标准溶液的电信号作标准曲线，如图4所示，计算回归方程为y=0.47116+0.43513x，相关系数为0.98897；根据回归方程与待测液电信号计算待测液中三聚氰胺的浓度为19pM。
同时，我们在1 pM的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于1 pM时，电流与浓度的关系恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的电流最低点因此可得到该方法的检测下限为0.78 pM。
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