本发明涉及天然化合物分析领域，特别涉及一种芍药属油用植物油脂中酚类化合物的分析方法。
背景技术：
酚类化合物是一类广泛存在于植物体内的多酚类物质，是植物体内一种重要的次生代谢产物，其分子结构中含有若干个酚性羟基基团，根据结构特征主要分为酚酸类、黄酮类、单宁类、黄烷醇类以及苷类等。研究表明，植物酚类成分是一种天然抗氧化剂，能清除人体内的no和ros自由基，并且可对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用；此外，它还能够抑制氧化酶活性，激活抗氧化酶体系，具有明显的抗氧化效果。
芍药属油用植物油脂中含有丰富的酚类化合物，具有较高的营养价值及药用价值。然而，芍药属植物油品种繁多，对其酚类化合物的组成研究尚处在起步阶段，未见相关报道。若能精确的分析芍药属植物油中酚类化合物的特征组分及其含量，对其加工资源综合开发利用具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明提供了一种芍药属油用植物油脂中酚类化合物的分析方法，通过精确的定性定量研究深入分析了芍药属油用植物油脂中酚类化合物的组成情况。
本发明的技术方案为：
一种芍药属油用植物油脂中酚类化合物的分析方法，包括以下步骤：
1)收集芍药属及相关植物中酚类化合物的名称、cas号、化学式及相对分子质量信息，构建数据库；所述数据库包括酚酸类化合物、黄酮类化合物、单萜苷类化合物、酚苷类化合物以及茋类化合物；
2)从待分析芍药属油用植物油脂中提取酚类化合物，溶解于甲醇水溶液中制得提取液；
3)通过超高效液相色谱-质谱联用仪于负离子模式下得到所述提取液的总离子流色谱图，通过定性软件结合所述数据库检索得到提取液中含有的与数据库中精确分子量一致的目标色谱峰，然后利用q-tof-ms质谱分析器于负离子模式下选择目标色谱峰对应的分子离子进行二级质谱分析，根据碎片离子信息推断提取液所含的酚类化合物；其中
色谱条件为：色谱柱zorbaxeclipseplusc18，柱温30℃，流动相a含0.1％体积分数甲酸的水溶液，流动相b含0.1％体积分数甲酸的乙腈，流速0.4ml/min，梯度洗脱程序：0-3min，流动相a95％-90％；3-4min，流动相a90％-80％；4-8min，流动相a80％-45％；8-10min，流动相a45％-10％；平衡时间3min，进样量2μl；质谱条件为：离子源esi，离子采集范围100～1000m/z，毛细管电压4000v，碎片电压140v，干燥气9l/min高纯n2，鞘气流速10l/min，喷雾气电压30psig；
4)将定性得到的酚类化合物进行分类归属，将具有每一类化合物母环结构的标准品配制成不同浓度梯度的对照品溶液，于上述色谱-质谱条件下，对系列梯度浓度对照品进行测定，以各个峰的色谱峰面积对分析物浓度作线性回归得到标准曲线，利用标准曲线对分类后的每一类化合物分别定量。
可选的，步骤2)中，所述提取液的制备方法为：称取芍药属油用植物油脂油样于离心管中，加入正己烷，振荡溶解油样后，再加入60％体积分数的甲醇水溶液，混匀并充分振荡2～5min，然后在2000～4000rpm转速下离心10～20min，收集下层甲醇相澄清液，重复以上步骤提取三次，收集三次提取液于38℃下旋蒸浓缩至干，最后用50％体积分数的甲醇水溶液再次溶解，溶解液过0.22μm有机滤膜后，密封冷藏备用。
可选的，所述油样:正己烷:60％甲醇水溶液:50％甲醇水溶液的比例为1g:1.5～2.5ml:2～3ml:50～150μl。
可选的，步骤4)中，所述标准品包括苯甲酸、肉桂酸、对羟基苯乙酸、柚皮素、芍药苷、丹皮酚和氧化白藜芦醇。
可选的，步骤4)中，所述对照品溶液的制备方法为：将所述标准品分别溶解于甲醇中配制成单一标准品成分的储备溶液，于-20℃下密封保存，通过稀释所述储备溶液得到不同浓度梯度的对照品溶液；所述储备溶液中标准品和甲醇的比例为1mg:1ml。
可选的，所述酚酸类化合物包括苯甲酸、绿原酸、没食子酸、芥子酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸、对羟基苯乙酸、邻苯二甲酸及香草酸。
可选的，所述黄酮类化合物包括柚皮素、圣草酚、牡荆素、荭草素和芦丁。
可选的，所述单萜苷类化合物包括芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、牡丹皮苷d、牡丹皮苷e、苯甲酰芍药苷、苯甲酰氧化芍药苷、牡丹皮苷c、牡丹皮苷a、牡丹皮苷h、牡丹皮苷j、没食子酰芍药苷及没食子酰氧化芍药苷。
可选的，所述酚苷类化合物包括丹皮酚、牡丹酚苷a、牡丹酚苷b及suffruticosideaorc。
可选的，所述茋类化合物包括氧化白藜芦醇。
本发明的有益效果为：采用hplc-q-tof-ms技术，通过自建酚类化合物数据库结合数据采集与定性软件对芍药属油用植物油脂提取物中的酚类物质进行初步检索，检索到的化合物进一步进行二级质谱分析，根据碎片离子信息判断化合物的组成，然后根据化合物的结构特征选择合适的标品对得到的酚类物质进行定量分析，准确、快速的得到不同品种、不同产地的芍药属油用植物油脂中酚类化合物的组成，为进一步研究和开发提供参考和依据。
附图说明
图1为河南洛阳凤丹牡丹籽油甲醇提取液的hplc-q-tof-ms总离子流图；
图2为苯甲酸的提取色谱图(a)、二级质谱图(b)及推断的裂解方式(c)；
图3为7个对照品hplc-q-tof-ms总离子流图。
具体实施方式
本发明芍药属油用植物油脂中酚类化合物的分析方法是采用hplc-q-tof-ms(高效液相-四级杆-飞行时间串联质谱仪)技术进行定性定量的分析。具体包括以下步骤：
自建芍药属油用植物酚类化合物数据库：根据国内外芍药属植物中酚类化合物相关研究文献，收集芍药属及相关植物中酚类化合物名称及分子式，共66个。通过“formula-database-generator”软件(美国agilent公司)，根据化合物分子式中碳、氢、氧元素的个数，计算准确相对分子质量，结合各类专业数据库(pubmed，chemspider，scifinder，中科院化学专业数据库)，最终建立包括化合物名称、cas号、分子式、相对分子质量的芍药属植物酚类化合物数据库。
提取油脂中酚类化合物：取待分析芍药属油用植物油脂油样2.5g于50ml离心管中，先加入5ml正己烷，振荡溶解油样后，再加入60％甲醇水溶液(v/v)6ml，混匀并于漩涡振荡器充分振荡4min，然后在3000rpm转速下离心15min，收集下层甲醇相澄清液，重复以上步骤提取三次，收集三次提取液于38℃下旋蒸浓缩至干，最后用250μl50％甲醇水溶液再次溶解，溶解液过0.22μm有机滤膜后，密封冷藏待分析。
定性分析：
采用agilent-g6500系列高效液相色谱仪(1290二代)，色谱条件如下表所示：
表1色谱基本条件
表2梯度洗脱程序
采用agilent-g6500系列四级杆-飞行时间质谱仪(6545)，质谱条件：电喷雾源(esi)，在负离子扫描模式下进行数据采集，参比离子m/z为112.9855、980.0163和1033.9881。每次数据采集运行前，须使用调谐液(氟化膦嗪、三嗪、三甲铵乙内酯和三氟醋酸混合物)进行质量轴校准，以确保质量精度误差在1×10-6以下。具体质谱参数如下表所示。
表3质谱条件
应用hplc-q-tof-ms在上述优化的色谱和质谱条件下对芍药属油用植物油脂提取物进行分析，得到负离子模式下测定该提取物的总离子流色谱图，通过masshunter定性软件结合自建的酚类化合物数据库检索hplc-q-tof-ms采集得到的原始数据，得到提取液中含有的与酚类化合物数据库中精确分子量一致的色谱峰。然后利用q-tof-ms质谱分析器的四级杆选择这些色谱峰对应的分子离子，在碰撞池中对其进行碰撞诱导解离，裂解所得的碎片离子通过tof扫描得到二级质谱图。然后根据离子的裂解情况并结合文献进一步比对推测，推断出了芍药属油用植物油脂甲醇提取物含有的酚类化合物种类。
定量分析：
采用外标法，根据定性所得到的酚类化合物的结构特征，将其进行分类归属，然后购买具有每一类化合物母环结构的标品，将其配制成不同浓度梯度的对照品溶液，在上述色谱-质谱条件下，对系列梯度浓度对照品进行测定，以各个峰的色谱峰面积(y)对分析物浓度(x，μg/l)作线性回归，根据标准曲线得到回归方程和线性相关系数r，然后逐步稀释混标溶液，以信噪比s/n＝10作为最低定量限(loq)，信噪比s/n＝3作为最低检测限(lod)。然后利用标准曲线对分类后的每一类化合物分别定量。
实施例1
对河南洛阳凤丹牡丹籽油参照上述方法进行分析，得到的总离子流图如图1所示，以17号峰为例，其精确质量提取的离子色谱图如图2a，对应的二级质谱图如图2b。在图2b中，母离子[m-h]-的m/z为121.0295，对应的最佳分子式为c7h6o2，经参考文献及数据库比对，发现其与苯甲酸分子离子峰一致，故初步推测该化合物为苯甲酸，可能的裂解方式示于图2c，母离子[m-h]-丢失羧基上一个-co2基团，产生了m/z为77.0400的碎片离子，结合文献报道，推断该化合物为苯甲酸。其它同类化合物采用类似鉴定方法。最终推断出了河南洛阳凤丹牡丹籽油甲醇提取物中含有34种酚类化合物，包括11种酚酸类化合物、5种黄酮类化合物、13种单萜苷类化合物、4种酚苷类化合物以及1种茋类化合物。具体鉴定结果如下表：
表4河南洛阳凤丹牡丹籽油hplc-q-tof-ms鉴定结果
根据定性所得到的34种酚类化合物的结构特征，将其进行分类归属，然后准备具有每一类化合物母环结构的一个标品，包括苯甲酸、肉桂酸、对羟基苯乙酸、柚皮素、芍药苷、丹皮酚和氧化白藜芦醇，准确量取甲醇(hplc级)分别配制成每1ml含1mg标准对照品的单一成分储备溶液，于-20℃下密封保存，实验过程中用到的其它不同浓度的标准品及混合标准品溶液由甲醇(hplc级)稀释储备液得到。将其分别配制成不同浓度梯度的对照品溶液，在前述色谱-质谱条件下，对系列梯度浓度混合对照品溶液进行测定分析，得到的总离子流图如图3所示，线性结果见下表：
表5回归方程、线性范围及检测限、定量限
以单萜苷类化合物为例，检测结果为：
表6河南洛阳凤丹牡丹籽油单萜苷类化合物组成(μg/g)
实施例2
参考实施例1所示方法，分别对不同产地的凤丹牡丹籽油样品进行分析，其中各产地检测到的化合物种类相同，但含量存在显著性差异。以酚酸类化合物为例：
表7不同产地凤丹牡丹籽油中酚酸类化合物组成(μg/g)
由上表可见，总酚酸的含量范围在14.33～26.71μg/g，变化幅度为12.38μg/g，含量较高的酚酸类化合物有苯甲酸、绿原酸、没食子酸、芥子酸、对羟基苯甲酸以及咖啡酸，其中苯甲酸的含量最高，不同产地的含量范围在3.52～7.60μg/g，含量最高的产地为山东菏泽。
实施例3
参考实施例1所示方法，对紫斑牡丹籽油样品进行分析，检测到的化合物种类与凤丹牡丹籽油相同，但含量存在显著性差异。以酚苷化合物为例：
表8牡丹籽油酚苷化合物组成(μg/g)
可见，不同产地紫斑牡丹籽油总酚苷的含量不同，且低于凤丹牡丹籽油。
实施例4
参考实施例1所示方法，对托盘献宝和莲台芍药籽油样品进行分析，检测到的化合物种类与凤丹牡丹籽油相同，含量存在差异。以黄酮类化合物为例：
表9不同品种芍药籽油中黄酮类化合物组成(μg/g)
上述34种酚类化合物在芍药属油用植物牡丹籽油以及芍药籽油的研究中均未见相关报道，在其它食用植物油中也均未见相关报道。
由以上定量结果可知，在牡丹籽油和芍药籽油中，酚类物质均以单萜苷类为主，研究表明，苷类物质具有镇静、镇痛、保肝、抗炎等活性。芍药苷为牡丹籽油和芍药籽油中主要的单萜苷类物质，研究表明，芍药苷是中药赤芍和白芍的药效物质基础，具有很高的药用价值，可以增加冠脉流量，改善心肌血注，扩张血管，对抗急性心肌缺血，消炎、镇痛、抗惊厥、降血压以及抗溃疡等多种作用。此外，在增强机体的免疫功能和抗疲劳方面，也有着较好的效果。另有研究表明，其它单萜苷类物质苯甲酰芍药苷、苯甲酰氧化芍药苷对内毒素、胶原、adp诱导的大鼠以及人的血小板凝集有抑制作用。内毒素可激活外因性及内因性的凝固程序，产生调理素，使纤维蛋白凝固，芍药苷、氧化芍药苷等苷类物质可使凝固时间延长，苯甲酰芍药苷、苯甲酰氧化芍药苷也有使凝固时间延长的倾向。此外，氧化芍药苷、苯甲酰芍药苷以及苯甲酰氧化芍药苷对红细胞膜均有较强的稳定作用。因此，可考虑将牡丹籽油和芍药籽油作为苷类物质的加工资源综合开发利用。
上述实施例仅用来进一步说明本发明的一种芍药属油用植物油脂中酚类化合物的分析方法，但本发明并不局限于实施例，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均落入本发明技术方案的保护范围内。