采用HPLC指纹图谱的构建方法的五味子药材及其生脉注射液制剂与流程

本发明涉及中药及制剂检测领域，且特别涉及一种采用HPLC指纹图谱的构建方法的五味子药材及其生脉注射液制剂。

背景技术：

五味子为木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.)Baill. 的干燥成熟果实，有敛肺止咳、滋补涩精、止泻止汗之效。生脉注射液是由红参、麦冬、五味子制成的中药制剂，可采用肌内注射或静脉滴注的方式给药，用于气阴两亏，脉虚欲脱的心悸、气短、四肢厥冷、汗出、脉欲绝及心肌梗塞、心源性休克、感染性休克等具有上述证候者。五味子和生脉注射液临床使用已有多年，现阶段在《中国药典》中只是对五味子的五味子醇甲含量进行控制，不能全面反映五味子的质量情况，也无法全面反映生脉注射液的质量情况。

指纹图谱是随着现代分析技术发展而诞生的一种从整体上研究复杂物质体系的技术，目前在环境保护、食品评价、中药质量控制等领域中得到应用，尤其在中药材上应用比较广泛。中药指纹图谱是指某种中药材及其制剂中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。虽然指纹图谱的建立对于有效控制五味子及其制剂的质量具有十分重要的意义，但目前还没有形成对五味子药材及其生脉注射液制剂的指纹图谱的构建方法，因此未对五味子药材及其生脉注射液制剂建立指纹图谱，不能达到对五味子药材及其制剂全面质量评价的目的。

因此，需要研究一种五味子药材及其生脉注液制剂的指纹图谱的构建方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种五味子药材及其生脉注射液制剂的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的构建方法，建立了五味子药材及其生脉注射液制剂的分析方法，用于对药材和制剂的相关性作出评价，实现了从药材至制剂的质量可控。

本发明的另一目的在于提供一种五味子药材及其生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱的应用，通过建立五味子药材及其生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱，准确分析测定五味子药材及其制剂中的主要成分相对含量，通过含量可以有效可靠地预测产品质量，从而能够全面评价药材质量及药材与制剂的相关性。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出一种五味子药材及其生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱的构建方法，吸取五味子药材供试品溶液或生脉注射液制剂供试品溶液注入液相色谱仪进行高效液相色谱分析，即得五味子药材的 HPLC指纹图谱或生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱，所述液相色谱的条件为：Waters symmetry shield^TM RP18色谱柱；检测波长 250～260nm，流动相流速为0.8～1.3mL·min^-1，柱温为26～40℃；流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比为0.02％～0.04％的磷酸水溶液，流动相A与流动相B采用梯度洗脱。

进一步地，在本发明较佳实施例中，Waters symmetry shield^TM RP18色谱柱的规格为4.6mm×250mm，5.0μm。

进一步地，在本发明较佳实施例中，梯度洗脱的要求如下，其中流动相A与流动相B之间的比例为体积比：

0min时，流动相A：流动相B＝0：100；

17min时，流动相A：流动相B＝4：96；

20min时，流动相A：流动相B＝10：90；

40min时，流动相A：流动相B＝15：85；

60min时，流动相A：流动相B＝60：40；

70min时，流动相A：流动相B＝95：5；

75min时，流动相A：流动相B＝95：5；

80min时，流动相A：流动相B＝0：100。

进一步地，在本发明较佳实施例中，五味子药材供试品溶液的制备方法为：称定五味子，加入纯化水，煎煮，过滤，收集续滤液作为五味子药材供试品溶液；生脉注射液制剂供试品溶液是按照生脉注射液工艺生产获得制剂供试品溶液。

进一步地，在本发明较佳实施例中，吸取五味子醇甲对照品溶液注入液相色谱仪进行高效液相色谱分析，即得五味子醇甲对照品溶液的HPLC指纹图谱，所述液相色谱的条件为：Waters symmetry shield^TM RP18色谱柱；检测波长250～260nm，流动相流速为0.8～1.3mL·min^-1，柱温为26～40℃；流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比为 0.02％～0.04％的磷酸水溶液，流动相A与流动相B采用梯度洗脱。

进一步地，在本发明较佳实施例中，五味子醇甲对照品溶液的制备方法为：称取五味子醇甲，加甲醇混合，获得五味子醇甲对照品溶液，所述五味子醇甲对照品溶液中五味子醇甲的含量为8～13μg/ml。

一种上述的五味子药材及其生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱的构建方法的应用，通过对比分析五味子药材的HPLC指纹图谱和生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱，用于全面评价五味子药材和生脉注射液制剂的相关性。

进一步地，在本发明较佳实施例中，分析五味子药材的HPLC指纹图谱和生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱，以五味子醇甲为参照峰，分别得出五味子药材和生脉注射液制剂中的特征峰的相对保留时间、相对峰面积；

通过对比五味子药材的特征峰的相对保留时间、相对峰面积，以及生脉注射液制剂的特征峰的相对保留时间、相对峰面积，得出五味子药材和生脉注射液制剂之间相对应的特征峰，从而得到五味子药材和生脉注射液制剂的相关性。

一种上述的五味子药材及其生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱的应用，通过对比分析五味子药材的HPLC指纹图谱或生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱和五味子醇甲对照品溶液的HPLC指纹图谱，用于测定五味子药材或生脉注射液制剂中的主要成分相对含量。

进一步地，在本发明较佳实施例中，对比分析五味子药材的 HPLC指纹图谱或生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱，与五味子醇甲对照品溶液的HPLC指纹图谱中的特征峰，得出五味子药材或生脉注射液制剂中的主要成分相对含量。

本发明实施例的采用HPLC指纹图谱的构建方法的五味子药材及其生脉注射液制剂的有益效果是：五味子药材及其生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱的构建方法是吸取五味子药材供试品溶液或生脉注射液制剂供试品溶液注入液相色谱仪进行高效液相色谱分析，即得五味子药材的HPLC指纹图谱或生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱，液相色谱的条件为：Waters symmetry shield^TM RP18色谱柱；检测波长 250～260nm，流动相流速为0.8～1.3mL·min^-1，柱温为26～40℃；流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比为0.02％～0.04％的磷酸水溶液，流动相A与流动相B采用梯度洗脱，五味子药材及其生脉注射液制剂的高效液相色谱指纹图谱的构建方法建立了五味子药材及其生脉注射液制剂的分析方法，用于对药材和制剂的相关性作出评价，实现了从药材至制剂的质量可控；通过建立五味子药材及其生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱，准确分析测定五味子药材及其制剂中的主要成分相对含量，通过含量可以有效可靠地预测产品质量，从而能够全面评价药材质量及药材与制剂的相关性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例1中五味子药材的HPLC指纹图谱；

图2为本发明实施例1中生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的采用HPLC指纹图谱的构建方法的五味子药材及其生脉注射液制剂进行具体说明。

本发明实施例提供一种五味子药材及其生脉注射液制剂的 HPLC指纹图谱的构建方法，其是利用高效液相色谱对五味子药材供试品溶液或生脉注射液制剂供试品进行分析构建。具体方法如下：

(1)获得供试品溶液：a、制备五味子药材供试品溶液：称定五味子，加入纯化水，煎煮，过滤，收集续滤液作为五味子药材供试品溶液；b、按照生脉注射液工艺生产获得制剂供试品溶液作为生脉注射液制剂供试品溶液。

(2)获得对照品溶液：称取五味子醇甲，加甲醇混合，获得五味子醇甲对照品溶液，所述五味子醇甲对照品溶液中五味子醇甲的含量为8～13(10)μg/ml。

(3)构建供试品的指纹图谱：吸取五味子醇甲对照品溶液注入液相色谱仪进行高效液相色谱分析，即得五味子醇甲对照品溶液的 HPLC指纹图谱，所述液相色谱的条件为：Waters symmetry shield^TM RP18色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5.0μm；检测波长250～260(254) nm，流动相流速为0.8～1.3(1.0)mL·min^-1，柱温为26～40(30)℃；流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比为0.02％～0.04％(0.03％) 的磷酸水溶液，流动相A与流动相B采用梯度洗脱，本实施例中，梯度洗脱的要求如下，其中流动相A与流动相B之间的比例为体积比：

0min时，流动相A：流动相B＝0：100；

17min时，流动相A：流动相B＝4：96；

20min时，流动相A：流动相B＝10：90；

40min时，流动相A：流动相B＝15：85；

60min时，流动相A：流动相B＝60：40；

70min时，流动相A：流动相B＝95：5；

75min时，流动相A：流动相B＝95：5；

80min时，流动相A：流动相B＝0：100。

(4)构建对照品的指纹图谱：吸取五味子药材供试品溶液或生脉注射液制剂供试品溶液注入液相色谱仪进行高效液相色谱分析，即得五味子药材的HPLC指纹图谱或生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱，所述液相色谱的条件为：Waters symmetry shield^TM RP18色谱柱，规格为4.6mm×250mm，5.0μm；检测波长250～260(254)nm，流动相流速为0.8～1.3(1.0)mL·min^-1，柱温为26～40(30)℃；流动相A 为乙腈，流动相B为体积百分比为0.02％～0.04％(0.03％)的磷酸水溶液，流动相A与流动相B采用梯度洗脱，梯度洗脱要求与上述梯度洗脱要求相同。

本发明实施例还提供一种上述的五味子药材及其生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱的构建方法的应用，通过对比分析五味子药材的 HPLC指纹图谱和生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱，用于全面评价五味子药材和生脉注射液制剂的相关性。

具体过程为：分析五味子药材的HPLC指纹图谱和生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱，以五味子醇甲为参照峰，分别得出五味子药材和生脉注射液制剂中的特征峰的相对保留时间、相对峰面积；

通过对比五味子药材的特征峰的相对保留时间、相对峰面积，以及生脉注射液制剂的特征峰的相对保留时间、相对峰面积，得出五味子药材和生脉注射液制剂之间相对应的特征峰；

本发明实施例还提供一种上述的五味子药材及其生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱的应用，通过对比分析五味子药材的HPLC指纹图谱或生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱和五味子醇甲对照品溶液的HPLC指纹图谱，用于测定五味子药材或生脉注射液制剂中的主要成分相对含量。

具体过程为：对比分析五味子药材的HPLC指纹图谱或生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱，与五味子醇甲对照品溶液的HPLC指纹图谱中的特征峰，得出五味子药材或生脉注射液制剂中的主要成分相对含量。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

实施例1提供一种采用HPLC指纹图谱的构建方法的五味子药材及其生脉注射液制剂，其是按照以下过程进行：

第一步、精密称定2g五味子，加入100ml纯化水，煎煮2小时，过滤，收集续滤液作为药材供试品溶液；按照生脉注射液工艺生产，获得制剂供试品溶液。

第二步、称取五味子醇甲，加甲醇混合，获得对照品溶液，对照品溶液中五味子醇甲的含量为10μg/ml。

第三步、利于HPLC测定药材供试品溶液或制剂供试品溶液的色谱条件：Waters symmetry shield^TM RP18色谱柱，4.6mm×250mm， 5.0μm；检测波长254nm，流动相流速为1.0mL·min^-1，柱温为30℃；流动相A为乙腈，流动相B为体积百分比为0.03％磷酸水溶液，流动相A与B采用梯度洗脱，梯度洗脱的要求如下，其中流动相A与流动相B之间的比例为体积比：

0min时，流动相A：流动相B＝0：100；

17min时，流动相A：流动相B＝4：96；

20min时，流动相A：流动相B＝10：90；

40min时，流动相A：流动相B＝15：85；

60min时，流动相A：流动相B＝60：40；

70min时，流动相A：流动相B＝95：5；

75min时，流动相A：流动相B＝95：5；

80min时，流动相A：流动相B＝0：100。

在上述色谱条件下，精密吸取药材供试品溶液或制剂供试品溶液 10μl进样量，进行高效液相色谱分析，得到五味子药材的HPLC指纹图谱和生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱。

第四步、利于HPLC测定对照品溶液色谱条件：Waters symmetry shield^TM RP18色谱柱，4.6mm×250mm，5.0μm；检测波长254nm，流动相流速为1.0mL·min^-1，柱温为30℃；流动相A为乙腈，流动相B 为体积百分比为0.03％磷酸水溶液，流动相A与B采用梯度洗脱。

在上述色谱条件下，精密吸取对照品溶液10μl进样量，进行高效液相色谱分析，得到对照品溶液的HPLC指纹图谱。

通过上述构建过程，得到五味子药材的HPLC指纹图谱、生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱和对照品溶液的HPLC指纹图谱，其中，五味子药材的HPLC指纹图谱如图1所示，生脉注射液制剂的HPLC 指纹图谱如图2所示。根据五味子药材的HPLC指纹图谱、生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱和对照品溶液的HPLC指纹图谱进行如下分析：

A、在五味子药材的HPLC指纹图谱中，以五味子醇甲峰面积的 5％积分，总共标注有24个特征峰，其中有5个特征峰指认如下：#3 峰为莽草酸、#6峰为核苷、#7峰为腺苷、#9峰为五羟甲基糠醛、#23 峰为五味子醇甲。

在五味子药材的HPLC指纹图谱中，以五味子醇甲为参照峰，24 个特征峰的相对保留时间分别为：0.050～0.055(#1)、0.063～0.068 (#2)、0.078～0.083(#3)、0.090～0.095(#4)、0.08～0.13(#5)、 0.13～0.18(#6)、0.14～0.19(#7)、0.23～0.28(#8)、0.27～0.32(#9)、 0.32～0.37(#10)、0.36～0.41(#11)、0.39～0.44(#12)、0.40～0.45 (#13)、0.44～0.49(#14)、0.54～0.59(#15)、0.56～0.61(#16)、0.58～0.63(#17)、0.72～0.77(#18)、0.74～0.79(#19)、0.78～0.83 (#20)、0.82～0.87(#21)、0.84～0.89(#22)、1.000(#23)、1.01～ 1.06(#24)；以五味子醇甲为参照峰，24个特征峰的相对峰面积分别为：0.37～0.42(#1)、0.078～0.083(#2)、1.93～1.98(#3)、0.064～ 0.069(#4)、0.22～0.27(#5)、0.14～0.19(#6)、0.48～0.53(#7)、 0.92～0.97(#8)、0.18～0.23(#9)、0.21～0.26(#10)、0.45～0.50 (#11)、0.09～0.14(#12)、2.93～2.98(#13)、0.31～0.36(#14)、 0.13～0.18(#15)、0.08～0.13(#16)、0.26～0.31(#17)、0.26～0.31 (#18)、0.09～0.14(#19)、0.08～0.13(#20)、0.20～0.25(#21)、 0.10～0.15(#22)、1.000(#23)、0.05～0.10(#24)。

B、在生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱中，以五味子醇甲为参照峰，26个特征峰的相对保留时间分别为：0.043(#1)、0.056(#2)、 0.066(#3)、0.080(#4)、0.092(#5)、0.120(#6)、0.186(#7)、0.252 (#8)、0.290(#9)、0.303(#10)、0.321(#11)、0.340(#12)、0.408 (#13)、0.422(#14)、0.465(#15)、0.520(#16)、0.582(#17)、0.596 (#18)、0.744(#19)、0.759(#20)、0.813(#21)、0.834(#22)、0.863 (#23)、0.934(#24)、1.000(#25)、1.029(#26)；以五味子醇甲为参照峰，26个特征峰的相对峰面积分别为：0.251(#1)、0.270(#2)、 0.769(#3)、3.203(#4)、0.989(#5)、1.073(#6)、13.945(#7)、 0.331(#8)、0.287(#9)、1.231(#10)、0.328(#11)、0.200(#12)、 0.315(#13)、3.659(#14)、0.332(#15)、0.227(#16)、0.200(#17)、 0.445(#18)、0.272(#19)、0.132(#20)、0.196(#21)、0.112(#22)、 0.080(#23)、0.247(#24)、1.000(#25)、0.084(#26)。

(C)通过对比上述五味子药材的特征峰的相对保留时间、相对峰面积，以及生脉注射液制剂的特征峰的相对保留时间、相对峰面积，得出五味子药材和生脉注射液制剂之间相对应的特征峰，发现五味子药材中特征峰#3、#9、#13、#23、#24与生脉注射液中特征峰#4、#8、 #14、#25、#26相对应，从而评价五味子药材和生脉注射液制剂的相关性。

综上所述，本发明实施例的五味子药材及其生脉注射液制剂的高效液相色谱指纹图谱的构建方法建立了五味子药材及其生脉注射液制剂的分析方法，用于对药材和制剂的相关性作出评价，实现了从药材至制剂的质量可控；本发明实施例的五味子药材及其生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱的应用，通过建立五味子药材及其生脉注射液制剂的HPLC指纹图谱，准确分析测定五味子药材及其制剂中的主要成分相对含量，通过含量可以有效可靠地预测产品质量，从而能够全面评价药材质量及药材与制剂的相关性。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。