一种快速检测酵母活力的方法与流程

本发明涉及一种快速检测酵母活力的方法，属于微生物分析检测领域。

背景技术：

啤酒酵母是酿造啤酒所使用的微生物，分为上面酵母和下面酵母两类。啤酒酵母的生理状态影响着啤酒发酵产生的有机酸、酯、高级醇、醛类等物质的含量，从而对成品啤酒的质量造成影响。啤酒酿造过程中存在着多种胁迫作用，如罐压、营养物质的衰竭、发酵液中乙醇等物质的不断积累等。此外，啤酒酿造使用的酵母具有回收利用的特征，即发酵结束后回收的酵母泥可以作为下一轮发酵接种的酵母，国内啤酒酵母一般可使用5至10代。啤酒酿造过程中的胁迫作用以及酵母的回收利用导致酵母的活力不断下降。啤酒酵母的活力直接影响着成品啤酒的质量。因此，及时、快速并准确地检测啤酒酵母的活力对于啤酒生产过程是十分重要的。

在啤酒工厂中，通常使用死亡率作为判断啤酒酵母是否可以继续使用的参数，然而，死亡率的方法较为粗糙，无法反应酵母活力的细微差别。当酵母尚未达到死亡状态时，就已经发生了多种生理功能的衰退，如细胞形态的改变和线粒体功能的衰竭等，并最终导致发酵能力的下降。因此，用死亡率判断啤酒酵母的生理状态无法准确的反应出酵母细胞活力的变化。目前，已有很多关于细胞活力测定的研究，但是针对啤酒酵母活力测定的研究相对较少。此外，尽管现存很多活力测量方法，但是由于缺乏灵敏度、操作便捷度等原因，这些方法并未在啤酒厂中广泛应用。

技术实现要素：

三磷酸腺苷(ATP)是生物体内直接的能量来源，在细胞的生长和代谢过程中扮演者至关重要的角色。当酵母具有较高活力时，酵母维持胞内ATP的产生和消耗处于平衡的状态，当酵母细胞线粒体功能受损或胞内缺少能源导致活力下降时，ATP含量下降。因此，ATP的含量成为判断酵母活力的良好指标。

本发明的目的是提供一种快速检测酵母活力的方法，所述方法是通过检测酵母胞内ATP含量的变化反应酵母活力的变化。

在本发明的一种实施方式中，当胞内ATP含量低于60％时，细胞存活率低于95％。

在本发明的一种实施方式中，所述检测酵母胞内ATP含量的方法为将酵母细胞洗涤稀释后破碎，离心去除细胞碎片后，采用ATP检测试剂盒检测上清中ATP含量。

在本发明的一种实施方式中，所述稀释是指将酵母细胞稀释为10³～10⁶个细胞/mL的酵母细胞悬液。

在本发明的一种实施方式中，所述破碎是指采用玻璃珠进行震荡破碎。

在本发明的一种实施方式中，所述震荡破碎的处理条件为：按照1ml菌悬中加入200～400μl玻璃珠，取0.4～1mm玻璃珠加入稀释后的菌悬液中，于震荡破碎仪上震荡4～8min，震荡速度为4～8m/s，每震荡1～2min后将样品置于冰浴20～40s。

在本发明的一种实施方式中，所述检测酵母胞内ATP含量的方法具体为：

(1)取酵母菌悬液，洗涤2～3次，稀释为10³～10⁶个细胞/mL的酵母细胞悬液；

(2)在破壁管中加入0.4～1mm玻璃珠，置于震荡破碎仪上震荡4～8min，震荡速度为4～8m/s，每震荡1～2min后将样品置于冰浴20～40s；

(3)震荡结束后离心沉淀细胞碎片，收集上清液，于冰上保存；

(4)取上述上清液于不透光96孔板中，采用ATP试剂盒检测ATP含量。

本发明的第二个目的是提供所述方法在啤酒发酵中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是利用上述方法检测啤酒酒母的细胞活力。

在本发明的一种实施方式中，所述应用具体是当检测到胞内ATP含量低于60％时，细胞存活率低于95％，啤酒酵母细胞不可以继续使用。

本发明的有益效果：与其他酵母活力测量方法相比，ATP法检测酵母活力操作简单且灵敏，能有效反应啤酒酵母在储存过程中活力变化的细微差别。本发明的ATP检测方法中当胞内pH仅下降0.1左右，ATP含量下降20％左右，能够灵敏的反应细胞活力状况。本发明的ATP发光值与啤酒酵母菌浓数有极高的相关性(10³-10⁶)，当使用菌浓数在10³-10⁶间的啤酒酵母进行ATP含量检测时，相对标准偏差<1.68％。本发明方法具有较低的检测限，使用细胞数在10³的啤酒酵母细胞时即可进行ATP含量检测。本发明的操作简单、省时、方法灵敏可靠。

附图说明

图1啤酒酵母25℃储存过程中胞内ATP含量、胞内pH及存活率的变化；

图2啤酒酵母4℃储存过程中胞内ATP含量、胞内pH及存活率的变化；

图3发酵结束后的啤酒酵母储存过程中胞内ATP含量及胞内海藻糖含量的变化。

具体实施方式

实施例1：

以啤酒酵母G-03为例，将YPD中培养24小时的啤酒酵母G-03离心收集、洗涤后浸泡于无菌水中，放置于25℃，测定胞内ATP、存活率及胞内pH变化。每24h取1ml菌悬液，用预冷的无菌水洗涤细胞，离心去上清收集菌体，重复洗涤1次，无菌水重悬洗涤后的菌体至1ml，将菌悬液稀释至浓度为10⁶个细胞/ml的酵母细胞悬液。在2ml破壁管里，加入1ml菌液及300μl直径为0.5mm玻璃珠。将含有菌液及玻璃珠的破壁管置于震荡破碎仪上震荡5min，延长震荡时间时所检测到的ATP含量不再增加。震荡结束后离心沉淀细胞碎片，收集上清，破碎后的样品于冰浴上保存，待用于ATP含量检测。取细胞破碎液100μl于不透光96孔板中，使用ATP含量试剂盒检测酵母胞内ATP含量。将刚刚储存时酵母胞内ATP含量定义为100％，其余样品胞内ATP含量为与对照组相比的相对ATP含量。

实施效果：

实验结果如图1所示，结果表明，25℃储存条件下，随着酵母储存时间的延长，酵母胞内ATP含量下降。将储存第一天的酵母细胞设为对照样品，其胞内ATP含量定义为100％，其他样品胞内ATP含量为与对照样品相比的相对含量。测量得出第一天胞内pH为5.93。储存第二天酵母胞内ATP含量变为82.68％，胞内pH为5.81。储存第三天酵母胞内ATP含量变为58.68％，胞内pH为5.66。储存第四天酵母胞内ATP含量变为52.47％，胞内pH为5.61。储存第五天酵母胞内ATP含量变为38.52％，胞内pH为5.54。胞内pH的下降表明随着储存时间的延长酵母活力下降。胞内ATP含量与酵母胞内pH含量具有显著的相关性，相关系数r²＝0.997。ATP的检测步骤简单，省时。因此，检测ATP含量是一种快速、灵敏检测啤酒酵母活力的方法。在啤酒酵母的实际使用中，在酵母投入新一轮的使用前有一段储存过程，通常将酵母的存活率控制在95％以上，此时对应的胞内ATP含约为刚刚储存时胞内ATP含量的60％，因此，当酵母胞内ATP含量下降到60％以下时，此时继续使用该酵母将不利于生产。

实施例2：

以啤酒酵母G-03为例，将YPD中培养24小时的啤酒酵母G-03离心收集、洗涤后浸泡于无菌水中，放置于4℃，测定胞内ATP、存活率及胞内pH变化。每24h取1ml菌悬液，用预冷的无菌水洗涤细胞，离心去上清收集菌体，重复洗涤1次，无菌水重悬洗涤后的菌体至1ml，将菌悬液稀释至浓度为10⁶个细胞/ml的酵母细胞悬液。在2ml破壁管里，加入1ml菌液及300μl直径为0.5mm玻璃珠。将含有菌液及玻璃珠的破壁管置于震荡破碎仪上震荡5min，延长震荡时间时所检测到的ATP含量不再增加。震荡结束后离心沉淀细胞碎片，收集上清，破碎后的样品于冰浴上保存，待用于ATP含量检测。取细胞破碎液100μl于不透光96孔板中，使用ATP含量试剂盒检测酵母胞内ATP含量。将刚刚储存时酵母胞内ATP含量定义为100％，其余样品胞内ATP含量为与对照组相比的相对ATP含量。

实施效果：

实验结果如图2所示，结果表明，4℃储存条件下，随着酵母储存时间的延长，酵母胞内ATP含量下降。将储存第一天的酵母细胞设为对照样品，其胞内ATP含量定义为100％，其他样品胞内ATP含量为与对照样品相比的相对含量。4℃下，细胞代谢活动微弱，活力细微差别的检测变得更为困难，由结果可知，在4℃下储存时，酵母胞内pH以及存活率没有明显的变化，而胞内ATP含量的变化明显，便于活力差异的判断。酵母经储存5天后，存活率下降至约95％，此时对应的胞内ATP含量约为刚刚存时的60％，因此我们建议当细胞胞内ATP含量至此含量时就不再投入使用。当啤酒酵母死亡率变化极小、胞内pH不发生明显变化时，胞内ATP法仍可灵敏地反应酵母状态的改变。再次验证了ATP法检测酵母活力的灵敏性。因此，检测ATP含量是一种快速、灵敏检测啤酒酵母活力的方法。

实施例3：

以啤酒酵母e43、啤酒酵母11^#、啤酒酵母e77为例，将啤酒发酵结束后的酵母收集，储存与无菌水中，放置于20℃。每24h取1ml菌悬液，用预冷的无菌水洗涤细胞，离心去上清收集菌体，重复洗涤1次，无菌水重悬洗涤后的菌体至1ml后，测胞内ATP和胞内海藻糖含量。将菌悬液稀释至浓度为10⁶个细胞/ml的酵母细胞悬液。在2ml破壁管里，加入1ml菌液及300μl直径为0.5mm玻璃珠。将含有菌液及玻璃珠的破壁管置于震荡破碎仪上震荡，延长震荡时间时所检测到的ATP含量不再增加。震荡结束后离心沉淀细胞碎片，取上清，破碎后的样品于冰浴上保存，待用于ATP含量检测。取细胞破碎液100μl于不透光96孔板中，使用ATP含量试剂盒检测酵母胞内ATP含量。将刚刚储存时酵母胞内ATP含量定义为100％，其余样品胞内ATP含量为与对照组相比的相对ATP含量。

实施效果：

实验结果如图3所示，结果表明，发酵后酵母在储存过程中胞内ATP含量下降。将各酵母储存第一天时胞内ATP含量定义为100％，其他储存时间胞内ATP含量为与第一天胞内ATP含量相比的相对含量。与刚刚储存时酵母胞内的ATP含量相比，储存第5天时，啤酒酵母e43、啤酒酵母11^#、啤酒酵母e77的胞内ATP含量分布变为84.8％、78％、96％，具有不同程度的下降。与此同时，三株啤酒酵母胞内海藻糖含量随储存时间的延长不断下降，说明胞内供能物质的含量正在不断减少，细胞活力正在下降。因此，检测ATP含量是一种快速、灵敏检测啤酒酵母活力的方法。

实施例4：

以啤酒酵母G-03为例，将酵母菌液稀释成10³、10⁴、10⁵、10⁶不同浓度的菌悬液，依次检测其ATP含量。用预冷的无菌水洗涤细胞，离心去上清收集菌体，重复洗涤1次，无菌水重悬洗涤后的菌体至1ml，将菌悬液稀释至浓度为10⁶个细胞/ml的酵母细胞悬液。在2ml破壁管里，加入1ml菌液及300μl直径为0.5mm玻璃珠。将含有菌液及玻璃珠的破壁管置于震荡破碎仪上震荡5min，延长震荡时间时所检测到的ATP含量不再增加。震荡结束后离心沉淀细胞碎片，收集上清，破碎后的样品于冰浴上保存，待用于ATP含量检测。取细胞破碎液100μl于不透光96孔板中，使用ATP含量试剂盒检测酵母胞内ATP发光值，并计算标准偏差和相对标准偏差实施效果：

表1啤酒酵母胞内ATP含量测量方法的准确度

结果表明，ATP发光值与啤酒酵母菌浓数有极高的相关性(10³-10⁶)，当使用菌浓数在10³-10⁶间的啤酒酵母进行ATP含量检测时，相对标准偏差<1.68％。此方法具有较低的检测限，使用细胞数在10³的啤酒酵母细胞时即可进行ATP含量检测。因此，检测ATP含量是一种快速、灵敏检测啤酒酵母活力的方法。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。