一种血红蛋白和钛酸纳米纤维修饰碳离子液体电极的制备及其电化学分析应用的制作方法

本发明涉及化学修饰电极和生物电化学领域，具体涉及一种血红蛋白和钛酸纳米纤维修饰碳离子液体电极的制备及其电化学行为研究。

背景技术

一维纳米材料高的表面体积比使其电学性质对表面吸附非常敏感。当外界环境温度、光、湿度等因素改变时会迅速引起界面离子输运的变化，利用其电阻的显著变化可制备成响应速度快、灵敏度高、选择性优良的传感器。自从20世纪90年代末kasuga等采用水热合成法制备出一维的钛酸盐纳米结构以来，一系列纳米结构如钛酸盐纳米纤维(tinf)、钛酸盐纳米管(tint)、钛酸盐纳米带(tinb)和钛酸盐纳米片(tins)等引起了广泛关注。这些材料在光电催化、离子交换、锂电池方面都有应用。

本发明采用钛酸纳米纤维作为电极表面修饰材料，利用该纳米材料特有的性能为电极表面发生的生化反应提供一个更佳的传感平台，使得对血红蛋白在修饰电极复合膜内的电化学信号得以放大，能够更好的对其电化学行为进行研究。此外，功能纳米材料的修饰有助于提升电极的电化学性能，使得修饰电极在对三氯乙酸等目标底物的电化学检测过程中表现出良好的催化还原效果，得到更高的灵敏度响应和更低的浓度响应值，实现对三氯乙酸、亚硝酸钠和过氧化氢三种物质准确检测的目的。

技术实现要素：

本发明提供了一种血红蛋白和钛酸纳米纤维修饰碳离子液体电极的制备及其电化学行为研究的方法，制备工艺简单、成本低、操作方便、易于实现；制备的血红蛋白和钛酸纳米纤维修饰碳离子液体电极具有良好的电化学响应速度，可用于氧化还原蛋白质的电化学行为研究，以及应用于对三氯乙酸、亚硝酸钠等目标底物的电催化还原检测。

本发明采用的技术手段如下：

（1）一种血红蛋白和钛酸纳米纤维修饰碳离子液体电极的制备，具体包括以下步骤：

称取1.60g石墨粉和0.80g离子液体n-己基六氟吡啶磷酸盐于研钵中研磨均匀，填入玻璃电极管中压实，插入铜丝作导线，制备成碳离子液体电极。

利用超声分散配制浓度为0.5mg/ml的钛酸纳米纤维分散液，分散剂为无水乙醇。作为优选，将配制的分散液滴涂8μl于上述制备的碳离子液体电极上，制成tinfs/cile。如果钛酸纳米纤维修饰过少，电极表面的覆盖度不够，难以完全发挥作用；若钛酸纳米纤维修饰过多，在电极表面会形成堆积使部分材料不能被有效利用，并影响电极界面上的薄层电化学行为。

配制浓度为15.0mg/ml的血红蛋白溶液，溶剂为二次蒸馏水。作为优选，将配制的溶液滴涂8μl于上述制备的tinfs/cile上，制成hb/tinfs/cile。hb固定过多会造成试剂浪费，且不导电，其在电极表面堆积会影响电极的导电性能；滴涂量少则会影响底物与酶之间的充分反应，会影响电极的催化性能和电化学行为的考察结果。

采用无水乙醇将浓度为5%nafion稀释至浓度为0.5%nafion。作为优选，将配制的0.5%nafion溶液滴涂6μl于上述制备的hb/tinfs/cile上，制成nafion/hb/tinfs/cile。由于nafion是做保护膜用于固定血红蛋白，防止蛋白质直接接触pbs从而影响其电活性，还可以防止蛋白质由于固定不牢造成的脱落或者溶解于电解液中等情况，因此其量不宜过少，反之则会导致电极稳定性下降。

（2）血红蛋白和钛酸纳米纤维修饰碳离子液体电极的电化学行为研究

根据上述制备nafion/hb/tinfs/cile的方法进一步制备了不同类型的修饰电极用于对比实验，分别为：nafion/hb/tinfs/cile，nafion/hb/cile，nafion/tinfs/cile，nafion/cile以及tinfs/cile。运用电化学方法，如循环伏安法和交流阻抗法对不同修饰电极的电化学行为进行研究，并探讨影响电化学行为的重要因素，求解相关的电化学参数，如电极反应的电子转移数、电子转移系数、反应速率常数以及电极表面活性物质覆盖度等等。

（3）血红蛋白和钛酸纳米纤维修饰碳离子液体电极的电化学检测应用

所述的血红蛋白和钛酸纳米纤维修饰碳离子液体电极应用于电催化还原三氯乙酸、亚硝酸钠和过氧化氢三种物质，制作了相应催化反应的还原峰电流值与目标底物浓度之间的工作曲线，得到其检测的线性范围和检测限，求解出底物-酶催化反应的表观米氏常数值。所述的检测方法为循环伏安法，扫描速度为0.1v/s，检测环境为在ph=3.0的磷酸盐缓冲溶液中。

本发明中涉及的cile（carbonionicliquidelectrode）是指碳离子液体电极；离子液体（hppf6）为n-己基吡啶六氟磷酸盐（兰州雨陆精细化工有限公司）；tinfs为钛酸纳米纤维（南京先丰纳米科技有限公司）；hb（hemoglobin）为血红蛋白（sigma公司）；nafion为全氟磺酸型聚合物膜（北京鸿海天科技有限公司）；tca为三氯乙酸（天津市科密欧化学试剂开发中心）；nano2为亚硝酸钠（国药集团化学试剂有限公司）；h2o2为过氧化氢（西陇科学股份有限公司）；pbs为磷酸盐缓冲溶液。

与现有技术相比，本发明的优点是：

本发明采用的钛酸纳米纤维（tinfs）是一种性能良的纳米材料，有着良好的导电性和延展性，具备优越的化学、电催化、物理等性能，且比表面积大，加上它的表面效应和量子尺寸效应，将其修饰于电极上有望于提升电极的电催化性能。

本发明制备的钛酸纳米纤维与血红蛋白修饰碳离子液体电极能够应用于对三氯乙酸、亚硝酸钠以及过氧化氢三种目标底物的电化学检测，并表现出良好的电催化效果。目标底物的浓度大小与催化反应的峰电流值呈良好的线性关系，其对应的检测的浓度范围分别为8.0~440.0mmol/l（三氯乙酸）、0.02~2.30mmol/l（亚硝酸钠）和9.0~35.0mmol/l（过氧化氢），检出限分别为1.67mmol/l、0.0067mmol/l和3.0mmol/l。

附图说明

图1中a和b分别为tinfs固体粉末在不同放大倍数下的扫描电镜图。

图2中a和b分别为hb和hb-tinfs混合粉末的红外光谱表征结果。

图3为（a）hb和（b）hb-tinfs在水溶液中的紫外光谱表征结果。

图4为不同修饰电极在铁氰化钾和氯化钾浓度分别为10.0mmol/l和0.1mol/l混合溶液中的电化学交流阻抗谱，其中：

曲线a为对比例4中tinfs/cile的交流阻抗谱；

曲线b为实施例1中nafion/hb/tinfs/cile的交流阻抗谱；

曲线c为对比例3中nafion/cile的交流阻抗谱；

曲线d为对比例1中nafion/hb/cile的交流阻抗谱。

图5为不同修饰电极在ph=3.0的pbs中，扫描速度为100mv/s的循环伏安曲线，其中：

曲线d为对比例3中nafion/cile的循环伏安曲线；

曲线c为对比例2中nafion/tinfs/cile的循环伏安曲线；

曲线b为对比例1中nafion/hb/cile的循环伏安曲线；

曲线a为实施例1中nafion/hb/tinfs/cile的循环伏安曲线。

图6为nafion/hb/tinfs/cile在ph=3.0的pbs中不同扫描速度下的循环伏安曲线，a到k表示的扫速范围为0.02~1.00v/s。

图7为nafion/hb/tinfs/cile在不同ph的pbs中，扫描速度为100mv/s的循环伏安曲线，a到f分别代表ph为：3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0。

图8为nafion/hb/tinfs/cile在含不同浓度tca的ph=3.0pbs的循环伏安曲线，a到l表示的tca浓度范围为8.0~440.0mmol/l。

图9为nafion/hb/tinfs/cile在含不同浓度nano2的ph=3.0pbs的循环伏安曲线，a到l表示的nano2浓度范围为0.02~2.30mmol/l。

图10为nafion/hb/tinfs/cile在含不同浓度h2o2的ph=3.0pbs的循环伏安曲线，a到l表示的h2o2浓度范围为9.0~35.0mmol/l。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

nafion/hb/tinfs/cile的制备方法，步骤如下：

首先，称取1.60g石墨粉和0.80g离子液体n-己基六氟吡啶磷酸盐于研钵中研磨至糊状物，填入玻璃电极管中压实，插入铜丝作导线，制备成cile；进一步，取8μl0.5mg/mltinfs分散液滴涂在cile表面，室温条件下自然晾干，得到tinfs/cile；进一步，取8μl15mg/mlhb溶液滴涂在tinfs/cile表面，在室温下自然晾干，得到hb/tinfs/cile；进一步取6μl0.5%nafion乙醇溶液滴涂在hb/tinfs/cile表面，室温下自然晾干后即得到nafion/hb/tinfs/cile。

对比例1

nafion/hb/cile的制备方法，步骤如下：

首先，称取1.60g石墨粉和0.80g离子液体n-己基六氟吡啶磷酸盐于研钵中研磨至糊状物，填入玻璃电极管中压实，插入铜丝作导线，制备成cile；进一步，取8μl15mg/mlhb溶液滴涂在cile表面，在室温下自然晾干，得到hb/cile；进一步取6μl0.5%nafion乙醇溶液滴涂在hb/cile表面，室温下自然晾干后即得到nafion/hb/cile。

对比例2

nafion/tinfs/cile的制备方法，步骤如下：

首先，称取1.60g石墨粉和0.80g离子液体（n-己基六氟吡啶磷酸盐）于研钵中研磨至糊状物，填入玻璃电极管中压实，插入铜丝作导线，制备成cile；进一步，取8μl0.5mg/mltinfs分散液滴涂在cile表面，室温条件下自然晾干，得到tinfs/cile；进一步取6μl0.5%nafion乙醇溶液滴涂在tinfs/cile表面，室温下自然晾干后即得到nafion/tinfs/cile。

对比例3

nafion/cile的制备方法，步骤如下：

首先，称取1.60g石墨粉和0.80g离子液体n-己基六氟吡啶磷酸盐于研钵中研磨至糊状物，填入玻璃电极管中压实，插入铜丝作导线，制备成cile；进一步取6μl0.5%nafion乙醇溶液滴涂在cile表面，室温下自然晾干后即得到nafion/cile。

对比例4

tinfs/cile的制备方法，步骤如下：

首先，称取1.60g石墨粉和0.80g离子液体n-己基六氟吡啶磷酸盐于研钵中研磨至糊状物，填入玻璃电极管中压实，插入铜丝作导线，制备成cile；进一步，取8μl0.5mg/mltinfs分散液滴涂在cile表面，室温条件下自然晾干即得到tinfs/cile。

一、仪器表征结果

通过扫描电子显微镜（sem）可以对用于电极表面修饰的钛酸纳米纤维材料的形貌结构进行表征，结果如图1所示。

通过紫外可见分光光度计和傅里叶变换红外光谱仪的光谱研究可以检验血红蛋白在与tinfs混合作用后是否发生变性，结果如图2~3所示，紫外和红外光谱结果均表明hb没有发生变性。

通过对不同修饰电极的交流阻抗值的检测能够说明tinfs的存在是否会增强电极的导电性，如图4所示，检测结果表明性能良好的钛酸纳米纤维的存在能够提升电极的导电性，降低电极的界面电阻值。

二、hb的电化学行为及影响因素研究

研究了不同修饰电极在ph3.0的pbs中，在扫描速度为100mv/s下的电化学行为，结果如图5所示。经过对比可知，曲线a（nafion/hb/tinfscile）电化学响应信号明显高于曲线b（nafion/hb/cile），证明hb在修饰了tinfs的电极上其直接电化学信号得到增强。

运用循环伏安法在ph为3.0的pbs中，通过改变扫描速度来讨论其对复合膜内hb电化学行为的影响，考察范围为0.02~1.00v/s。结果如图6所示，并计算出相关电化学参数结果为：电子转移数n=1.19，电子转移系数α=0.45，反应速率常数ks=1.19s^-1。电活性物质在电极表面覆盖度г*=2.66×10^-9mol/cm²，电极表面固定的hb总浓度为1.48×10^-8mol/cm²，参与电极反应的电活性物质hb占电极表面hb总量为17.97%。

探讨了缓冲溶液的ph值大小对hb直接电化学行为的影响。运用电化学循环伏安法在3.0~8.0的ph范围内考察nafion/hb/tinfs/cile在缓冲溶液酸碱度变换的环境中的电化学行为。如图7所示，结果表明在此ph范围内hb的直接电化学行为为准可逆的过程，并得出ph每增大一个单位，氧化还原反应式电位增大0.049v，略小于25°c条件下可逆体系理论值0.059v/ph，能够判断hb在修饰电极上同时发生一个质子和一个电子的转移。

三、修饰电极的电催化应用

考察了实施例1中的nafion/hb/tinfs/cile对三氯乙酸（tca）、亚硝酸钠（nano2）和过氧化氢（h2o2）的电催化行为，结果如图8~10所示，催化反应的峰电流值与目标底物的浓度呈良好的线性关系，分别制作了三种目标底物与还原峰峰电流之间的工作曲线并得到了相应底物的检测范围及检测限（3σ），通过作[/iss-1/c]双倒数工作曲线，计算出相应催化反应的表观米氏常数值（km^app），相关参数如下表所示。电催化结果表明tinfs因其固有的特性在修饰于电极表面后增加了酶与底物的亲和力，使得血红蛋白对底物有良好的催化还原效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。