一种定量定性检测抗平滑肌抗体的试剂盒的制作方法

本发明涉及磁微粒化学发光技术，尤其是涉及一种采用磁微粒化学发光技术制备的一种定量定性检测抗平滑肌抗体的试剂盒。

背景技术：

自身免疫学肝病（autoimmuneliverdisease,ald）是一种特殊类型的慢性肝病，其发病者的性别、年龄分布与红斑狼疮相似，且长伴有肝外症状，甚至可见“狼疮”现象，因而推测其发病与自身免疫有关。

近年来，由于临床经验的积累和实验室诊断技术的进步，我国人群中自身免疫性肝病患者逐渐增多。国内有关自身免疫性肝病的发病机制、相关自身抗体靶抗原、病例报道、临床病例讨论和临床病理分析的文章逐渐增多，以上的工作说明自身免疫性肝病在中国并不少见。

临床上对自身免疫性肝病的检测方法较多，主要有间接免疫荧光法、酶联免疫法、免疫印迹法等，近几年化学发光在自身抗体检测中的使用也逐渐增多。

间接免疫荧光法创立于上世纪50年代，是自身抗体检测的经典方法，包被天然抗原或组织，结果直观可见。但该方法需要使用荧光显微镜，且检测结果的判断需要实验室经验，有些组织片的荧光模式（核型）难以分辨；而确定滴度的工作量大；灵敏度低；由于是组织抗原，特异性也不很高；所有的ifa方法学实验都是筛查实验，不能用于确认。

酶联免疫法可以大批量操作，适合较大标本量实验室应用，且易实现自动化检测，可进行定性或定量分析；该方法可以用于筛查，用于确认，用于对自身免疫性疾病的初次诊断，也可用于判断预后和观察疗效。但是，并不是所有的自身抗体（如抗角蛋白抗体）都可以用该方法进行检测；可用该方法检测的指标，往往不能一次性明确诊断，并且其质量好坏在各个品牌之间差距较大，这也与所包被的抗原有密切的关系。

免疫印迹法灵敏度高，特异性强，质量稳定，批间差小；不受标本量的限制；不需要特殊设备，也易于实现自动化，适合各类实验室操作；往往能一次性做出明确诊断。但并不是所有的自身抗体（如抗平滑肌抗体）都可以用该方法检测，并且不能定量检测，因此不适用于疗效观察。

化学发光法由于其快速、准确、可定量、操作便捷等优势，越来越多的应用于临床。与其他自身抗体检测方法的多样性不同，抗平滑肌抗体的检测，目前临床上仍以间接免疫荧光法为主，除极个别厂家有免疫印迹法和常规酶联免疫法试剂外，使用磁微粒化学发光法检测抗平滑肌抗体的试剂还是空白。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种采用磁微粒化学发光法检测自身免疫性肝病相关抗体—抗平滑肌抗体（asma）的定量定性检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的定量定性检测抗平滑肌抗体的试剂盒，包括标记有链霉亲和素的磁微粒试剂，含有hrp标记的羊抗人igg的保存缓冲液，生物素抗原试剂，抗平滑肌抗体校准品，抗平滑肌抗体临界值质控品，抗平滑肌抗体阴性质控品；所述磁微粒的表面含有羧基基团，所述生物素抗原试剂中的生物素抗原标记有肌动蛋白。

其中：

所述磁微粒试剂的制备方法为：

第一步，配制保存缓冲液

将纯化水、浓度为0.6%的tris和浓度为0.9%的氯化钠加入容器中充分搅拌溶解，再将浓度为1%的牛血清白蛋白、浓度为0.1%的proclin300、浓度为0.2‰的bro、浓度为0.4‰的mgcl·6h2o加入容器中，充分搅拌至完全溶解，2-8℃保存待用；

第二步，配制缓冲液1

将纯化水，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠加入到容器中充分搅拌溶解，其中磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠配制后的浓度为0.1m，ph值为7.4；2-8℃保存待用；

第三步，配制缓冲液2

将纯化水，醋酸钠加入到容器中充分搅拌溶解，其中醋酸钠配制后的浓度为0.1m，ph值为5.0；2-8℃保存待用；

第四步，制备磁微粒试剂

使用缓冲液1和2依次对表面含有羧基基团的磁微粒洗涤后待用；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基硫代琥珀酰亚胺分别用缓冲液2溶解，等体积混合后加入到洗涤后的磁微粒中，混合均匀在室温条件下反应1小时，得到磁微粒混悬溶液；加入链霉亲和素反应2小时，使用第一步配制的保存缓冲液洗涤、定容，磁微粒试剂配制完毕，2-8℃保存待用。

所述含有hrp标记的羊抗人igg的保存缓冲液的制备方法为：

将纯化水、浓度为0.6%的tris和浓度为0.9%的氯化钠加入容器中充分搅拌溶解，再将浓度为1%的牛血清白蛋白、浓度为0.1%的proclin300、浓度为0.2‰的bro加入容器中，充分搅拌至完全溶解，得到保存缓冲液；将hrp标记的羊抗人igg使用该保存缓冲液稀释至0.5-1μg/ml，得到含有hrp标记的羊抗人igg的保存缓冲液，2-8℃保存待用。

所述生物素抗原试剂的制备方法为：

第一步，配制生物素抗原保存缓冲液

将纯化水、浓度为0.6%的tris和浓度为0.9%的氯化钠加入容器中充分搅拌溶解，再将浓度为1%的牛血清白蛋白、浓度为0.1%的proclin300、浓度为0.2‰的bro加入容器中，充分搅拌至完全溶解，得到的保存缓冲液2-8℃保存待用；

第二步，配制生物素抗原缓冲液

将纯化水、摩尔浓度为0.02m的硼酸加入容器中充分搅拌溶解，使ph为8.5，2-8℃保存待用；

第三步，制备生物素抗原

取100μg测抗平滑肌抗体特异性抗原，用第一步配制的生物素抗原保存缓冲液稀释至2mg/ml，再加入2μl浓度为2mg/ml的带nhs活化酯的生物素，室温下反应2小时；反应结束后，经超滤，用第二步配制的生物素抗原缓冲液重悬至50μl~100μl，得到生物素抗原试剂。

所述抗平滑肌抗体校准品的制备方法为：

将纯化水、浓度为0.6%的tris和浓度为0.9%的氯化钠加入容器中充分搅拌溶解，再将浓度为1%的牛血清白蛋白、浓度为0.1%的proclin300、浓度为0.2‰的bro加入容器中，充分搅拌至完全溶解，得到的保存缓冲液2-8℃保存待用；

将抗平滑肌抗体使用上述保存缓冲液依次稀释至浓度为0、10、20、50、100、200au/ml，得到抗平滑肌抗体校准品2-8℃保存待用。

所述抗平滑肌抗体临界值质控品的制备方法为：

将纯化水、浓度为0.6%的tris和浓度为0.9%的氯化钠加入容器中充分搅拌溶解，再将浓度为1%的牛血清白蛋白、浓度为0.1%的proclin300、浓度为0.2‰的bro加入容器中，充分搅拌至完全溶解，得到保存缓冲液2-8℃保存待用；

将抗平滑肌抗体使用该保存缓冲液稀释至浓度为20au/ml，得到抗平滑肌抗体临界值质控品，2-8℃保存待用。

所述抗平滑肌抗体阴性质控品的制备方法为：

将纯化水、浓度为0.6%的tris和浓度为0.9%的氯化钠加入容器中充分搅拌溶解，再将浓度为1%的牛血清白蛋白、浓度为0.1%的proclin300、浓度为0.2‰的bro加入容器中，充分搅拌至完全溶解，得到保存缓冲液2-8℃保存待用；

将不含抗平滑肌抗体的样本使用该保存缓冲液稀释至浓度＜10au/ml，得到抗平滑肌抗体阴性质控品，2-8℃保存待用。

本发明制备的试剂盒的检测原理为：

1）链霉亲和素磁微粒与生物素化抗原特异性结合；

2）连接亲和素后的生物素化抗原，与待测样本中特异性抗体相结合；

3）抗体与辣根过氧化物酶结合；

4）通过加入发光系统底物后，读取待检样品信号值，进而计算定量或定性结果。

本发明的优点在于检测便捷，能在较短时间内实现对抗平滑肌抗体的定量和定性检测，从而准确诊断出自身免疫性肝病的类型及严重程度，指导医生临床用药。本发明制备的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确性好的优点，适用于半自动或全自动检测系统；本发明试剂盒将化学发光技术与磁微粒技术相结合，在临床上具有较高的使用价值，适于推广应用。

附图说明

图1是实施例3空白限评价中零浓度校准品与相邻校准品之间浓度值与发光值结果进行两点回归拟合得出的一次方程；

图2是实施例3线性范围评价中样本浓度平均值与稀释比例，使用最小二乘法进行直线拟合后得到的拟合曲线及相关系数。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以利于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明所用的试剂和仪器均为市售产品，采用的试验方法也为本领域常规方法。

实施例1检测抗平滑肌抗体的试剂盒的制备

一、制备磁微粒试剂

1、配制磁微粒试剂保存缓冲液：

将1000ml纯化水、6.05gtris和9.0g氯化钠加入容器中充分搅拌溶解；将牛10g血清白蛋白、1mlproclin300、0.2gbro和0.4gmgcl·6h2o加入容器中，充分搅拌至完全溶解；使用6m盐酸调ph至7.4±0.1后，保存缓冲液配制完毕，2-8℃保存待用；

2、配制磁微粒试剂缓冲液1：

将1000ml纯化水，0.58g磷酸二氢钠、5.78g磷酸氢二钠、8.78g氯化钠加入到容器中充分搅拌溶解，测定ph值在7.0-7.5之间，2-8℃保存待用；

3、配制磁微粒试剂缓冲液2：

将1000ml纯化水，6.8g醋酸钠加入到容器中充分搅拌溶解，醋酸钠配制后的浓度为0.1m，测定ph值为5.0后，2-8℃保存待用；

4、制备磁微粒试剂：

取100mg表面含有羧基基团的磁微粒，先使用缓冲液1对该磁微粒进行洗涤，洗涤2次后，用缓冲液2对磁微粒再次进行洗涤，洗涤2次后待用；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基硫代琥珀酰亚胺均使用缓冲液2进行溶解，配制成终浓度均为20mg/ml溶液后，各取5ml加入到洗涤后的磁微粒中，混匀后在室温条件下反应1小时，得到磁微粒混悬溶液；使用缓冲液2配制浓度为5mg/ml的链霉亲和素溶液，取1ml该链霉亲和素溶液加入到上述磁微粒混悬液中，混匀后在室温条件下反应2小时，使用磁力架进行分离，静置2min后吸去上清，然后加入浓度为1m、ph值为8.5的乙醇胺溶液10ml，室温混匀反应1小时后，再次使用磁力架进行分离，静置2min后吸去上清；加入第1步配制的保存缓冲液10ml，室温混匀10min后，使用磁力架进行分离，静置2min后吸去上清，重复这个过程4次后，加入保存缓冲液，使磁微粒终浓度为1mg/ml，2-8℃保存待用。

二、制备含有hrp标记的羊抗人igg的保存缓冲液

按制备磁微粒试剂第1步中方法制备保存缓冲液；将hrp标记的羊抗人igg使用保存缓冲液稀释至0.5-1μg/ml，2-8℃保存待用。

三、制备生物素抗原试剂

1、配制生物素抗原保存缓冲液：

同制备磁微粒试剂第1步中方法；

2、配制生物素抗原缓冲液：

将1000ml纯化水、1.25g硼酸加入容器中充分搅拌溶解，测定ph为8.5，2-8℃保存待用；

3、制备生物素抗原试剂：

取100μg测抗平滑肌抗体特异性抗原，用生物素抗原保存缓冲液稀释至2mg/ml，再加入2μl浓度为2mg/ml的带nhs活化酯的生物素，室温下反应2小时；反应结束后，用30k的超滤管超滤4次（10min，4000g），用生物素抗原缓冲液重悬至50μl~100μl，得到生物素抗原试剂（生物素化的抗平滑肌抗体特异性抗原）。

四、制备抗平滑肌抗体校准品

按制备磁微粒试剂第1步中方法制备保存缓冲液；将抗平滑肌抗体使用该保存缓冲液稀释至浓度为0、10、20、50、100、200au/ml；配制好的校准品2-8℃保存待用。

五、制备抗平滑肌抗体临界值质控品

按制备磁微粒试剂第1步中方法制备保存缓冲液；2-8℃保存待用；将抗平滑肌抗体使用保存缓冲液稀释至浓度为20au/ml；得到抗平滑肌抗体临界值质控品，2-8℃保存待用。

六、制备抗平滑肌抗体阴性质控品

按制备磁微粒试剂第1步中方法制备保存缓冲液；2-8℃保存待用；将不含抗平滑肌抗体样本，使用保存缓冲液稀释至浓度＜10au/ml；得到抗平滑肌抗体阴性质控品2-8℃保存待用。

七、底物底物可使用安图生物工程股份有限公司生产的全自动免疫检验系统用底物液，该底物液由底物a液（含氧化剂）和底物b液（含发光剂和增强剂）组成，加入底物时，底物a和底物b加入量均为50μl/测试。

实施例2本发明试剂盒的检测方法

一、样本要求

1、采用正确医用技术收集血清或血浆样本：血清样本可使用普通管或促凝管采集，血浆样本可使用edta、肝素钠、枸橼酸钠抗凝管采集。

2、样本中的沉淀物和悬浮物可能会影响试验结果，应离心除去，并确定样本未变质方可使用。

3、脂血、溶血或浑浊的样本不能用于本项目的测定。

4、样本收集后在室温放置不可超过8小时；如果不在8小时内检测需将样本放置在2~8℃的冰箱中；若需48小时以上保存或运输，则应冻存于-20℃以下，避免反复冻融。使用前恢复到室温，轻轻摇动混匀。

二、检测步骤

1、试剂使用前，需放置于室温环境平衡30min；

2、将样本使用保存缓冲液稀释100倍后，将20μl磁微粒试剂、100μl生物素化抗原溶液、100μl校准品/临界值质控/阴性质控/100μl稀释后的样本依次加入到反应孔中，混匀后于37℃反应15min；

3、将反应孔放于磁分离架上，静置2min后倾倒掉上清，移去磁分离架，加入300μl清洗液，混匀；

4、再重复“3”步骤4次；

5、在反应孔中加入100μl酶结合物，混匀后于37℃反应15min；

6、重复“3”步骤5次；

7、加入底物100μl后测定发光值。

实施例3本发明制备的试剂盒的性能测试

一、空白限、

使用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得到20次测量结果的发光值（rlu），计算其平均值（m）和标准差（sd），得到m+2sd所对应的rlu。校准品各点浓度值和信号值，按照四参数lin-log方式进行拟合，将m+2sd所对应的rlu代入拟合曲线，求出对应的浓度值，即为空白限。本方法的空白限要求不大于5au/ml。空白限数据参见表1：

表1空白限评价

由表1数据可见，得到的空白限小于要求的空白限，满足临床使用需求。

二、线性范围

将接近线性范围上限130%的高值样本按一定比例做系列稀释，至少稀释5个浓度，低值浓度的样本须接近线性范围的下限。对每个稀释浓度的样本重复检测2次，回算浓度值并计算其浓度平均值。以稀释倍数为x轴，以回算浓度值均值为y轴，用最小二乘法计算，要求线性相关系数应大于0.9900。具体数据参见表2，拟合曲线及相关系数参见图2。

表2线性范围评价

本方法的线性范围为10-200au/ml，要求在此范围内，相关系数r应≥0.9900。表2和图2结果显示：评价结果符合要求。

三、精密性：

分析内精密性考核，在一次试验内，重复测定10个测试，计算10个测试回算浓度值的平均值（x）和标准差（sd），变异系数（cv%）=sd/x*100%。分析间精密性考核，在同一次试验中重复测定10个测试，同一试验每天做一次，做3天，得到30个测试的结果，计算30个测试结果回算浓度值的平均值（x）和标准差（sd），变异系数（cv%）=sd/x*100%。要求分析内精密性＜10%，考核分析间精密性＜15%，数据参见表3。

表3精密性评价

表3结果显示：评价结果符合要求，表明本试剂盒在实验检测中具有良好的重复性。

4、稳定性

将本发明试剂盒于37℃放置7天，试剂盒性能无明显变化。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所述技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的包含范围。