一种基于等离子体增强电化学反应的循环肿瘤细胞检测方法与流程

本发明属于细胞检测技术领域，具体涉及一种基于等离子体增强电化学反应的循环肿瘤细胞高灵敏检测的新方法。

背景技术：

癌症是造成人类死亡的主要原因之一，据癌症统计数据显示，癌症引起的死亡90%以上都是由癌转移引起的。在肿瘤转移扩散过程中进入外周血循环的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞（ctcs）。当ctcs从原发部位脱落，进入外周血循环，转移至宿主器官部位，最终导致了癌症的相关死亡。因此，早期的ctcs的发现，对癌症的早期诊断具有很重要的意义。但是，由于ctcs在早期的癌症患者的外周血中的数量极少，大约每10⁶～10⁷个白细胞中有一个ctcs，因此对ctcs的分离和检测就显得格外困难。此外，能够特异性结合ctcs的探针分子也很少。传统的ctcs检测技术往往灵敏度不够高，选择性较差，效率低等等，因此，迫切需要寻找一种能够高灵敏检测血液样品中少量ctcs的新方法。

为了提高检测灵敏度，新兴出了很多关于ctc检测的方法，包括色度法、近红外荧光、光致发光、荧光成像等。ctcs检测技术的快速发展可以使我们能够更深入地了解肿瘤转移的深层机制。然而，大多数方法都受到了耗时的实验程序或者复杂的仪器设备的影响，最终限制了它们的广泛应用。相比之下，电化学检测技术在检测细胞活性和增殖方面具有压倒性的优势，因为电化学检测技术具有高灵敏度、低成本、操作方便、检测迅速等显著优点。

核酸适配体是具有特定三维结构的单链核苷酸，是通过体外筛选方法指数富集的配基系统进化技术（selex）筛选出来的短单链核苷酸，它们对靶分子具有很高的亲和力和很强的特异性。适配体的靶分子范围很广，包括有机小分子、金属离子、蛋白分子以及细胞等。相比其他分子探针，核酸适配体具有相对尺寸小、合成快、稳定性好、免疫原性低、分子识别特异性等显著优势。

局域表面等离子体共振（lspr）是由入射光电磁场驱动的金属纳米粒子表面自由电子的集体震荡组成。由于lspr激发，在纳米结构表面产生强电磁场和高浓度的高能电荷载流子（电子-空穴对）。由于产生的电荷载流子的能量高于环境温度下的热激发载流子的能量，它们也被称为“热电子”和“热空穴”。lspr使贵金属纳米粒子具有一些独特的优点，包括局部电磁场增强、电荷载流子有效分离以及光子耗散过程中的热效应，这些特点使得贵金属纳米粒子在化学、物理和生物研究领域有着广泛的应用，比如lspr可用于表面增强拉曼散射等。最近发现lspr效应不仅可以增强光谱而且可以增强电化学。在这个工作中，热电子驱动到外部电路，留在金纳米粒子的热空穴用来加速葡萄糖氧化，通过研究lspr波长、光强和温度的影响，提出了一种直接等离子体增强电化学（dpee）的机理。基于dpee机理，构建了一种等离子体提高的葡萄糖电化学检测方法，证明了lspr效应显著提高了传感器的性能。该研究为利用lspr效应设计功能强大的电化学装置和分析提供了新的策略。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有循环肿瘤细胞检测技术灵敏度不高、选择性较差、效率低的技术问题，基于等离子体增强电化学反应，提供一种能够高灵敏检测少量循环肿瘤细胞的新方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案来实现：

一种基于等离子体增强电化学反应的循环肿瘤细胞检测方法，将金星/适体/玻碳电极浸置在待测循环肿瘤细胞溶液中，在光照条件下通过检测电化学信号实现对循环肿瘤细胞溶液浓度的检测。

上述方法的检测原理是：由于捕获的循环肿瘤细胞覆盖了部分金星纳米粒子，影响了金星纳米粒子的lspr增强电化学反应的能力，由此产生新的电化学信号。

进一步地，所述金星/适体/玻碳电极是先在玻碳电极表面修饰一层金星纳米粒子，再在金星纳米粒子表面修饰适体探针分子sgc8c后得到。

进一步地，所述检测电化学信号是在抗坏血酸溶液中进行。

进一步地，所述抗坏血酸溶液浓度为1mm。

进一步地，所述光照条件为808nm、200mw/cm²。

与现有的循环肿瘤细胞的检测技术相比，本发明有以下优点：

（1）检测装置制作简便，成本低。

（2）金纳米离子的lspr增强电化学反应的特点使检测灵敏度大大提高。

（3）电化学技术的引入，使得细胞的检测限大大降低。

（4）该法是一种简单、快速、高效、准确、无标记的检测循环肿瘤细胞的方法。

附图说明

图1为本发明的电极修饰过程和检测机理示意图。

图2为实施例1中金星/适体/玻碳电极的tem和sem表征图。

图3为实施1中金星的液体紫外表征图。

图4为实施例1中不同电极光照和不光照的电化学循环伏安图。

图5为实施例1中电极修饰过程的电化学阻抗图谱，a为玻碳电极、b为金星/玻碳电极、c为适体/金星/玻碳电极、d为6-巯基-1-己醇/适体/金星/玻碳电极、e为捕获细胞后的电极。

图6为实施例1中电极捕获细胞前循环伏安图和捕获细胞后光照/不光照的循环伏安图，a为捕获细胞前，b为捕获细胞后，c为捕获细胞后808nm、200mw/cm²光照。

图7为实施例1中电极修饰和细胞捕获后的时间-电流曲线，a为金星/玻碳电极，b为适体/金星/玻碳电极，c为6-巯基-1-己醇/适体/金星/玻碳电极，d为捕获细胞后的电极。

图8为实施例1中不同浓度的ccrf-cem细胞检测结果，a为不同浓度细胞的电流-时间电化学图，b为不同浓度细胞和电流的线性关系图，a-g分别代表的细胞浓度为0、5、50、1×10²、1×10³、1×10⁴、1×10⁵cells/ml。

图9为实施例2中特异性捕获ccrf-cem的细胞结果，a为不同类型细胞的电流-时间电化学图，b为不同类型细胞的电流值对比图。

图10为实施例3中血样中细胞检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

本发明公开了一种基于等离子体增强电化学反应的循环肿瘤细胞检测方法，具体是先将金星/适体/玻碳电极浸置在待测循环肿瘤细胞溶液中捕获循环肿瘤细胞，然后在抗坏血酸溶液中通过检测电化学信号实现对循环肿瘤细胞溶液浓度的检测。电极修饰和检测机理如图1所示。

实施例1

（1）电极修饰。

首先用0.05μm氧化铝粉抛光玻碳电极（直径3mm），在乙醇和水中进行超声处理。氮气吹干电极表面后，将5μl金星滴在预处理的玻碳电极上，然后将nafion（5μl，0.05%乙醇）滴在电极表面以完全覆盖催化剂，形成金星/玻碳电极。然后将10μlsgc8c适体（10μm）滴在金星修饰的玻碳电极上，在4℃冰箱中孵育过夜。然后用pbs(ph7.4)冲洗电极，再用100μl6-巯基-1-己醇mch(100nm)浸泡30分钟，目的是阻断电极表面的非特异性结合位点，和控制适体的取向和空间分布。制得金星/适体/玻碳电极。

（2）细胞捕获和检测。为了细胞捕获，将制备好的金星/适体/玻碳电极浸泡在1mlccrf-cem细胞悬浮液中，在37℃下孵育45分钟。由于金星可以催化抗坏血酸得到电化学信号，所以在1mm的抗坏血酸中记录电流响应。不同浓度细胞捕获后用808nm（200mw/cm²）的光照记录电化学信号的变化。

从图2的tem和sem表征可以看出，具有尖端的星状金星纳米粒子成功合成。由于高长径比使尖端的低能等离子体模式局域化，在近红外区形成一个主要的lspr带，图3的紫外-可见光吸收峰在约767nm，确证了金星的成功合成。为了证实在玻碳电极上成功地修饰了金星，研究了金星对抗坏血酸的电催化作用。如图4所示，金星/玻碳电极对抗坏血酸在黑暗中的电化学氧化显示出一个明确的阳极峰和较高的电流值。相比之下，裸玻碳电极在黑暗中对抗坏血酸氧化没有明显的电化学反应。结果表明，在玻碳电极上成功地对金星进行了修饰。更重要的是，在808nm光源照射金星/玻碳电极后，电流响应明显增强，而裸玻碳电极上没有明显变化。这种现象是已经报道的dpee机制引起的。

采用电化学阻抗谱（eis）的方法证明逐步修饰过程。阻抗谱包括半圆部分和线性部分。半圆部分与高频电子转移限制过程有关。线性部分对应于低频下溶液中的扩散限制过程。电极界面的电荷转移电阻（rct）等于高频区的半圆直径。从图5可以看出，修饰金星后，rct比裸玻碳电极小，这是由于金星使电极导电性增加，证明金星成功修饰。修饰适体和mch后，rct逐渐增大，这是由于二者修饰在金星表面，减小了金星的导电性。当捕获细胞后，rct增大的非常明显，这是由于细胞体积比较大，覆盖在金星表面，导致导电性大大降低。这说明细胞成功捕获。

将适体/金星/玻碳电极与ctc在pbs中孵育后，研究细胞捕获前后电极的循环伏安性质。如图6所示，电池捕获后，由于捕获的细胞在电极表面上的空间位阻效应（从曲线a到b的∆i1），电流响应明显减小。然而，在光照下，由于dpee机制（从曲线b到c的∆i2），电流显著增加。增加的电流（∆i2=0.4μa）比减少的电流（∆i1=0.16μa）高出2倍以上，因此可以进行更灵敏的分析。如图7所示，在0.4v（相对于ag/agcl），光照下测电流-时间变化。图7中的曲线（a-d）是不同电极对抗坏血酸氧化的不同电流响应。当光照时，金星/玻碳电极具有最高的电流增强（曲线a，约1.44μa）。当适体和mch修饰在电极表面时，由于空间位阻效应，dpee增强电流略有下降，分别为1.37μa和1.32μa（曲线b，c）。当电极与ccrf-cem细胞（1×10⁵细胞/ml）共孵育45分钟后，电流响应明显下降到0.56μa（曲线d）。由于光辐射的有效热电子转移，金星能显著提高aa电催化的电流响应。在金星表面捕获的细胞将影响到外部电路的热电子传输效率，从而降低电流响应。实验结果证明了基于dpee的ctc无标记检测方法具有可行性。

采用基于dpee的电化学方法对ccrf-cem细胞进行了检测。如图8a所示是捕获不同浓度ctc后的i-t曲线。很明显，由于细胞的空间位阻。光照时改变的电流值与细胞浓度的对数成正比。如图8b所示，线性方程方程为δi（μa）=0.1312lgc+0.09745（δi=i0-i，其中i是不同细胞浓度下的光电流响应，i0是无细胞的光电流响应。c是ccrf-cem细胞的浓度），相关系数为0.999。线性范围为5-1×10⁵细胞/ml。根据3s/m方法（s是空白标准偏差，m是校准曲线的斜率），检测限为5细胞/ml。

实施例2

选择性实验

本实施例的电极修饰制备过程和检测方法同实施例1，其中步骤2中ccrf-cem换成（1）k562细胞（2）raji细胞（3）ccrf-cem、k562和raji三种的混合细胞（mixcture），在其它条件不变情况下，进行电化学检测。

结果如图9所示，从图中不同细胞的电流变化值可以看出，本发明提出的方法对循环肿瘤细胞有高的选择性，可以成功用于超低浓度的循环肿瘤细胞的检测。

实施例3

实际样品中循环肿瘤细胞检测

本实施例的电极修饰制备过程和检测方法同实施例1，其中步骤2中的细胞溶液换为血液中的细胞溶液，在其它条件不变情况下，同样得到电化学信号，将所得样品的电流值与在单纯细胞溶液中检测的值比对，从而对血液中的细胞进行定量的选择性分析。

结果如图10所示，通过实际血液中和单纯细胞溶液中电化学信号的对比可以看出，本发明提出的方法能检测出实际样品中的循环肿瘤细胞。