一种药品中包含多种重酒石酸去甲肾上腺素成分比的检测方法与流程

本发明涉及药品成分检测
技术领域：
，特别是涉及一种药品中包含多种重酒石酸去甲肾上腺素成分比的检测方法。
背景技术：
：在《中国药典》中，公开了重酒石酸去甲肾上腺素的含量的检测方法。但是，其检测方法针对笼统的重酒石酸去甲肾上腺素的含量而言的，并不能区别重酒石酸去甲肾上腺素中，l-型重酒石酸去甲肾上腺素和d-型重酒石酸去甲肾上腺素的成分占比。而经过发明人对具体药物实践研究，发现重酒石酸去甲肾上腺素为l-去甲肾上腺素酒石酸盐一水合物。根据结构式，该产品存在d型对映异构体。l-去甲肾上腺素的血管收缩作用和升压活性作用远远高于其对映异构体d-去甲肾上腺素，同时毒性更低。在d-型重酒石酸去甲肾上腺素(对映异构体),活性成份小；其成分含量相比较l-型重酒石酸去甲肾上腺而言，不能超过5％；否则，便会影响药物活性。对于该问题的研究，在2015年12期《内蒙古石油化工》期刊杂志中，公开了一篇《重酒石酸去甲肾上腺素光学异构体测定方法研究》，其中，涉及了对上述技术问题的研究，并公开了“其结构中含有一个手性碳，因此生产过程中可能有对应体产生，其左旋体为有效成分，右旋体为无效，为提高药物活性，减少副作用，因此需要对药物中的对映体含量进行有效控制”，其内容中所阐述的左旋体即上述l-型重酒石酸去甲肾上腺，而右旋体即上述d-型重酒石酸去甲肾上腺。但是，该《重酒石酸去甲肾上腺素光学异构体测定方法研究》文章中采用了一种正相系统，正相系统主要用于甾醇、类脂化合物、磷脂类化合物、脂肪酸的检测。该正相系统方法的准确度(加样回收率)为92.9％。这对于实际检测的准确度和有效性来说，提出了不小的难度。鉴于此，克服该现有技术所存在的缺陷是本
技术领域：
亟待解决的问题。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是如何在正向系统中，针对多种重酒石酸去甲肾上腺素成分比的检测领域，寻找一种准确度高，且具有高分离度，能够计算出准确成分比的方法。本发明进一步要实现的是，如何在测试出流速与分离度相互关系之后，结合具体的测试应用场景，提供一种智能化的分离操控方法，使得在时间允许的范围内，尽可能实现高的分离度，提高最终成分比计算的精确度。本发明采用如下技术方案：本发明提供了一种药品中包含多种重酒石酸去甲肾上腺素成分比的检测方法，获取待测重酒石酸去甲肾上腺素注射液，作为供试品溶液，方法包括：量取适量所述供试品溶液，注入液相色谱仪，在预设色谱条件下进行检测，并记录色谱图；其中，预设色谱条件包括：缓冲液浓度为：0.01-0.05mol/l磺丁基-β-环糊精，使用磷酸调节ph至3.0±0.05；流动相比例为缓冲液:乙腈处于80:20至98.5:1.5之间；根据色谱图中的d-型重酒石酸去甲肾上腺素峰面积和l-型重酒石酸去甲肾上腺素峰面积，计算得到d-型重酒石酸去甲肾上腺素异构体含量。优选的，在量取适量所述供试品溶液，注入液相色谱仪之前，所述方法还包括：称取预设比例区间的l-型重酒石酸去甲肾上腺对照品和d-型重酒石酸去甲肾上腺素对照品，稀释成系统适用性溶液；量取适量所述系统适用性溶液，注入液相色谱仪，完成所述液相色谱仪的验证；在验证通过时进行后续的，所述量取适量所述供试品溶液，注入液相色谱仪。优选的，称取预设比例区间的l-型重酒石酸去甲肾上腺对照品和d-型重酒石酸去甲肾上腺素对照品，具体为：称取l-型重酒石酸去甲肾上腺对照品xmg和d-型重酒石酸去甲肾上腺素对照品ymg，并置于量瓶中，加纯化水稀释至50ml刻度，作为系统适用性溶液；其中，l-型重酒石酸去甲肾上腺对照品和d-型重酒石酸去甲肾上腺素对照品的配比x:y位于90:10-99:1之间。优选的，所述根据色谱图中的d-型重酒石酸去甲肾上腺素峰面积和l-型重酒石酸去甲肾上腺素峰面积，计算得到d-型重酒石酸去甲肾上腺素异构体含量，具体包括：根据计算公式：d-型重酒石酸去甲肾上腺素异构体含量＝ad/(ad+al)*100％，计算得到供试品溶液中d-型重酒石酸去甲肾上腺素异构体含量；其中，式中ad为供试品溶液中d-型重酒石酸去甲肾上腺素峰面积；al为供试品溶液中l-型重酒石酸去甲肾上腺素峰面积。优选的，预设色谱条件还包括：液相色谱仪的检测波长为：280nm；检测器为：紫外检测器；进样量为：所述系统适用性溶液和所述供试品溶液各10μl；柱温为：15-20℃；流速为：0.4-0.5ml/min。优选的，预设色谱条件具体为：缓冲液浓度为：0.03mol/l磺丁基-β-环糊精，磷酸调节ph至3.0；水相为：流动相比例为缓冲液:乙腈等于98.5：1.5；液相色谱仪的检测波长为：280nm；检测器为：紫外检测器；进样量为：所述系统适用性溶液和所述供试品溶液各10μl；柱温为：15℃；流速为：0.4ml/min。优选的，所述预设色谱条件还包括：色谱柱具体为c18柱，长度为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm。优选的，所述c18柱的型号具体为安捷伦的xdb-c18或者岛津的ods-3。优选的，所述在预设色谱条件下进行检测，并记录色谱图，具体包括：液相色谱仪的输入端获取相应检测时间参数；所述液相色谱仪根据历史导入的流速、主峰保留时间和分离度对应关系，选择与所述检测时间相匹配的流速进行检测，并记录相应流速检测结果得到的色谱图。优选的，在缓冲液浓度为：0.03mol/l磺丁基-β-环糊精，磷酸调节ph至3.0；水相为：流动相比例为缓冲液:乙腈等于98.5：1.5；液相色谱仪的检测波长为：280nm；检测器为：紫外检测器；进样量为：所述系统适用性溶液和所述供试品溶液各10μl；柱温为：15℃；所述流速、主峰保留时间和分离度对应关系，包括：流速为0.5ml/min时，主峰保留时间为13.250min，分离度为1.56；流速为0.4ml/min时，主峰保留时间为15.800min，分离度为1.67；流速为0.2ml/min时，主峰保留时间为47.157min，分离度为1.76。本发明的准确度(加样回收率)能够达到100％，并且，本发明实际操作中，能够获取到1.67的分离度，相比较现有技术有了进一步的改进，能够进一步提高计算成分比时的准确度。【附图说明】为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明实施例提供的一种药品中包含多种重酒石酸去甲肾上腺素成分比的检测方法流程示意图；图2是本发明实施例提供的另一种药品中包含多种重酒石酸去甲肾上腺素成分比的检测方法流程示意图；图3是本发明实施例提供的一种智能化的药品中包含多种重酒石酸去甲肾上腺素成分比的检测方法的流程示意图。【具体实施方式】为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。实施例1:本发明实施例1提供了一种药品中包含多种重酒石酸去甲肾上腺素成分比的检测方法，获取待测重酒石酸去甲肾上腺素注射液，作为供试品溶液，方法包括：在步骤202中，量取适量所述供试品溶液，注入液相色谱仪，在预设色谱条件下进行检测，并记录色谱图。其中，预设色谱条件包括缓冲液浓度为：0.01-0.05mol/l磺丁基-β-环糊精，使用磷酸调节ph至3.0±0.05；流动相比例为缓冲液:乙腈处于80:20至98.5:1.5之间。其中，所述系统适用性溶液是作为验证液相色谱仪工作状态正常使用，并且，在根据所述系统适用性溶液，能够得到预期的色谱图情况下(包括观察到目标成分的波峰，以及相应波峰之间分离度等等)，再将所述供试品溶液注入到所述液相色谱仪进行检测。在步骤203中，根据色谱图中的d-型重酒石酸去甲肾上腺素峰面积和l-型重酒石酸去甲肾上腺素峰面积，计算得到d-型重酒石酸去甲肾上腺素异构体含量。具体的，根据计算公式：d-型重酒石酸去甲肾上腺素异构体含量＝ad/(ad+al)*100％，计算得到供试品溶液中d-型重酒石酸去甲肾上腺素异构体含量；其中，式中ad为供试品溶液中d-型重酒石酸去甲肾上腺素峰面积；al为供试品溶液中l-型重酒石酸去甲肾上腺素峰面积。本发明实施例的准确度(加样回收率)能够达到100％(本发明实施例将单独通过实施例5进行相应加样回收率的实验证实)，并且，本发明实施例在实际操作中，能够获取到1.67的分离度，相比较现有技术有了进一步的改进，能够进一步提高计算成分比时的准确度。在本发明实施例具体实现过程中，为了保证对供试品溶液的有效检测，通常会在将所述供试品溶液注入液相色谱仪之前，做一轮或者多轮系统适用性溶液的检测，其目的是为了验证液相色谱仪的有效性；例如：液相色谱仪中的色柱是否有问题、各管道连接是否可能有问题等等。因此，如图2所示，在步骤202之前还包括步骤201，具体如下：在步骤201中，称取预设比例区间的l-型重酒石酸去甲肾上腺对照品和d-型重酒石酸去甲肾上腺素对照品，稀释成系统适用性溶液。其中，称取l-型重酒石酸去甲肾上腺对照品xmg和d-型重酒石酸去甲肾上腺素对照品ymg，并置于量瓶中，加纯化水稀释至指定刻度，作为系统适用性溶液；其中，l-型重酒石酸去甲肾上腺对照品和d-型重酒石酸去甲肾上腺素对照品的配比x:y位于90:10-99:1之间。例如：称取l-型重酒石酸去甲肾上腺对照品100mg和d-型重酒石酸去甲肾上腺素对照品5mg，并置于量瓶中，加纯化水稀释至50ml刻度，作为系统适用性溶液。相应的再执行步骤202时，也会有相应的调整，如图2所示，被描述为：量取适量所述系统适用性溶液和所述供试品溶液，注入液相色谱仪。而相应的注入先后顺序以及原理详见上文分析，在此不再赘述。在本发明实施例中，对于预设色谱条件除了上述缓冲液浓度的选择外，通常还包括流动相、检测波长、检测器、进样量、柱温度、流速等关联因素的限定，在本发明实施例中也提供一组优选参数组合，具体为：流动相比例为缓冲液:乙腈处于80:20至98.5:1.5之间；液相色谱仪的检测波长为：280nm；检测器为：紫外检测器；进样量为：所述系统适用性溶液和所述供试品溶液各10μl；柱温为：15-20℃；流速为：0.4-0.5ml/min。在本发明实施例中，在所述预设色谱条件中，还涉及对色谱柱的选定，具体包括：色谱柱具体为c18柱，长度为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm。例如，所述c18柱的型号具体为安捷伦的xdb-c18或者岛津的ods-3。实施例2：在具体实现过程中，发明人通过实践和理论分析，找到了一组最优的预设色谱条件参数组合，其不仅综合考虑检测所要花费的时间，还考虑了分离度，以及相应专属性、精密度(重复性及中间精密度)、回收率、线性、定量限、检测限、耐用性和溶液稳定性情况下得到，具体为：缓冲液浓度为：0.03mol/l磺丁基-β-环糊精，磷酸调节ph至3.0；水相为：流动相比例为缓冲液:乙腈等于98.5：1.5；液相色谱仪的检测波长为：280nm；检测器为：紫外检测器；进样量为：所述系统适用性溶液和所述供试品溶液各10μl；柱温为：15℃；流速为：0.4ml/min；色谱柱选择安捷伦xdb-c184.6×250mm，5μm。通过本发明实施例上述的最优预设色谱条件参数组合，能够获取到1.67的分离度，相比较现有技术有了进一步的改进。接下来，将通过实施例3具体阐述，如何得到本发明实施例的最优配置参数。实施例3：在本发明实施例3中，将通过多组有效的实验测试，来论证本发明上述实施例2的最优预设色谱条件参数组合的选定，重酒石酸去甲肾上腺素注射液异构体检测方法的建立与优化过程如下所述：在确定检查方法为高效液相色谱法情况下，设定最初检测方法中的相关预设色谱条件参数组合：色谱柱：c18柱(250×4.6mm，5μm)；检测波长：280nm；柱温：15℃；流动相：水相(10mmol/l磷酸二氢钠缓冲液、10mmol/l磺丁基-β-环糊精，磷酸调节ph至3.0)：乙腈(98.5:1.5)等度洗脱；流速：0.5ml/min；进样量：所述系统适用性溶液和所述供试品溶液各10μl；下面的各参数项的调整测试，都是基于上述最初检测方法中的相关预设色谱条件参数组合而进行的，即后续过程中选择调整哪一项进行测试，其他参数项就仍然以上述最初检测方法中的相关预设色谱条件参数组合进行设置。本发明实施例中所涉及的参数项的调整测试，包括色谱柱、柱温、流动相比例、缓冲液浓度和流速，逐一阐述如下：1、色谱柱的选择采用不同品牌色谱柱对供试品溶液进行检测，结果见下表。重酒石酸去甲肾上腺素注射液异构体检测色谱柱筛选结果：由上表可知更换色谱柱对分离度无影响，但岛津的色谱柱出峰时间太长，故在本发明实施例的最优实现方案中，选择安捷伦为异构体检测色谱柱。2、柱温的选择采用不同柱温对供试品溶液进行检测，结果见下表。重酒石酸去甲肾上腺素注射液异构体检测柱温、流速筛选结果流速(ml/min)柱温(℃)流动相比例分离度0.51098.5：1.51.420.51598.5：1.51.380.53098.5：1.5n.a.(分不开)由上表可知降低柱温可以有效的提高分离度，但柱温与环境温度相差太大，柱温箱控温效果不明显，故选择15℃作为异构体检测柱温。3、流动相比例的选择采用不同比例流动相对供试品溶液进行检测，结果见下表。重酒石酸去甲肾上腺素注射液异构体检测流动相比例筛选结果流速(ml/min)柱温(℃)流动相比例分离度0.51599.0:1.01.370.51598.5：1.51.380.51580：201.100.51560：40n.a.由上表可知增加水相比例不能有效的提高分离度，水相比例增加到99.0％时，对分离度影响不大，故选择水相：乙腈为98.5：1.5作为本发明实施例2中的最优预设色谱条件中的异构体检测流动相比例。4.缓冲液浓度的选择重酒石酸去甲肾上腺素注射液异构体检测缓冲液浓度筛选结果如下：流速(ml/min)柱温(℃)磷酸二氢钠(mmol/l)磺丁基-β-环糊精(mmol/l)分离度0.51520101.300.51510101.360.5155101.400.5150101.480.5150301.560.5150501.38由上表可知降低磷酸二氢钠浓度至0mmol/l、增加磺丁基-β-环糊精浓度，分离度先增大后减小，故选择30mmol/l磺丁基-β-环糊精作为异构体检测缓冲液浓度。5.流速的选择重酒石酸去甲肾上腺素注射液异构体检测流速筛选结果：由上表可知降低流速能有效的提高分离度，但流速降低会延长运行时间，降低样品检验效率，故选择0.4ml/min作为实施例2中最优的预设色谱条件中的异构体检测流速。通过上述各参数项的调整测试，总结得到了在本发明实施例2中所采用的最优配置方案：色谱柱：c18柱(250×4.6mm，5μm)，具体采用agilentxdb-c18；检测波长：280nm；柱温：15℃；流动相：水相：乙腈为98.5:1.5，等度洗脱；其中，水相为30mmol/l磺丁基-β-环糊精，磷酸调节ph至3.0；进样量为：所述系统适用性溶液和所述供试品溶液各10μl；流速：0.4ml/min；进样量：10μl。实施例4：基于本发明在实施例3中给予的一系列测试实验数据中的论证和分析，本发明实施例还针对液相色谱仪的使用提出了一种可选的改进方案，能够灵活的根据实际测试条件，选择最优的参数性能，从而在同样满足测试条件要求的情况下，得到更为准确的测试数据。所述在预设色谱条件下进行检测，并记录色谱图，如图1所示，具体包括：在步骤301中，液相色谱仪的输入端获取相应检测时间参数。其中，检测时间是根据操作人员的自身的时间表安排进行操作的，例如：若操作人员对于本轮检测的结果记录速度没有特殊要求的情况下，就可以输入相应宽松的检测时间参数；若操作人员急需导出检测结果，则相应的可以输入更小的检测时间参数。在步骤302中，所述液相色谱仪根据历史导入的流速、主峰保留时间和分离度对应关系，选择与所述检测时间相匹配的流速进行检测。这里所述描述的历史导入的流速、主峰保留时间和分离度对应关系，可以是在实施例3中测试实验得到的。具体在缓冲液浓度为：0.03mol/l磺丁基-β-环糊精，磷酸调节ph至3.0；水相为：流动相比例为缓冲液:乙腈等于98.5：1.5；液相色谱仪的检测波长为：280nm；检测器为：紫外检测器；进样量为：所述系统适用性溶液和所述供试品溶液各10μl；柱温为：15℃；所述流速、主峰保留时间和分离度对应关系，包括：流速为0.5ml/min时，主峰保留时间为13.250min，分离度为1.56；流速为0.4ml/min时，主峰保留时间为15.800min，分离度为1.67；流速为0.2ml/min时，主峰保留时间为47.157min，分离度为1.76。需要强调的是，具体实现过程中上述对应关系可能远不止上述三组数据，因此，上述三组对应关系仅仅是为了示例性表现罗列在此处，并不存在对应关系数量上的限定作用。在步骤303中，记录相应流速检测结果得到的色谱图。优选的，在相应的检测结果中会标注有本轮检测的各参数配置项的具体内容。本发明实施例相比较现有技术中常规的液相色谱仪采用一种用户导入固定参数值，并严格按照固定参数值进行操作的实现方法而言；能够更有效的利用用户导出检测结果的时间需求上的灵活性，在最终检测结果准确度和耗时方面取得了动态的优化。并且，在优选的实现方案中，本发明实施例的步骤301-303可以是通过在界面上设置勾选项来执行，即若勾选了该操作项，即采用本发明实施例步骤301-303进行检测；而若未勾选该操作项，则仍然按照现有的固定参数配置方式执行，从而实现了与现有操作方式兼容的特性。在具体操作中，以上述三组数据为例，例如：用户输入需要完成检测时间为1小时，则液相色谱仪会根据其历史存储有的对应关系数据中，选择主峰保留时间处于所述完成检测时间为1小时内，分离度最高的一组对应关系，最终选择结果为上述的流速为0.2ml/min。实施例5：本发明实施例具体是用于论证实施例1中的预设色谱条件能够达到其有益效果中所述的100％回收率效果，即称取了多少量的d-重酒石酸去甲肾上腺素对照品，在最终的测试实验结果中同样能够测量出相应含量的d-重酒石酸去甲肾上腺素。而本发明实施例主要是针对实施例1中所提出的预设色谱条件进行测试，在具体实现过程中，直接采用实施例3所述的参数值配比进行操作。系统适用性溶液：称取d-重酒石酸去甲肾上腺素对照品2mg与l-重酒石酸去甲肾上腺素对照品100mg，置于50ml容量瓶中，加水使溶解，稀释定容至刻度，作为系统适用性溶液。d-重酒石酸去甲肾上腺素准确度对照品储备液：精密称取d-重酒石酸去甲肾上腺素对照品10.19mg、10.25mg、10.31mg分别置三个10ml容量瓶中，加水使溶解，稀释定容至刻度，摇匀，作为d-重酒石酸去甲肾上腺素准确度对照品储备液(1)、(2)、(3)。l-重酒石酸去甲肾上腺素准确度对照品储备液：精密称取l-重酒石酸去甲肾上腺素对照品190.65mg，置10ml容量瓶中，加水使溶解，稀释定容至刻度，摇匀，作为l-重酒石酸去甲肾上腺素准确度对照储备液。对照品溶液：分别精密量取d-重酒石酸去甲肾上腺素准确度对照品储备液(1)、(2)1.0ml，置两个10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液(1)和对照品溶液(2)。本底溶液：精密量取l-重酒石酸去甲肾上腺素准确度对照储备液1.0ml，置10ml容量瓶中，加水使稀释至刻度线，摇匀，作为本底溶液。50％准确度溶液：量取d-重酒石酸去甲肾上腺素准确度对照储备液(1)0.5ml，置10ml容量瓶中，量取l-重酒石酸去甲肾上腺素准确度对照储备液1.0ml，加空白辅料溶液稀释定容，作为50％准确度溶液(平行配制3份)。100％准确度溶液：量取d-重酒石酸去甲肾上腺素准确度对照储备液(2)1.0ml，置10ml容量瓶中，量取l-重酒石酸去甲肾上腺素准确度对照储备液1.0ml，加空白辅料溶液稀释定容，作为100％准确度溶液(平行配制3份)。150％准确度溶液：量取d-重酒石酸去甲肾上腺素准确度对照储备液(3)1.5ml，置10ml容量瓶中，量取l-重酒石酸去甲肾上腺素准确度对照储备液1.0ml，加空白辅料溶液稀释定容，作为150％准确度溶液(平行配制3份)。依次精密量取系统适用性溶液、本底溶液、对照品溶液、准确度溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12