三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统及使用方法与流程

本发明属于原子光谱与质谱检测设备和分析技术领域，特别涉及三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统及使用方法。

背景技术：

电感耦合等离子体质谱仪(inductivelycoupledplasmamassspectrometry，icpms)是一种公认的最强有力的痕量元素分析技术，目前已经广泛应用于材料、环境、食品、医药等领域的痕量元素的分析。它具有对多元素的高选择性、高灵敏度，极低的检出限，极宽的线性动态范围，谱线简单干扰少，分析速度快，以及与结构无关、与其它方法联用可广泛应用于生物样品检测的特性，并能得到准确的定性定量的结果。纳米粒子/单细胞分析是近年来一个重要的研究领域，电感耦合等离子体质谱仪由于其出色的痕量元素分析能力，在纳米粒子/单细胞检测方面起到了关键性作用。近些年来金属纳米粒子，特别是功能化的金属纳米粒子广泛应用于生物成像、胞内传感、疾病治疗等方向，但对于其在细胞内的积累、分布与异质性情况鲜有报道。因此设计一种高通高效的单细胞分析系统对于检测纳米粒子尺寸大小以及阐明纳米粒子在细胞或生物体内的分布状况非常重要。

目前，基于电感耦合等离子体质谱仪的单细胞检测方法有以下几种方式：1.细胞悬浮液直接进样；2.液滴式进样，包括喷射打印式和微流控液滴封装式进样；3.激光剥蚀进样。而纳米粒子的检测大多基于悬浮溶液直接进样。

悬浮液直接进样是将均均分散的纳米粒子/消化下来的细胞稀释到一定浓度，根据进样效率和概率计算，使得在电感耦合等离子体质谱仪的一个驻留时间内，有且只有一个纳米粒子/细胞能被检测到，从而实现纳米粒子/单细胞的直接检测。但是，悬浮液中纳米粒子/细胞是随机分布的，而且气动雾化系统中气溶胶的产生也是随机的，根据泊松分布公式可以计算出两个细胞被同时检测到的概率比较大，因此多纳米粒子/多细胞事件发生概率加大，这对纳米粒子/单细胞检测是不利的。

液滴式进样原则上是将细胞与细胞之间间隔开来，以大大降低多细胞检测概率。目前报道的基于液滴式进样的方式大体有两种，一种是基于喷射打印装置，由于进样管尖端的压电结构，在脉冲电的作用下，使连续的液流分裂成皮升级液滴，在优化的细胞密度等条件下，可以实现单细胞的液滴封装。在经过特殊设计的接口，可以实现基于电感耦合等离子体质谱仪的单细胞检测。虽然这种方式具有高精确度，但是检测效率极低，同样，该装置成本以及维护费用较高，不适用于广泛应用。另一种基于微流控芯片的液滴封装系统，增加了检测效率，降低了使用成本，但是由于微流控本身存在的问题，例如采用了油水两相溶液，会极大的干扰检测的稳定性，重现性差，压力耐受性差，以及表面性质等问题，制约了其进一步的应用。

技术实现要素：

针对现有纳米粒子/单细胞电感耦合等离子体质谱仪检测技术中存在的问题，本发明提供一种三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统及使用方法；并建立三维螺旋聚焦系统与电感耦合等离子体质谱仪联用对纳米粒子/单细胞进行检测的分析方法；适用于纳米粒子/单细胞的高通量电感耦合等离子体质谱分析；该三维螺旋聚焦系统采用不同内径的毛细管和不同外径的圆柱，根据流体动力学二次流原理，构建有序三维螺旋结构，并设计与之相匹配的高效雾化系统与电感耦合等离子体质谱仪联用，实现对纳米粒子/单细胞高通量高效率的分析检测。该装置具有组装容易，高压稳定，可控性好，无需单独接口设计等优点。纳米粒子/细胞悬浮液由注射泵直接引入三维螺旋通道中，纳米粒子/单细胞在通道中有序聚焦并排列，最终通过雾化系统将产生的含有单纳米粒子/单细胞的气溶胶引入电感耦合等离子体质谱仪检测。在优化的条件下，保证了纳米粒子/单细胞的高效聚焦和高通量检测。基于开发的适于纳米粒子/单细胞电感耦合等离子体质谱分析的三维螺旋聚焦系统，我们实现了稳定的高通量和高效率的的纳米粒子/单细胞分析，该方法可用于纳米粒子/单细胞水平下检测纳米粒子尺寸分布/细胞内化学元素或纳米粒子的含量及其分布情况。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统，包括微量注射泵和毛细管，所述毛细管缠绕于圆柱体上形成三维螺旋结构，且圆柱体安装于玻璃平台上，毛细管入口与微量注射泵出口端相连，毛细管的出口段经打磨及内外表面疏水化处理后作为雾化器中心管溶液通道同心安装于雾化器内腔，与雾化器一同组成高效雾化器，且高效雾化器出口端穿入雾化室基座后同心嵌套于直通型小体积雾化室进口端，直通型小体积雾化室进口端同心安装于雾化室基座内腔，雾化室基座上设置有辅助气入口，直通型小体积雾化室的外侧壁前端设置有排废口，直通型小体积雾化室出口端为球型接口，且出口端与电感耦合等离子体质谱仪的进样口相连，所述高效雾化器外壁设置有载气入口。

所述毛细管内径为25～250μm，外径为300～400μm，毛细管缠绕圈数为5～50圈；所述圆柱体外径为50～500mm。

所述毛细管出口端与高效雾化器终端之间的距离为0～4mm，毛细管出口端设置有0°～60°的倒角，所述高效雾化器终端与雾化室基座的锥形孔出口端端面相平，且锥形孔的锥角α角度为30°～60°，直通型小体积雾化室内腔为圆锥形或圆柱形通道，直通型小体积雾化室容积为10～50ml，直通型小体积雾化室内腔的轴向长度与径向有效长度比为(8～4)：(2～1)。

所述电感耦合等离子体质谱仪的功率为1300～1600w。

所述高效雾化器通道经载气入口通入0.8～1.2ml/min的高纯氩气；所述直通型小体积雾化室经辅助气入口通入0.1～0.5ml/min的高纯氩气，氩气的纯度为99.999％。

一种三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统的使用方法，采用三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，制备标准金纳米粒子悬浮液或梯度浓度金溶液：

制备标准金纳米粒子悬浮液，直接稀释高浓度的标准金纳米粒子悬浮液，浓度范围为10～1×10⁷个/ml；

制备梯度浓度金溶液，直接稀释高浓度的标准金溶液至不同的梯度浓度，浓度范围为1nm～1mm；

步骤2，优化金纳米粒子或金溶液的驻留时间：

由于金纳米粒子在电感耦合等离子体质谱仪中所产生的离子羽较小，因此驻留时间按电感耦合等离子体质谱仪所能设置的最小时间来设定；

金溶液的驻留时间按常规方法设置为0.1～1s；常规方法即使用电感耦合等离子质谱仪检测的方法；

步骤3，金纳米粒子悬浮液/金溶液通过三维螺旋结构：

金纳米粒子悬浮液/金溶液通过微量注射泵引入毛细管盘绕形成的三维螺旋结构，并通过微量注射泵逐步增加毛细管内金纳米粒子悬浮液/金溶液的流速，根据流体动力学原理——二次流的作用下，施加于金纳米粒子惯性力逐渐增大，直至金纳米粒子受到的惯性诱导的剪切升力、壁面诱导的剪切升力及二次流带来的迪恩拽力三力达到平衡时，即金纳米粒子聚焦于平衡位置上，实现对金纳米粒子的有效聚焦，获得金纳米粒子列；

通过微量注射泵设定金溶液的流速，使金溶液以相同流速通过三维螺旋结构；

步骤4，金纳米粒子列/金溶液经过高效雾化器中心管溶液通道，在高效雾化器的出口被通过载气入口输出氩气雾化后，进入直通型小体积雾化室；

步骤5，在直通型小体积雾化室中雾化产物随载气氩气和辅助气入口进入的氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪，在步骤2所设驻留时间下的时间分辨模式对物化产物进行检测，获得纳米粒子/金溶液的瞬时信号随时间的响应，根据迭代算法获取有效信号，通过有效信号获取信号强度-频率分布状况，并对频率分布状况进行高斯拟合；

步骤6，计算运输检测效率，对系统进行评价，当运输检测效率高于40％，则说明系统合格；当运输检测效率低于40％，则说明系统评价不合格，调整系统参数至系统合格；

步骤7，按着清洗标准，清洗三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统；

步骤8，制备一定浓度的纳米粒子/单细胞悬浮液，浓度范围为10～1×10⁷个/ml；

步骤9，优化驻留时间，驻留时间小于一个离子羽长度大小加上相邻两个离子羽间距的大小，纳米粒子/单细胞数密度决定产生的两个离子羽之间的间距，纳米粒子/单细胞尺寸大小决定产生的离子羽长度的大小，由于纳米粒子或单细胞在电感耦合等离子体质谱仪中所产生的离子羽大小不同，因此需根据纳米粒子/单细胞数密度、尺寸大小来设置电感耦合等离子体质谱仪的驻留时间；

步骤10，纳米粒子/单细胞悬浮液通过微量注射泵引入毛细管中，并通过微量注射泵逐步增加毛细管内纳米粒子/单细胞悬浮液的流速，根据流体动力学原理——二次流的作用下，施加于金纳米粒子惯性力逐渐增大，直至纳米粒子/单细胞产生的惯性诱导的剪切升力、壁面诱导的剪切升力及二次流带来的迪恩拽力三力达到平衡时，即纳米粒子/单细胞聚焦于平衡位置上，实现对纳米粒子/单细胞的有效聚焦，获得纳米粒子/单细胞列；

步骤11，纳米粒子/单细胞列经过高效雾化器中心管溶液通道，在高效雾化器的出口被氩气雾化，且氩气通过载气入口输出进入高效雾化器；

步骤12，在直通型小体积雾化室中雾化产物随载气氩气和辅助气入口进入的氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪，在时间分辨模式下进行检测获得纳米粒子/单细胞液滴的瞬时信号随时间的响应，根据迭代算法获取有效信号，根据有效信号获取信号强度-频率分布状况，并对频率分布状况进行高斯拟合；

步骤13，按着清洗标准，清洗三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统，如需多次检测，再次进样检测，重复步骤8至步骤12。

步骤6所述的运输检测效率的计算，采用以下两种方案中的一种：

步骤6.1，

方案1，根据电感耦合等离子体质谱仪检测出的金纳米粒子有效信号数量比上所引入的金纳米粒子个数，求得三维螺旋聚焦系统该次检测的运输检测效率；

方案2，通过电感耦合等离子体质谱仪检测出的梯度金溶液的信号值，获得金溶液工作曲线的斜率k1，然后通过电感耦合等离子体质谱仪检测出的不同尺寸标准金纳米粒子悬浮液的高斯拟合数值，获得金纳米粒子工作曲线的斜率k2，k1与k2的比值即为三维螺旋聚焦系统该次检测的运输检测效率；

步骤6.2，当运输检测效率低于40％，则说明系统评价不合格，改变毛细管出口端与高效雾化器终端之间的距离，并改变载气入口及辅助气入口的氩气流速，重复步骤1至步骤7，直至运输检测效率高于40％为止，则说明系统评价合格。

步骤8所述的纳米粒子/单细胞悬浮液为细胞内含化学元素离子或者纳米粒子的细胞悬浮液；

所述细胞内含化学元素离子的细胞悬浮液的制备方法为：

(1)在细胞培养瓶中，通过第一培养基培养细胞至对数生长期，去除第一培养基并用磷酸缓冲溶液清洗三次；

(2)在细胞培养瓶中，换入含有化学元素离子/纳米粒子溶液的第二培养基培养，孵育细胞1～72小时；

(3)将孵育好的细胞从细胞培养瓶中消化/吹打下来，并进行离心清洗，用磷酸缓冲溶液重悬离心产物以制成细胞悬浮液；

(4)使用血球计数板对细胞悬浮液中的细胞进行计数，并用磷酸缓冲溶液稀释至细胞数密度为10～1×10⁷个细胞/ml。

所述的纳米粒子悬浮液的制备方法为：直接稀释高浓度的纳米粒子溶液，使其最终浓度为10～1×10⁷个纳米粒子/ml。

步骤9中所述的驻留时间为0.05ms～10ms。

所述毛细管内溶液的流速为10～500μl/min。

所述清洗标准为：对于纳米粒子/细胞检测时，所测元素基线在60s内所有信号值不大于整体平均值加上3倍的标准偏差；对于溶液检测时，所测元素基线在60s内回归空白水平。

本发明的纳米粒子/单细胞三维螺旋聚焦系统及其在纳米粒子/单细胞检测中的使用方法，与现有技术相比，本发明的优势在于：

1、与传统微液滴发生系统相比，具有结构简单，价格低廉，通量高等特点。

2、与微流控液滴发生系统相比，具有耐高压(可实现更高通量)，无需单独设计相关接口就可直接与电感耦合等离子体质谱仪联用，大大减小了不稳定事件发生的概率，而且无需复杂的溶液，特别是不需要有机溶剂，增加检测的稳定性，减少了仪器损耗。

3、本方法利用二次流原理，使纳米粒子/单细胞在检测之前提前进行有序聚焦排列，同样可以大大减少两个事件背同时检测的概率，提高检测的精确度。

4、采用自行设计的雾化器结构和小体积雾化室，相比于常规雾化器和常规雾化室，有较高的样品检测运输效率。

附图说明

图1为本发明三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统主视图；

图2为微量注射泵与圆柱体部分结构示意图；

图3为本发明高效雾化器与直通型小体积雾化室部分结构示意图；

图4为本发明高效雾化器结构示意图；

1、微量注射泵，2、毛细管，3、玻璃平台，4、圆柱体，5、高效雾化器，6、载气入口，7、雾化室基座，8、辅助气入口，9、直通型小体积雾化室，10、电感耦合等离子体质谱仪，11、排废口，12、雾化器中心管溶液通道，13、雾化器气体通道。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

如图1至图4所示，三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统，包括微量注射泵1和毛细管2，所述毛细管2缠绕于圆柱体4上形成三维螺旋结构，其聚焦原理为粒子在弯曲通道中受到二次流产生的迪恩拽力与流体流动产生的惯性力的共同作用，当两力平衡时，粒子可以被有效聚焦；毛细管2的内径为150μm，外径为360μm，盘绕圈数为10圈，相邻毛细管2的盘绕间距为0mm，圆柱体4外径为20mm，且圆柱体4安装与玻璃平台3上，毛细管2入口与微量注射泵1出口端相连，毛细管2的出口段经打磨及内外表面疏水化处理后作为雾化器中心管溶液通道12同心安装于雾化器内腔，与雾化器一同组成高效雾化器5，且高效雾化器5出口端穿入雾化室基座7后同心嵌套于直通型小体积雾化室9进口端，直通型小体积雾化室9进口端同心安装于雾化室基座7内腔，雾化室基座7上设置有辅助气入口8，直通型小体积雾化室9的外侧壁前端设置有排废口11，直通型小体积雾化室9出口端为球型接口，且出口端与电感耦合等离子体质谱仪10的进样口相连，所述高效雾化器5外壁设置有载气入口6，高纯氩气经载气入口6进入雾化器气体通道13内，微量注射泵1型号为：pump11elite；高效雾化器5型号为：pg500-65qdac。

所述毛细管2出口端与雾化器终端之间的距离为1mm，毛细管2出口端设置有30°的倒角，所述高效雾化器5终端与雾化室基座7的锥形孔出口端端面相平，且锥形孔的锥角α角度为30°，直通型小体积雾化室9内腔为圆锥形通道，直通型小体积雾化室9容积为25ml，直通型小体积雾化室9内腔的轴向长度与最大径向有效长度比为2:1，最大径向有效长度即圆锥形通道的最大内径尺寸。

实施例1

本实施例是对未知尺寸的金纳米粒子进行检测，本实施例中电感耦合等离子体质谱仪10的功率为1500w。

一种三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统的使用方法，采用三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统，包括以下步骤：

步骤1，制备标准金纳米粒子悬浮液，直接用去离子水稀释高浓度的标准金纳米粒子溶液，使其最终浓度为2×10⁵/ml，直径为30nm；

步骤2，优化驻留时间，由于金纳米粒子在电感耦合等离子体质谱仪10中所产生的离子羽较小，因此驻留时间按电感耦合等离子体质谱仪10所能设置的最小时间0.1ms设定；

步骤3，金纳米粒子悬浮液通过微量注射泵1引入毛细管2盘绕形成的三维螺旋结构，并通过微量注射泵1逐步增加毛细管2内金纳米粒子悬浮溶液的流速，根据流体动力学原理——二次流的作用下，施加于金纳米粒子惯性力逐渐增大，当流速为200μl/min时，金纳米粒子受到的惯性诱导的剪切升力、壁面诱导的剪切升力及二次流带来的迪恩拽力三力达到平衡，即金纳米粒子聚焦于平衡位置上，实现对金纳米粒子的有效聚焦，获得金纳米粒子列；

步骤4，金纳米粒子列经过高效雾化器5中心管溶液通道12，在高效雾化器5的出口被通过载气入口6输出的1.10l/min纯度为99.999％氩气雾化，进入直通型小体积雾化室9；

步骤5，在直通型小体积雾化室9中雾化产物12随载气氩气和辅助气入口8进入的浓度为0.15ml/min，纯度为99.999％的氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪10，在0.1ms驻留时间的时间分辨模式下对雾化产物进行检测，以获得金纳米粒子随时间变化的瞬时信号响应，根据迭代算法获取有效信号，根据金的理化性质，可以得到一个金纳米粒子的原子数与响应信号的对应关系；

步骤6，计算运输检测效率，根据步骤5检测出的金纳米粒子有效信号的数量比上所引入的金纳米粒子数，求得三维螺旋聚焦系统检测的运输检测效率为42.3％；

步骤7，清洗三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统，所测元素基线在60s内所有信号值不大于整体平均值加上3倍的标准偏差后，再次检测；

步骤8，制备未知金纳米粒子悬浮液，直接用去离子水稀释高浓度的未知金纳米粒子溶液，使其最终浓度为2×10⁵/ml，约束粒子数的量，避免粒子数量过多影响测量结果；

步骤9，优化驻留时间，由于未知金纳米粒子在电感耦合等离子体质谱仪10中所产生的离子羽较小，因此驻留时间按电感耦合等离子体质谱仪10所能设置的最小时间0.1ms设定；

步骤10，未知金纳米粒子悬浮液通过微量注射泵1引入毛细管2盘绕形成的三维螺旋结构，并通过微量注射泵1逐步增加毛细管2内未知金纳米粒子悬浮溶液的流速，根据流体动力学原理——二次流的作用下，施加于未知金纳米粒子惯性力逐渐增大，当流速为200μl/min时，未知金纳米粒子受到的惯性诱导的剪切升力、壁面诱导的剪切升力及二次流带来的迪恩拽力三力达到平衡，即未知金纳米粒子聚焦于平衡位置上，实现对未知金纳米粒子的有效聚焦，获得未知金纳米粒子列；

步骤11，未知金纳米粒子列经过高效雾化器5中心管溶液通道12，在高效雾化器5的出口被通过载气入口6输出的1.10l/min纯度为99.999％氩气雾化，进入直通型小体积雾化室9；

步骤12，在直通型小体积雾化室9中雾化产物12随载气氩气和辅助气入口8进入的浓度为0.15ml/min，纯度为99.999％的氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪10，在0.1ms驻留时间的时间分辨模式下进行检测以获得未知金纳米粒子随时间变化的瞬时信号响应，根据迭代算法获取有效信号，通过有效信号获取信号强度-频率分布状况，并对频率分布状况进行高斯拟合；根据金的理化性质，再根据获得有效信号的强度与步骤5所得金纳米粒子的原子数与响应信号的对应关系，计算出未知金纳米粒子的原子个数，从而获得未知金纳米粒子的尺寸大小；

步骤13，清洗三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统，所测元素基线在60s内所有信号值不大于整体平均值加上3倍的标准偏差后，再次检测；

实施例2

本实施例是对细胞内含有金纳米粒子的单细胞进行检测，本实施例中电感耦合等离子体质谱仪10的功率为1500w。

一种三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统的使用方法，采用三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统，包括以下步骤：

实施例2计算运输检测效率与实施例1步骤1至步骤7相同，区别之处在于：

步骤8，制备细胞内含有金纳米粒子的单细胞悬浮液：

(1)在细胞培养瓶中，通过第一培养基培养细胞至对数生长期，去除第一培养基并用浓度为0.01mol/lpo4^3-，ph为7.4的磷酸缓冲溶液清洗三次；

(2)在细胞培养瓶中，换入含有浓度为1mmol/l的au原子且直径为25nm的金纳米粒溶液的第二培养基，孵育细胞4小时；

(3)将孵育好的细胞从细胞培养瓶中消化/吹打下来，并进行离心清洗，用磷酸缓冲溶液重悬离心产物以制成细胞悬浮液；

(4)使用血球计数板对细胞悬浮液中的细胞进行计数，并用磷酸缓冲溶液稀释到所需细胞数浓度为2×10⁵cells/ml；

步骤9，优化驻留时间，驻留时间小于一个离子羽长度大小加上相邻两个离子羽间距的大小，细胞数密度决定产生的两个离子羽之间的间距，细胞尺寸大小决定产生的离子羽长度的大小，由于细胞在电感耦合等离子体质谱仪10中所产生的离子羽大小不同，因此根据细胞内含有金纳米粒子的单细胞的细胞数密度和尺寸大小来设置电感耦合等离子体质谱仪10的驻留时间为1ms，又因为在该三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统中，200μl/min流速条件下，细胞与细胞之间平均间距时间为1.5ms，此时有且只有一个细胞能被检测；

步骤10，细胞内含金纳米粒子的单细胞悬浮液通过微量注射泵1引入毛细管2盘绕形成的三维螺旋结构，并通过微量注射泵1逐步增加毛细管2内细胞内含有金纳米粒子的单细胞悬浮液的流速，根据流体动力学原理——二次流的作用下，施加于未知金纳米粒子惯性力逐渐增大，当流速为200μl/min时，细胞内含有金纳米粒子的单细胞受到的惯性诱导的剪切升力、壁面诱导的剪切升力及二次流带来的迪恩拽力三力达到平衡，细胞内含有金纳米粒子的单细胞聚焦于平衡位置上，实现对细胞内含有金纳米粒子的单细胞的有效聚焦，获得细胞内含有金纳米粒子的单细胞列；

步骤11，细胞内含有金纳米粒子的单细胞经过高效雾化器5中心管溶液通道，在高效雾化器5的出口被通过载气入口6输出的浓度为1.10l/min，纯度为99.999％氩气雾化；

步骤12，在直通型小体积雾化室9中雾化产物12随载气氩气和辅助气入口8进入的浓度为0.15ml/min，纯度为99.999％的氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪10，在1ms驻留时间的时间分辨模式下进行检测，可以获得单细胞内金的瞬时信号随时间的响应，根据迭代算法获取有效信号，通过有效信号获取信号强度-频率分布状况，并对频率分布状况进行高斯拟合；根据实施例1步骤5所获金纳米粒子的原子数与金纳米粒子的信号强度之间的关系，计算出单细胞中金纳米粒子的质量和数量，并获得金纳米粒子在细胞亚群中随时间的分布概况；

步骤13，清洗三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统，所测元素基线在60s内所有信号值不大于整体平均值加上3倍的标准偏差后，再次进样检测。

实施例3

本实施例是对单细胞中的镉进行检测，本实施例中电感耦合等离子体质谱仪10的功率为1500w。

一种三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统的使用方法，采用三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统，包括以下步骤：

实施例3计算运输检测效率与实施例1步骤1至步骤7相同，区别之处在于：

步骤8，制备镉的系列标准溶液：

配置镉的大浓度储备液，浓度为1000ng/ml；直接用去离子水稀释梯度稀释镉的储备液，得到镉的系列标准溶液，浓度分别为1，5，10，20，50，100，200，500ng/ml；

步骤9，使用电感耦合等离子体质谱仪10的常规检测方法对镉的系列标准溶液进行检测，驻留时间设置为100ms；

步骤10，镉的标准系列溶液浓度由小到大依次通过微量注射泵1引入毛细管2盘绕形成的三维螺旋结构，流速为200μl/min；

步骤11，镉的标准系列溶液经过高效雾化器5中心管溶液通道，在高效雾化器5的出口被通过载气入口6输出的浓度为1.10l/min，纯度为99.999％氩气雾化；

步骤12，在直通型小体积雾化室9中雾化产物12随载气氩气和辅助气入口8进入的浓度为0.15ml/min，纯度为99.999％的氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪10，在100ms驻留时间的时间分辨模式下进行检测，获得镉的瞬时信号随时间响应，求平均值后可绘制镉的工作曲线；

步骤13，清洗三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统，所测元素基线在60s内回归空白水平，再次进样检测；

步骤14，制备含镉元素细胞的细胞悬浮液：

(1)在细胞培养瓶中，通过第一培养基培养细胞至对数生长期，去除第一培养基并用浓度为0.01mol/lpo4^3-，ph为7.4磷酸缓冲溶液清洗；

(2)在细胞培养瓶中，换入含浓度10～1000ng/ml的镉离子的新鲜培养基孵育4小时；

(3)将孵育好的细胞从细胞培养瓶中消化/吹打下来，并进行离心清洗，用磷酸缓冲溶液重悬离心产物以制成含镉元素细胞的细胞悬浮液；

(4)使用血球计数板对含镉元素细胞的细胞悬浮液中的细胞进行计数，并用磷酸缓冲溶液稀释到所需细胞数浓度为2×10⁵cells/ml；

步骤15，优化驻留时间，驻留时间小于一个离子羽长度大小加上相邻两个离子羽间距的大小，细胞数密度决定产生的两个离子羽之间的间距，细胞尺寸大小决定产生的离子羽长度的大小，由于细胞在电感耦合等离子体质谱仪10中所产生的离子羽大小不同，因此根据含镉元素细胞的细胞数密度和尺寸大小来设置电感耦合等离子体质谱仪10的驻留时间为1ms，细胞与细胞之间平均间距时间为1.5ms，此时有且只有一个细胞能被检测；

步骤16，含镉元素细胞的细胞悬浮液通过微量注射泵1引入毛细管2盘绕形成的三维螺旋结构，并通过微量注射泵1逐步增加毛细管2内含镉元素细胞的细胞悬浮液的流速，根据流体动力学原理——二次流的作用下，施加于含镉元素细胞的惯性力逐渐增大，当流速为200μl/min后，含镉元素的细胞受到的惯性诱导的剪切升力、壁面诱导的剪切升力及二次流带来的迪恩拽力三力达到平衡，含镉元素的细胞聚焦于平衡位置上，实现对单个含镉元素的细胞的有效聚焦，获得含镉元素的单细胞列；

步骤17，含镉元素的单细胞列经过高效雾化器5中心管溶液通道，在高效雾化器5的出口被通过载气入口6输出的浓度为1.10l/min，纯度为99.999％氩气雾化；

步骤18，在直通型小体积雾化室9中雾化产物12随载气氩气和辅助气入口8进入的浓度为0.15ml/min，纯度为99.999％的氩气带动下进入电感耦合等离子体质谱仪10，在1ms驻留时间的时间分辨模式下进行检测，可以获得单细胞内金的瞬时信号随时间响应，根据迭代算法获取有效信号，通过有效信号获取信号强度-频率分布状况，并对频率分布状况进行高斯拟合；根据实步骤12所获得得镉得工作曲线，计算出单细胞中镉的质量和镉在细胞亚群中随时间的分布概况；

步骤19，清洗三维有序螺旋聚焦纳米粒子/单细胞分析系统，所测元素基线在60s内所有信号值不大于整体平均值加上3倍的标准偏差后，再次进样检测。