一种“黄芩加味消毒饮”提取物的薄层层析检测方法与流程

本发明属于中药质量检测技术领域领域，特别涉及一种“黄芩加味消毒饮”提取物的薄层层析检测方法。

背景技术：

五味消毒饮方出自清代吴谦编纂的《医宗金鉴》，处方由金银花、野菊花、蒲公英、紫花地丁、天葵子等五味药材组成，作为传统中药方剂在我国已有数百年的应用历史，为中医治疗疮疔痈肿的常用方剂。随着人们对该方剂的认识加深，近代该方剂及其加减方广泛应用于急性咽炎、扁桃体炎、严重外耳道疖肿等耳鼻喉科感染，眼科的麦粒肿、复发性单纯疱疹性角膜炎、色素膜炎等，外科的体表化脓性疾病、颌面部蜂窝织炎、痤疮等，生殖泌尿科的热淋症、前列腺综合症、老年泌尿系感染等；妇科的慢性盆腔炎、淋菌性阴道炎、带下等，内科治疗疥疮感染性肾炎、急性肾小球肾炎、急性泌尿道感染、大叶性肺炎、上呼吸道感染等。

在研究应用五味消毒饮临床应用经验的基础上，本发明人创制了黄芩加味消毒饮，该方剂组方如下：黄芩、山银花、栀子、野菊花、蒲公英、紫花地丁、薄荷脑。通过多年的应用实践，证明该方剂对急性咽炎、扁桃体炎等上呼吸道感染，对外科的体表化脓性疾病、蜂窝织炎、痤疮等，男性科的前列腺炎等有非常好的疗效，且未见毒副反应。发明人根据临床组方，将组方药材通过科学方法提取，制成便于病人服用和携带的现代口服制剂(如胶囊剂、片剂)，为控制这些制剂的质量，保证临床用药的安全、有效，特建立了黄芩加味消毒饮药材提取物中黄芩、山银花、野菊花的薄层色谱鉴别方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种“黄芩加味消毒饮”提取物的薄层层析检测方法，以便更好的控制该制剂的质量，保证临床用药的安全、有效。

为实现上述目的，本发明提供了一种“黄芩加味消毒饮”提取物的薄层层析检测方法，包括“黄芩加味消毒饮”提取物中野菊花的薄层色谱鉴别方法，所述野菊花的薄层色谱鉴别方法，包括如下步骤：

a1.蒙花苷对照品溶液的配制：精密称取蒙花苷对照品，加甲醇制成浓度为0.5～1mg/ml的蒙花苷对照品溶液；

a2.野菊花对照药材溶液的制备：取野菊花对照药材0.2～0.4g，加甲醇10～20ml，超声处理30～40min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加3～6.5ml甲醇使溶解，作为对照药材溶液；

a3.野菊花供试药材溶液的制备：取野菊花供试药材0.5～0.7g，加甲醇10～20ml，超声处理30～40min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加4～6ml甲醇使溶解，作为供试药材溶液；

a4.黄芩加味消毒饮供试样液的配制：取本品1～3g，加甲醇10～20ml，超声处理30～40min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加5～15ml水溶解，用乙酸乙酯萃取2～3次，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加1～3ml甲醇使溶解，作为黄芩加味消毒饮供试样液；

a5.野菊花阴性对照溶液的制备：取野菊花阴性“黄芩加味消毒饮”提取物1～3g，加甲醇10～20ml，超声处理30～40min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加5～15ml水溶解，用乙酸乙酯萃取2～3次，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加1～3ml甲醇使溶解，作为阴性对照溶液；

a6.薄层层析检查：照《中国药典》薄层色谱法试验，吸取上述溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体积比15:15:6:4:1的乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝溶液，热风吹干，置365nm波长的紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

优选的，上述野菊花的薄层色谱鉴别方法中，步骤a2中取野菊花对照药材0.3g，加甲醇15ml，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇使溶解；

步骤a3中取野菊花供试药材0.6g，加甲醇15ml，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇使溶解；

步骤a4中取本品2g，加15ml甲醇，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加10ml水溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次10ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加2ml甲醇使溶解；

步骤a5中取野菊花阴性“黄芩加味消毒饮”提取物2g，加甲醇15ml，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加10ml水溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次10ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加2ml甲醇使溶解。

进一步，“黄芩加味消毒饮”提取物的薄层层析检测方法还包括黄芩的薄层色谱鉴别方法，所述黄芩的薄层色谱鉴别方法包括如下步骤：

b1.黄芩素、汉黄芩素混合对照品溶液的配制：分别精密称取黄芩素对照品和汉黄芩素对照品，加甲醇制成浓度为0.5～1mg/ml的黄芩素对照品和0.5～1mg/ml的汉黄芩素对照品混合溶液；

b2.黄芩对照药材溶液的制备：取黄芩对照药材0.8～1.2g，加体积比为0.8～3.0:0.5～2.0的乙酸乙酯-甲醇混合溶液25～35ml，加热回流30～60min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加4～6ml甲醇使溶解作为对照药材溶液；

b3.黄芩供试药材溶液的制备：取黄芩供试药材0.8～1.2g，加体积比为0.8～3.0:0.5～2.0的乙酸乙酯-甲醇的混合溶液25～35ml，加热回流30～60min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加4～6ml甲醇使溶解作为供试药材溶液；

b4.黄芩加味消毒饮供试样液的配制：取本品2～4g，加水10～20ml溶解，用乙酸乙酯萃取2～3次，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加2～5ml甲醇使溶解，作为供试样液；

b5.黄芩阴性对照溶液的制备：取黄芩阴性“黄芩加味消毒饮”提取物2～4g，加10～20ml水溶解，用乙酸乙酯萃取2～3次，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加2～5ml甲醇使溶解，作为阴性对照溶液；

b6.薄层层析检查：照《中国药典》薄层色谱法试验，吸取上述混合对照品溶液、供试样液、阴性对照溶液各5μl，对照药材溶液、供试药材溶液各3μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体积比为10:3:1:2的甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，预饱和30～40min后展开，取出，晾干，置365nm波长的紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗色斑点。

优选的，上述黄芩的薄层色谱鉴别方法中，所述步骤b1中对照品混合溶液为1mg/ml的黄芩素对照品和1mg/ml的汉黄芩素对照品混合溶液；

步骤b2中取黄芩对照药材1g，加体积比为3:1的乙酸乙酯-甲醇的混合溶液30ml，加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇；

步骤b3中取黄芩供试药材1g，加体积比为3:1的乙酸乙酯-甲醇的混合溶液30ml，加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加5ml甲醇；

步骤b4中取本品3g，加水15ml溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次15ml，所述甲醇为4ml；

步骤b5中取黄芩阴性“黄芩加味消毒饮”提取物3g，加水15ml溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次15ml，所述甲醇为4ml。

进一步，所述“黄芩加味消毒饮”提取物的薄层层析检测方法还包括山银花的薄层色谱鉴别方法，所述山银花的薄层色谱鉴别方法，包括如下步骤：

c1.绿原酸对照品溶液的配制：精密称取绿原酸对照品，加甲醇制成浓度为0.5～1mg/ml的绿原酸对照品溶液；

c2.山银花对照药材溶液的制备：取山银花对照药材0.1～0.3g，加甲醇2.5～7.5ml放置12～24h，滤过，取滤液作为对照药材溶液；

c3.山银花供试药材溶液的制备：取山银花供试药材0.1～0.3g，加甲醇2.5～7.5ml放置12～24h，滤过，取滤液作为供试药材溶液；

c4.黄芩加味消毒饮供试品样液的配制：取本品0.2～0.4g，加甲醇3～7ml放置12～24h，滤过，取滤液作为供试样液；

c5.山银花阴性对照溶液的制备：取山银花阴性“黄芩加味消毒饮”提取物0.2～0.4g，加甲醇3～7ml放置12～24h，滤过，取滤液作为阴性对照溶液；

c6.薄层层析检查：照《中国药典》薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10ul，分别点于同一硅胶h板上，以体积比为7:3:2.5的乙酸丁酯-甲酸-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm波长的紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

优选的，上述山银花的薄层色谱鉴别方法中，所述步骤c1中绿原酸对照品溶液浓度为1mg/ml；步骤c2中取山银花对照药材0.2g，加5ml甲醇放置12h；步骤c3中取山银花供试药材0.2g，加5ml甲醇放置12h；步骤c4中取本品0.3g，加5ml甲醇放置12h；步骤c5中取山银花阴性“黄芩加味消毒饮”提取物0.3g，加5ml甲醇放置12h。

“黄芩加味消毒饮”提取物的薄层层析检测方法在检测由“黄芩加味消毒饮”提取物制成的颗粒剂、片剂、胶囊剂或液体制剂方面的应用。

本发明提供的“黄芩加味消毒饮”提取物的薄层层析检测方法可以对“黄芩加味消毒饮”提取物中黄芩、山银花和野菊花药材进行鉴别检查，具有专属性，为产品提供可靠、准确且操作简单的质量控制方法，确保产品的质量和疗效，保证患者用药安全。

附图说明

图1实施例1中野菊花薄层色谱结果图；其中，1.蒙花苷对照品；2.野菊花对照药材；3.野菊花供试药材；4.黄芩加味消毒饮；5.野菊花阴性“黄芩加味消毒饮”。

图2实施例1中黄芩薄层色谱结果图；其中，1.黄芩素、汉黄芩素混合对照品；2.黄芩对照药材；3.黄芩供试药材；4.黄芩加味消毒饮；5.黄芩阴性“黄芩加味消毒饮”。

图3实施例1中山银花薄层色谱结果图；其中，1.绿原酸对照品；2.山银花对照药材；3.山银花供试药材；4.黄芩加味消毒饮；5.山银花阴性“黄芩加味消毒饮”。

图4对比例1中野菊花薄层色谱结果图；其中，1.蒙花苷对照品；2.野菊花对照药材；3.野菊花供试药材；4.黄芩加味消毒饮；5.野菊花阴性“黄芩加味消毒饮”。

图5对比例3中山银花薄层色谱结果图；其中，1.山银花阴性“黄芩加味消毒饮”；2.绿原酸对照品；3.山银花对照药材；4.黄芩加味消毒饮。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

以下各实施例中涉及的仪器以及试剂包括：

仪器：万分之一电子分析天平(型号为cp114，奥豪斯仪器上海有限公司)；暗箱式四用紫外分析仪(型号为zf-8，上海嘉鹏科技有限公司)；硅胶h薄层板(批号为20180104，规格100×100mm，青岛海洋化工有限公司)；聚酰胺薄膜(规格10×20cm，购于浙江台州市路桥四甲生化塑料厂)。

试剂：薄层色谱用试剂均为分析纯；水为超纯水。

绿原酸对照品(批号为110821-201615)、黄芩素对照品(批号为111595-201607)、汉黄芩素对照品(批号为111514-201605)、蒙花苷对照品(批号为111528-201710)，对照药材均由中国食品药品检定研究院提供。

黄芩加味消毒饮(批号为201901)，由广西壮族自治区药用植物园工程中心制备。

实施例1

1.1“黄芩加味消毒饮”提取物中野菊花的薄层色谱鉴别方法

蒙花苷对照品溶液的配制：精密称取蒙花苷对照品，加甲醇2ml，制成浓度为0.5mg/ml的蒙花苷对照品溶液；

野菊花对照药材溶液的制备：取野菊花对照药材0.3g，加甲醇15ml，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为对照药材溶液；

野菊花供试药材溶液的制备：取野菊花供试药材0.6g，加甲醇15ml，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为供试药材溶液；

黄芩加味消毒饮供试样液的配制：取本品2g，加甲醇15ml，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加10ml水溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次10ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加2ml甲醇溶解，作为供试样液；

野菊花阴性对照溶液的制备：取野菊花阴性“黄芩加味消毒饮”提取物2g，加甲醇15ml，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加10ml水溶解，用乙酸乙酯萃取2次，每次10ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加2ml甲醇溶解，作为阴性对照溶液；

薄层层析检查：照《中国药典》薄层色谱法试验，取上述溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体积比15:15:6:4:1的乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝溶液，热风吹干，置波长365nm的紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。

1.2“黄芩加味消毒饮”提取物中黄芩的薄层色谱鉴别方法

黄芩素、汉黄芩素混合对照品溶液的配制：分别精密称取黄芩素对照品、汉黄芩素对照品，加甲醇制成浓度为1mg/ml的黄芩素对照品、1mg/ml的汉黄芩素对照品混合溶液；

黄芩对照药材溶液的制备：取黄芩对照药材1g，加体积比为3:1的乙酸乙酯-甲醇的混合溶液30ml，加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，作为对照药材溶液；

黄芩供试药材溶液的制备：取黄芩供试药材1g，加体积比为3:1的乙酸乙酯-甲醇的混合溶液30ml，加热回流30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，取上清液作为供试品溶液；

黄芩加味消毒饮供试样液的配制：取本品3g，加15ml水溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次15ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加4ml甲醇使溶解，作为供试样液；

黄芩阴性对照溶液的制备：取黄芩阴性“黄芩加味消毒饮”提取物3g，加15ml水溶解，用乙酸乙酯萃取3次，每次15ml，合并萃取液，水浴蒸干，残渣加甲醇4ml使溶解，作为阴性对照溶液；

薄层层析检查：照《中国药典》薄层色谱法试验，吸取上述混合对照品溶液、供试样液、阴性对照溶液各5μl，对照药材溶液、供试药材溶液各3μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以体积比10:3:1:2的甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，预饱和30min后展开，取出，晾干，置波长365nm的紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的暗色斑点。

1.3“黄芩加味消毒饮”提取物中山银花的薄层色谱鉴别方法

绿原酸对照品溶液的配制：精密称取绿原酸对照品，加甲醇制成浓度为1mg/ml的绿原酸对照品溶液；

山银花对照药材溶液的制备：取山银花对照药材0.2g，加甲醇5ml放置12h，滤过，取滤液作为对照药材溶液；

山银花供试药材溶液的制备：取山银花供试药材0.2g，加甲醇5ml放置12h，滤过，取滤液作为供试药材溶液；

黄芩加味消毒饮供试样液的配制：取本品0.3g，加甲醇5ml放置12h，滤过，取滤液作为供试样液；

山银花阴性对照溶液的制备：取山银花阴性“黄芩加味消毒饮”提取物0.3g，加甲醇放置12h，滤过，取滤液作为阴性对照溶液；

薄层层析检查：照《中国药典》薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10ul，分别点于同一硅胶h板上，以体积比7:3:2.5的乙酸丁酯-甲酸-水-的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置波长365nm的紫外灯下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。

对比例1

“黄芩加味消毒饮”提取物中野菊花鉴别：供试样液配制：取本品2g，加甲醇15ml，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加2ml甲醇溶解，作为供试样液；阴性对照溶液：取野菊花阴性“黄芩加味消毒饮”提取物2g，甲醇15ml，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加2ml甲醇溶解，作为阴性对照溶液。其它步骤(对照品溶液、对照药材溶液制备、薄层层析试验等)与实施例1中相同。

对黄芩加味消毒饮中野菊花的薄层鉴别结果(图4)显示：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，斑点显色不完整。

对比例2

“黄芩加味消毒饮”提取物中黄芩鉴别：供试样液配制：取本品3g，加15ml水溶解，用正丁醇萃取3次，每次15ml，合并三次萃取液，水浴蒸干，残渣用4ml甲醇溶解，作为供试样液；阴性对照溶液制备：取黄芩加味消毒饮(黄芩阴性)提取物3g，加15ml水溶解，用正丁醇分三次萃取3次，每次15ml，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇4ml使溶解作为阴性对照溶液；其它步骤(对照品溶液、对照药材溶液制备、薄层层析试验等)与实施方式2.1中都相同。

对黄芩加味消毒饮中黄芩的薄层鉴别结果显示：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，斑点显色不明显，而阴性对照液无此斑点。

对比例3

“黄芩加味消毒饮”提取物中山银花鉴别：对照品溶液配制、对照药材溶液制备、供试药材溶液制备、供试样液配制、阴性对照溶液制备、薄层层析试验步骤与实施例1中都相同，区别在于展开剂为体积比为7:2.5:2.5的乙酸丁酯-甲酸-水的上层溶液。

对黄芩加味消毒饮中山银花的薄层鉴别结果(图5)显示：供试品色谱中，展开系统rf值偏低，斑点显色不明显。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。