一种Glypican-3双抗体夹心法检测试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及一种glypican-3双抗体夹心法检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

1996年glypican-3（gpc3）蛋白被研究人员发现，gpc3是glypican家族的一员，其基因定位于人染色体xq26，基因组结构全长大于900kb，是人类基因组中最大的基因之一。其5'端朝向端粒区，3'端朝向中心粒区，由8个外显子和7个内含子组成。启动子区有许多转录因子结合位点。其cdna序列全长为2263bp，1740bp的开放阅读诓编码580个氨基酸。glypican-3的结构具有glypican家族的共同特点，如中央球状结构空间、c端糖胺聚糖侧链连接位点等。

目前glypican-3的检测方法主要有免疫生化法和酶联免疫法，其中免疫生化法操作复杂，对人员的要求较高，且结果不好判断。酶联免疫法相对操作简单，但是现有的试剂盒检测范围小，不能满足临床需求。所以有必要开发更好的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测方便、费用低且检测范围宽的glypican-3双抗体夹心法检测试剂盒以及利用该检测试剂盒进行检测方法。

本发明采用如下技术方案：

一种glypican-3双抗体夹心法检测试剂盒，其包括已包被捕捉抗体的包被微孔板以及偶联有标记酶的血清抗体；所述捕捉抗体为1h5、2d12或3a6；所述血清抗体包括：抗gpc3-p1的血清抗体gpc3-s1、抗gpc3-p2的血清抗体gpc3-s2、抗gpc3-p3的血清抗体gpc3-s3或抗gpc3-p4的血清抗体gpc3-s4；所述gpc3-p1的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述gpc3-p2的氨基酸序列如seqidno.2所示，所述gpc3-p3的氨基酸序列如seqidno.3所示，所述gpc3-p4的氨基酸序列如seqidno.4所示。

当所述捕捉抗体为1h5时，所述血清抗体为gpc3-s1、gpc3-s2或gpc3-s4。

当所述捕捉抗体为2d12时，所述血清抗体为gpc3-s1、gpc3-s3或gpc3-s4。

当所述捕捉抗体为3a6时，所述血清抗体为gpc3-s2或gpc3-s4。

作为优选的，所述捕捉抗体为1h5；所述血清抗体为gpc3-s4。

检测试剂盒中，其还包括洗涤液、显色液、glypican-3标准品以及终止液。

检测试剂盒中，所述洗涤液为0.9%氯化钠溶液。

检测试剂盒中，所述显色液为0.1%3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液。

检测试剂盒中，所述终止液为1摩尔硫酸溶液。

检测试剂盒中，所述标记酶为辣根过氧化物酶。

检测试剂盒中，所述血清抗体通过如下方法制备：

（1）将gpc3-p1、gpc3-p2、gpc3-p3和gpc3-p4分别与牛血清蛋白偶联得到多肽偶联物pc3-p1-bsa、gpc3-p2-bsa、gpc3-p3-bsa和gpc3-p4-bsa；

（2）选取4只2公斤健康新西兰白兔，每个多肽偶联物免疫1只；免疫前每只兔子耳静脉取血清，作为阴性对照；gpc3-p1-bsa、gpc3-p2-bsa、gpc3-p3-bsa、gpc3-p4-bsa分别用生理盐水溶解稀释到浓度为1mg/ml；第一次免疫用弗氏完全佐剂，抗原的剂量为300ug/只，注射方式为背部皮内多点注射；

（3）间隔2周后进行第二次免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂；

（4）共进行5次免疫，最后一次免疫2周后取血测定抗体效价，采集抗血清gpc3-s1、gpc3-s2、gpc3-s3和gpc3-s4。

一种利用上述glypican-3双抗体夹心法检测试剂盒检测glypican-3的方法，其包括如下步骤：

（a）包被微孔板上以5ug/ml浓度包被捕获抗体，封闭，每孔加200ul10%（质量分数）小牛血清（5mg/ml的牛血清白蛋白组分5）作为封闭液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；

（b）加入待测溶液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；

（c）每孔加入100ul的1∶1000血清抗体，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；gpc3-s1和gpc3-s2的效价为1∶7.68×10⁵；gpc3-s3和gpc3-s4的效价为1∶1.53×10⁶；

（d）每孔加入100ul的1∶10000羊抗兔二抗-hrp，37℃放置30min；洗涤，洗涤3次，每次震荡1min，拍干；所述羊抗兔的二抗-hrp的效价为万分之一；

（d）每孔加底物显色液100ul，37℃保温避光反应15min；

（e）每孔加入50ul终止液，终止反应；

（f）用检测波长为450nm的酶标仪读取各孔光密度值。

本发明的有益效果在于：本发明利用制备得到的抗体，采用双抗夹心方法，特异性识别glypican-3，操作简单、检测费用低，对人员的操作要求较低，结果容易判定，同时其检测范围宽，满足临床的需求。

附图说明

图1为双抗夹心法elisa检测试剂盒的检测原理示意图。

图2为捕获抗体为1h5时抗体配对实验结果。

图3为捕获抗体为3a6时抗体配对实验结果。

图4为捕获抗体为2d12时抗体配对实验结果。

图5为捕捉抗体1h5，检测抗体为s4时抗体配对实验结果。

图6为检测标准曲线。

具体实施方式

本发明提供实施例是为了详尽的且完全地公开本发明，并且向所属技术领域的技术人员充分传达本发明的范围。对于表示在附图中的示例性实施方式中的术语并不是对本发明的限定。

实施例1多克隆抗体制备

合成四个多肽分别命名为gpc3-p1、gpc3-p2、gpc3-p3、gpc3-p4，具体序列见表1。

表1选取的表位序列

。

选取4只2公斤健康新西兰白兔，每个多肽偶联物免疫1只。免疫前每只兔子耳静脉取血清，作为阴性对照。上述四个多肽分别与牛血清白蛋白（bsa）偶联后得到多肽偶联物gpc3-p1-bsa、gpc3-p2-bsa、gpc3-p3-bsa和gpc3-p4-bsa分别用生理盐水溶解稀释到浓度为1mg/ml，其具体偶联的方法为公知技术。

第一次免疫用弗氏完全佐剂，抗原的剂量为300ug/只，注射方式为背部皮内多点注射。间隔2周后进行第二次免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂。共进行了5次免疫，最后一次免疫2周后取血测定抗体效价，采集抗血清。抗血清分别命名为gpc3-s1、gpc3-s2、gpc3-s3、gpc3-s4。所述弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均为市售产品。

实施例2多克隆抗体的制备、纯化和效价测定

利用现有成熟的亲和柱层析的方法，对多抗进行纯化。

将实施例1得到的抗血清gpc3-s1、gpc3-s2、gpc3-s3、gpc3-s4进行效价测定，结果如表2所示。

表2兔多抗效价

。

实施例3双抗夹心法elisa检测试剂盒研制

一、第一轮抗体配对实验

本发明的试剂盒采用双抗夹心法（如图1），需要两个能够配对的抗体，故对实施例2得到的4个多抗（gpc3-s1、gpc3-s2、gpc3-s3、gpc3-s4）和3株单抗（1h5、2d12、3a6）进行两两配对实验，以确定最适合的配对组合。

具体步骤为：以5ug/ml浓度包被3株单抗，封闭，每孔加200ul10%小牛血清（市售5mg/ml的牛血清白蛋白组分5）作为封闭液，37℃1h；洗涤（0.9%氯化钠溶液），恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加入50ng/mlglypican-3溶液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；每孔加入100ul的l∶1000稀释的多抗（同时其他孔中加入稀释液作为对照），37℃1h；洗涤，恢复至室温，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；每孔加入100ul的l∶10000稀释的羊抗兔二抗-hrp，37℃放置30min；洗涤，洗涤3次，每次震荡1min，拍干；显色，每孔加底物显色液100ul（0.1%的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液），37℃保温避光反应15min；终止反应，每孔加入50ul终止液（1摩尔硫酸溶液），终止反应；测定od450nm值，用检测波长为450nm的酶标仪读取各孔光密度值。

对现有四株抗体进行两两配对后，结果见图2~图4和表3，从表3中可以看出，gpc3-s4和三株单抗都可以配对，与1h5配对时，od值最高，所以选取这一对进行第二次试验。

表3抗体配对情况表

。

二、第二轮抗体配对实验

对抗体最适配对进行第二次优化。具体步骤为，以5ug/ml浓度包被单抗1h5，封闭，每孔加200ul10%小牛血清作为封闭液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加入20、40、60、80、100ng/mlglypican-3溶液，37℃1h；后续步骤同第一轮抗体配对实验。

第二次配对实验，结果见图5和表2，可以看出，以1h5为捕捉抗体，s4为检测抗体时，检测灵敏度可以低于10ng/ml，到达了市场现有同类产品的检测水平，所以确定该配对组合用于glypican-3检测试剂盒的组装。

表4抗体配对检测结果

。

三、标准曲线绘制

定量分析的主要特征就是建立计量-反应曲线，通过已知浓度的标准物质和相应的反应量建立计量-反应关系。然后，通过待测样品的反应量计算出待测样品的浓度。

具体过程为，以5ug/ml浓度包被抗体，封闭，每孔加200ul10%小牛血清作为封闭液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；加入用glypican-3标准溶液配制的系列浓度抗原液，即0ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、300ng/ml。37℃1h；后续步骤同第一轮抗体配对实验。

采用前述建立的双抗体夹心elisa法重复检测4次，结果表明其具有良好线性关系的检测区间为10～300ng/ml。标准曲线见图6。

实施例4

根据实施例3中提供的检测过程，对随机样品进行了检测，见表5。

表5本发明试剂盒与临床检测结果比较

。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>河北省科学院生物研究所

<120>一种glypican-3双抗体夹心法检测试剂盒及检测方法

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