吩噻嗪类药物的荧光检测方法及应用与流程

本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种吩噻嗪类药物的荧光检测方法及应用。

背景技术：

自1883年德国化学家bemthsen成功发现并合成吩噻嗪以来，吩噻嗪类化合物得到了广泛的应用。盐酸氯丙嗪(chlorpromazinehydrochloride，简称cpz)和奋乃静(perphenazine，简称ppz)是吩噻嗪类的代表性药物，因具有镇定、止吐、降低动物代谢等作用，二者在畜禽生产中有一定的应用，通常会在饲料中进行添加，而其蓄积性残留会对人体健康造成危害。因此，对饲料中添加性药物筛查和分析检测方法的探索越来越重要。

吩噻嗪类药是由硫、氮联结着两个苯环的一种三环结构，基2，10位被不同基团取代，产生荧光的主要是三环共轭的大π体系。

荧光分析法因灵敏度高、操作简便，在吩噻嗪类药物的分析检测中得到了应用。盐酸氯丙嗪和奋乃静因其母核中有吩噻嗪结构，本身有内源荧光，但内源荧光强度较弱，特别是样品中含量低的话，直接进行分析检测很难被检测到，因而，增强检测物的荧光强度有利于吩噻嗪类药物的检测。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种吩噻嗪类药物的荧光检测方法；该方法是在传统的荧光分析方法基础上加以改进，在吩噻嗪类药物中加入色素，形成的络合物荧光强度明显增强，可成功用于吩噻嗪类药物的痕量分析检测。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种吩噻嗪类药物的荧光检测方法，向待测样品的提取液中加入荧光增强剂，调节ph值，使吩噻嗪类药物与荧光增强剂发生络合反应后，进行荧光扫描；将获得的荧光强度导入吩噻嗪类药物的标准工作曲线中，计算获得吩噻嗪类药物在待测样品中的浓度；

所述的荧光增强剂为醌茜素、大黄素中的一种；

所述标准工作曲线是由吩噻嗪类药物的系列浓度梯度的标准工作溶液加入荧光增强剂，调节ph值，使吩噻嗪类药物与荧光增强剂反应络合后，进行荧光扫描；以溶液的浓度c为横坐标，荧光强度f为纵坐标，制作标准工作曲线。

在上述方案的基础上，所述吩噻嗪类药物为盐酸氯丙嗪、奋乃静。

在上述方案的基础上，所述荧光增强剂和吩噻嗪类药物的质量比为1:100～80:100；优选的为20:100。

在上述方案的基础上，吩噻嗪类药物与荧光增强剂络合反应的ph值为2～10，优选的为5～6。

在上述方案的基础上，吩噻嗪类药物与荧光增强剂络合反应的反应时间为0.5～4.0h，优选的为0.5h。

在上述方案的基础上，吩噻嗪类药物与荧光增强剂络合反应的反应温度为20～60℃，优选的为20℃。

在上述方案的基础上，所述吩噻嗪类药物的荧光检测方法，步骤如下：

(1)样品的预处理

称取待测样品5.0g，加入25ml乙醇，磁力搅拌30min，离心，上清液旋蒸至干，用5ml乙醇溶解残留物，溶液用一次性0.45μm有机滤膜过滤，加入荧光增强剂，调整溶液的ph为5～6的弱酸性环境，20℃下络合反应0.5h，待测；

(2)荧光扫描

进行荧光扫描；将获得的荧光强度导入吩噻嗪类药物的标准工作曲线中，计算获得吩噻嗪类药物在待测样品中的浓度。

在上述方案的基础上，所述标准工作曲线由以下方法制得：

取不同体积的吩噻嗪类药物的储备液，依次配制成系列浓度分别为0.5、2.0、5.0、10.0、20.0μg/ml的标准溶液，加入荧光增强剂，调整溶液的ph为5～6，20℃下络合反应0.5h，测其荧光强度，以溶液的浓度c为横坐标，荧光强度f为纵坐标，做标准工作曲线。

在上述方案的基础上，所述荧光扫描的参数为：

λex＝258nm，λem＝452nm，扫描范围ex-220～380nm，em-400～550nm，狭缝宽度ex-5nm，em-5nm，扫描速度300nm/min，延迟时间0s，电压400v。

上述检测方法在饲料或药品中吩噻嗪类药物检测中的应用。

本发明的反应机理

吩噻嗪类药物本身有内源荧光，但其内源荧光强度相对较弱。部分色素对物质的荧光强度有着较大的影响，大黄素和醌茜素均具有高共轭双键结构，是良好的π电子受体；作为吩噻嗪类的代表性药物，盐酸氯丙嗪和奋乃静分子结构中的吩噻嗪母核决定了两种分子都具有良好的给电子性，因此吩噻嗪类药物可与大黄素和醌茜素形成络合物使其荧光强度增强，吩噻嗪母核中氮原子的质子化作用可使形成的络合物平面刚性结构更稳定。从分子结构来看，醌茜素分子的平面结构刚性比大黄素更稳定，因而与吩噻嗪类药物分子形成的络合物也更加稳定，对络合物的荧光增敏效果也更明显。

本发明技术方案的优点

①醌茜素对盐酸氯丙嗪和奋乃静等吩噻嗪类药物有明显的荧光增敏作用，可与其形成络合物，络合物的荧光强度增强。

②络合反应的最佳条件为醌茜素和吩噻嗪药物的质量比20:100，ph为5～6的弱酸性环境，20℃下反应0.5h。

③本发明建立了一种在吩噻嗪类药物中加入醌茜素增强其荧光强度以对吩噻嗪类药物进行检测的荧光分析法，该方法简单、快速，可用于饲料和药品中吩噻嗪类药物的含量测定。

附图说明

图1不同激发波长下盐酸氯丙嗪和奋乃静的发射光谱图；

图2盐酸氯丙嗪和奋乃静的激发光谱；

图3醌茜素和盐酸氯丙嗪的质量比对络合物荧光强度的影响；

图4ph对盐酸氯丙嗪-醌茜素络合物荧光强度的影响；

图5反应时间对盐酸氯丙嗪-醌茜素络合物荧光强度的影响；

图6温度对盐酸氯丙嗪-醌茜素络合物荧光强度的影响；

图7盐酸氯丙嗪和奋乃静与不同色素络合的荧光光谱图；

图8市售盐酸氯丙嗪片和盐酸氯丙嗪标准品的荧光光谱对比(曲线1，2分别是市售盐酸氯丙嗪片和盐酸氯丙嗪标准品的荧光光谱曲线)；

图9市售奋乃静片和奋乃静标准品的荧光光谱对比(曲线1，2分别是市售奋乃静片和奋乃静标准品的荧光光谱曲线)。

具体实施方式：

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

1材料与方法

1.1主要仪器与试剂

仪器：f-2500型荧光分光光度计(日本hitachi公司)；gl-12b离心机(上海安亭科学仪器厂)；bp-10酸度计(北京赛多利斯科学仪器有限公司)；ar124cn电子天平(常州奥豪斯仪器有限公司)；re-52aa型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

试剂：盐酸氯丙嗪标准品(批号：100460-200501，中国药品生物制品检定所)；奋乃静标准品(批号：100133-201403，中国食品药品检定检定所)；醌茜素(上海绿鸟科技发展有限公司)；大黄素(瑞迪生物科技有限公司)；色谱乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)；试验用水均为超纯水；市售饲料样品。

分别取盐酸氯丙嗪、奋乃静、醌茜素、大黄素标准品0.0200、0.0200、0.0025、0.0025g，准确称量，用乙醇溶解并定容至50ml棕色容量瓶中，得到浓度分别为0.40、0.40、0.05、0.05mg/ml各标准溶液，作为储备液备用。

试验中数据处理采用origin8.0统计分析软件进行处理和计算，结果以平均值表示。

1.2光谱分析参数和分析测定方法

λex＝258nm，λem＝452nm，扫描范围ex-220～380nm，em-400～550nm，狭缝宽度ex-5nm，em-5nm，扫描速度300nm/min，延迟时间0s，电压400v。

在盐酸氯丙嗪和奋乃静标准溶液加入一定量的醌茜素溶液，使醌茜素和吩噻嗪药物的质量比为20:100，调整溶液的ph为5～6的弱酸性环境，20℃条件下反应0.5h进行荧光扫描。

1.3饲料样品的预处理

市售饲料样品粉碎，称取样品5.0g左右，置于碘量瓶中，加入25ml乙醇，磁力搅拌30min，离心，上清液旋蒸至干，用5ml乙醇溶解烧瓶底部的残留物，溶液用一次性0.45μm有机滤膜过滤，加入醌茜素，调整溶液的ph为5～6的弱酸性环境，20℃下络合反应0.5h，待测。

1.4盐酸氯丙嗪和奋乃静的激发波长与发射波长的确定方法

取一定浓度的盐酸氯丙嗪和奋乃静标准溶液，在不同的激发波长下对其荧光光谱扫描，以确定其荧光发射波长λem；根据得到的λem，对盐酸氯丙嗪和奋乃静进行激发光谱扫描，以确定其荧光发射波长λex。

按照上述步骤进行光谱扫描，不同激发波长下盐酸氯丙嗪和奋乃静的荧光谱图见图1。盐酸氯丙嗪和奋乃静的发射波长λem分别为453nm和454nm，二者基本相同；在不同激发光波长照射下，目标物的荧光强度也各不相同；在得到的发射波长下对盐酸氯丙嗪和奋乃静进行激发光谱扫描，激发光谱图见图2，其激发波长λex均为258nm。

盐酸氯丙嗪和奋乃静的激发光谱图中均有258nm和303(306)nm两个激发峰，在303(306)nm的激发波长下，盐酸氯丙嗪和奋乃静的荧光强度都很弱，故试验选择258nm作为盐酸氯丙嗪和奋乃静的最大激发波长。盐酸氯丙嗪和奋乃静的激发波长和发射波长相同，是因为二者具有相同的吩噻嗪母核结构，只是吩噻嗪环上的n原子所连的基团存在差异，但这两种不同基团对吩噻嗪环的荧光强度没有显著的影响。

1.5盐酸氯丙嗪-醌茜素络合反应影响因素的试验方法

1.5.1络合反应质量比对反应结果的影响

取6支棕色容量瓶，加入一定量的盐酸氯丙嗪，再加入不同量的醌茜素溶液，使醌茜素和盐酸氯丙嗪的质量比分别为1:100、5:100、10:100、20:100、40:100、80:100，调整溶液ph为5～6，20℃下反应后进行荧光光谱扫描并比较其荧光强度。

按照上述试验方法进行光谱扫描，不同质量比条件下盐酸氯丙嗪-醌茜素络合物的对比荧光谱图见图3。由图3可知，醌茜素和盐酸氯丙嗪的质量比不同，络合物的荧光强度也各不相同，但其荧光发射峰波长基本相同。随着醌茜素和盐酸氯丙嗪质量比的增大，络合物荧光强度逐渐增强，当质量比为20:100时，络合物荧光强度最大；质量比超过20:100时，荧光强度开始下降。

1.5.2络合反应ph值对反应结果的影响

取5支棕色容量瓶，加入醌茜素和盐酸氯丙嗪溶液，使其质量比为20:100，调整溶液的ph值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10，20℃下反应后进行荧光光谱扫描并比较其荧光强度。

不同ph值条件下盐酸氯丙嗪-醌茜素络合物的对比荧光谱图见图4。由图4可知，酸性条件下，溶液酸性越弱，络合物的荧光强度越大，ph为5～6时，荧光强度最大；当ph值大于6及是碱性环境下，荧光强度逐渐减弱。

溶液的酸碱性会对吩噻嗪类药物的荧光强度造成较大影响，这是由吩噻嗪类药物的分子结构决定的，溶液ph会直接影响其电子云分布，使吩噻嗪类药物的荧光光谱发生变化。当ph＜5时，与醌茜素络合的盐酸氯丙嗪是强阳离子，荧光强度较弱；当ph为5～6时，盐酸氯丙嗪是两性离子，络合物的荧光强度也随之增大；当体系ph继续升高，盐酸氯丙嗪变为阴离子，导致络合物的荧光强度逐渐减弱。

1.5.3络合反应时间对反应结果的影响

取5支棕色容量瓶，加入醌茜素和盐酸氯丙嗪溶液，使其质量比为20:100，调整溶液的ph为5～6，20℃下反应0.5、1.0、1.5、2.0、4.0h后进行荧光光谱扫描并比较其荧光强度。

不同反应时间下盐酸氯丙嗪-醌茜素络合物的对比荧光谱图见图5。由图5可知，随着反应时间的增加，络合物的荧光强度减弱，因为时间越长，络合物的稳定性会降低，荧光强度也会随之减弱，反应时间控制在0.5h。

1.5.4络合反应温度对反应结果的影响

取5支棕色容量瓶，加入醌茜素和盐酸氯丙嗪溶液，使其质量比为20:100，调整溶液的ph为5～6，分别在20、30、40、50、60℃条件下反应0.5h进行荧光光谱扫描，并比较其荧光强度。

不同反应温度条件下盐酸氯丙嗪-醌茜素络合物的对比荧光谱图见图6。由图6可知，温度升高，络合物的荧光强度减弱，因为络合物对热稳定性差，温度升高会使其分解从而使荧光强度减弱，反应温度控制在20℃。

1.6奋乃静-醌茜素络合反应影响因素的试验方法

在奋乃静中加入醌茜素，奋乃静-醌茜素络合物荧光强度的影响因素，采用与1.5类同的试验方法进行考察。结果获得盐酸氯丙嗪和奋乃静与醌茜素形成络合物的最佳试验条件如表3所示：

表3吩噻嗪药物与醌茜素形成络合物的最佳试验条件

1.7大黄素和醌茜素对吩噻嗪类药物荧光增敏效果对比试验方法

试验各取3份相同浓度的盐酸氯丙嗪和奋乃静标准溶液，一份做参比，另外两份分别加入大黄素和醌茜素并在最佳试验条件下反应后进行荧光光谱扫描。荧光增敏效果的对比谱图见图7。大黄素和醌茜素对盐酸氯丙嗪和奋乃静均有荧光增敏作用，但醌茜素的荧光增敏效果要高于大黄素，故试验选择醌茜素作为增强盐酸氯丙嗪和奋乃静荧光强度的络合剂，加入醌茜素后，盐酸氯丙嗪和奋乃静形成的络合物，其荧光发射波长都发生了轻微的蓝移，发射波长λem均为452nm。

1.8标准工作曲线的制备

取不同体积的盐酸氯丙嗪和奋乃静储备液，依次配制成系列浓度分别为0.5、2.0、5.0、10.0、20.0μg/ml的标准溶液，加入醌茜素，调整溶液的ph为5～6，20℃下络合反应0.5h，测其荧光强度，以溶液的浓度c为横坐标，荧光强度f为纵坐标，做标准工作曲线。得盐酸氯丙嗪的线性回归方程为f＝2.4695c+4.5776，r²＝0.9901，线性范围0.5～20.0μg/ml；奋乃静的线性回归方程为f＝2.1266c+4.3075，r²＝0.9916，线性范围0.5～20.0μg/ml。

1.9加标回收试验

在市售饲料样品中分别加入不同量的盐酸氯丙嗪和奋乃静，用乙醇提取，按照1.3的方法进行处理和测定，根据测定结果计算加标回收率。所有试验平行3次，结果取平均值。

加标回收试验中盐酸氯丙嗪和奋乃静的平均加标回收率分别为101.3％和97.8％，相对标准偏差rsd分别为4.3％和5.4％。

实施例2

药品中吩噻嗪类药物含量的测定

取市售盐酸氯丙嗪药品数片(含糖衣，规格为50mg)，研细，称取粉末0.3021g(1片药片的质量)，转移至碘量瓶中，准确移取25ml乙醇并加入其中。遮光，磁力搅拌30min后取出，离心10min，取上清液0.2ml置于25ml棕色容量瓶，用0.1mol·l^-1hcl溶液和0.1mol·l^-1naoh溶液调整溶液的ph＝6，加入醌茜素，并使其浓度为2.0μg·ml^-1，用水定容，在实施例1的条件下进行光谱扫描，所得谱图见图8。

根据图8可知，样品溶液的荧光强度f为44.37，通过计算得到荧光强度f为44.37时所对应的盐酸氯丙嗪浓度，最终得到盐酸氯丙嗪片中盐酸氯丙嗪的含量为50.35mg，与药品标注的规格对照，符合其药品规格。

取市售奋乃静药品数片(规格为2mg)，研细，称取粉末0.4187g(5片药片的质量)，转移至碘量瓶中，准确移取25ml乙醇并加入其中。遮光，磁力搅拌30min后取出，离心10min，取上清液1.0ml置于25ml棕色容量瓶，用0.1mol·l^-1hcl溶液和0.1mol·l^-1naoh溶液调整溶液的ph＝4，加入醌茜素使其浓度为2.0μg·ml^-1，用水定容，在实施例1的条件下进行光谱扫描，所得谱图见图9。

根据图9可知，样品溶液的荧光强度f为39.34，通过计算得到荧光强度f为39.34时所对应的奋乃静浓度，最终得到奋乃静片中奋乃静的含量为2.06mg，与药品标注的规格对照，符合其药品规格。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。