专利名称：筛选具有表示所选特性的种群的细胞或成型体的方法和设备的制作方法
技术领域：
本发明一般与筛选细胞或成形体以进行种群计数的方法和设备有关，这种群计数表示出一些用于研究、诊断或工业的所选特征。具体地说，本发明综合应用电子技术和粘有专用单克隆抗体的微球体对一种WBC种群和至少它的一个子集进行直接分析、对成形体进行分析和对多种血细胞进行分析。
一般说来，本发明与一种自动分析器以及用这种分析器来筛选生物细胞或成形体以进行种群计数的方法有关。这种种群计数表征了一些我们用来作研究、诊断、治疗或工业上的各种特性。具体地说，具体体现本发明的一些自动分析器和方法由于独特地将电子技术和具有选择能力的生物分子(如抗体)的特殊性能结合在一起来对细胞和成形体进行筛选和选择分类，就能对细胞和成形体实行多部分类，将细胞和成形体功能表型，以及在其它细胞中把白血病细胞、淋己瘤细胞和硬肿瘤细胞区分开来。
采用佛洛里达·海里厄的柯尔特电子公司的A型柯尔特计数计可以成功地使自动血细胞计数器对人体外周血液进行全血细胞(CBC)常规分析达到自动化。这种仪器的电子微粒传感系统原理在1953年10月20日颁发给瓦拉斯·H·柯尔特的美国专利2，656，508中有所报导，采用只是根据这柯尔特电子传感原理工作的微粒分析仪就能避免使用故障多、耗资大的光学传感装置或激光传感装置。
这种柯尔特电子传感原理发展推广到诸如各种S型柯尔特计数器的更为复杂的仪器，这些仪器用专用的计算机程序使CBC参数、绝对细胞计数、血小板计数和形志、红血细胞(RBC)形态能解释正常的和不正常的血样。
柯尔特电子微粒传感原理应用了一个使用直流(DC)孔径电源的孔径传感电路。这种微粒传感器结构简单，非常稳定可靠。美国和世界其它各地的临床试验室大都普遍采用柯尔特计数器自动分析器就证明了这一点。这个基本的孔径传感电路的一个改进型在1970年颁发给瓦拉斯。柯尔特和瓦尔特。霍克的美国专利3，502，974中有所报导。除了标准的直流孔径电源外，还加了一个高频孔径电流，这使敏感一个用来进行分类的附加参数成为可能。高频孔径电流产生一个信号，这个信号是血细胞内部的导电性和细胞体积的函数。同时由直流孔径电路产生一个常规的直流幅度信号，这个信号基本上指示了细胞的体积。用一个高速除法电路将射频振幅除以直流脉冲振幅，得到一个为细胞体积和内部电阻的函数的商，通常称之谓“浊度”。这个原理在1970年也是颁发给瓦拉斯·柯尔特和瓦尔特·霍克的美国专利3，502，973中有进一步的说明。该参数可以用于细胞分类系统。无论是单一孔径或一对分开的孔径都可用于这种用途。
不同种群的分类是通过检验所产生的一对信号的数据来进行的。一个度量微粒的体积，而另一个度量细胞内部的电阻或浊度。表示这数据的一种方便的形式是称为散布图的二维图形。这类图形在梅拉美特·梅拉耐和孟德尔松编辑的“细胞流式计数和分类”(约翰·威廉父子公司1979年版)第371页中有详细说明。
图5A是一个正常血样数据的例子。每一点代表一个单独的细胞。离底线的高度表示这细胞的相对体积，而点离右方垂直基线的距离表示相对浊度。正常白血细胞(WBC)(在去掉红血细胞后)的图呈现三个点簇，分别表示三个不同的种群，这是因为它们的大小和内部成份有本质的不同而引起的。如果需要的话，可以用适当的电路对这些种群进行计数，得到每一种群的细胞数。依据这些固有的差别就可以对这些细胞进行分类。
起初柯尔特电子微粒传感原理用来对红血细胞进行计数，而后用来确定红血细胞的一些其它参数，这就较为复杂一些。将红血细胞从全外周血中除去后，只要除去红血细胞的过程並不显著地损害所留下的待测白血细胞种群的性质，就可着手对白血细胞的种群进行分析。为此开发了各种红血细胞的溶胞剂，这些溶胞剂虽然很有用，而且广泛地使用着，但对于接着测定白血细胞来说並不是一切都令人满意的。
上述单使用直流体积或使用在各个角度上光的散射进行白血球流式分析的方法就可以显示出三簇白血球，分别相应于淋巴细胞，单核细胞和粒性白细胞。粒性白细胞包括嗜中性、嗜碱性和嗜酸性这三个种群。根据一些样品能对嗜酸性种群的浓度作一个粗略而有用的估计。对于这种方法来说，第五主要种群相对说来是太小了。采用专门的荧光技术也已观察到过一簇清晰的嗜酸性种群。
这些荧光技术已用于诸如柯尔特公司的EpICS血细胞流式计数器之类的血细胞流式计数仪器。此类仪器应用了细胞在鞘流限定的一个气柱中以排成一个单列逐个通过激光束的方式运动的原理。从细胞来的光散射信号和/或荧光信号就用来对细胞的种群进行分类。染有吸水性染料或荧光染料的细胞使有可能对附加的细胞种群进行分类。自动多参数分析的测试设备和荧光染料的这种进展由R.C。里夫等人在临床化学(1977年卷23，1492-1498页)中作了进一步说明。这些进展将同时进行白血球种群分类数扩展为四个，即淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞和“粒性细胞”(包括嗜中性细胞和嗜碱性细胞)。
近来的血液学分析仪器已经综合应用光散射技术和细胞的过氧化酶(吸水性染料)染色技术，以区分五种不同的白血球。并且，配有诸如单克隆抗体之类具有特殊反应的生物分子的染料已经将白血球分类数增加到能够进行功能细分的程度。
一种改进的单独的自动仪器和使用这种仪器的方法在原先的专利申请(美国序号025，345，1987年3月13日存档，题为“筛选表征所选特性进行种群计数的细胞或成形体的自动分析器和方法”)有所说明。这个原先申请综合应用了电子传感孔径原理、用来对所规定的细胞种群或成形体进行识别和/或计数的所选生物分子的特点以及微粒技术。这种自动分析器能结合特殊的溶胞剂和/或附着在具有不同成分的微球或载体的抗体一起使用。
具有选择吸附能力的细微粒子使有可能修改与至少一个种群的原来位置相应的参数。把大量细微粒子加到所选目标种群上会影响所测体积和/或浊度，结果使表示一个种群的那些点的位置发生偏移。
特性已知的抗体用来包覆细微粒子。包覆后的粒子就能吸附在一定的细胞上，这种细胞呈现在该抗体专门作用的抗原。这些被包覆或经标记的细胞是粒子与细胞的组合体，犹如一个新的整体一样。这个新整体的浊度参数、体积参数、或浊度和体积这二个参数都可以看成表示细胞和粒子二者对所得信号共同作用的结果。如果成分的特性不同，则新的整体将移动到一个与净效应相应的新位置。与只是细胞情况下的原来位置比较，这新位置应该能用来对诸如此类的新整体或新整体群进行分类。如果附着在细胞上的粒子是磁性粒子，按这时粒子的特性，当然可用磁铁来吸获这新整体。如果混合得很快，就会出现一些出乎意料的结果，其中包括完全捕获一个种群而对所要研究的细胞特性並无不良影响。
从一个血样中仅有三个不同的细胞种群能容易地加以识别和计数，这利用了这三个种群的与以上所述直流体积和浊度参数有关的固有独特性质。为了能对更多的种群进行检测和计数，必须采取一些诸如改善溶胞系统的附加措施。当然，这些后来补充的种群是淋巴细胞、单核细胞和粒性细胞这三个基本种群的子种群。根据先驱申请所进行的各个步骤说明了这三个基本种群的子种群是怎样得到的。
结合二种或更多种生物微粒应用那些简单的孔径传感技术，就能使表示一给定种群的点簇出现在一个独特的新位置上。由于种群在点标图或散布图上的这种有选择的运动是可以复现的，因此就能用来对从三个基本种群中分离出来的一个种群进行分类。
通过把微粒附着在所选定的各个细胞上，就能调整直流体积和浊度传感技术原来固有的结合方式。用作微粒表面涂覆的生物分子(其中包括抗体)的性质和特殊性能赋予这些微粒具有选择能力。单是一个种群的细胞，如果其表面没有微粒，可能占据一个与其它种群或子种群没有什么不同的点标图位置，因而不能互相区分。用这种方法能把具有选择附着能力的微粒加到我们所要识别、计数和研究的一个具体种群的细胞上去。把足量的具有选择能力的微粒有选择地加到所关心的一个种群上去，由于质量、体积和浊度的这种新的独特的结合，导致那个种群在点标图上的位置发生偏移。
把具体的细胞种群分离开来并不会对剩下的细胞种群的性质有很大影响。举例来说，按本发明，不是用一直沿用的化学RBC溶胞剂来从全血中除去红血球或红细胞(RBC)，这就能测量T4和/或T8淋巴细胞。T4和T8细胞数的比例已经用来指示与严重的病毒感染(包括爱滋病毒及其它一些病毒)一致的免疫缺乏症。细胞表面存在着特殊的受体，这可用来把一个种群划分成一些子种群。对这些子种群进行计数就可检测疾病的发作。例如，白血病的主要形式是外周血液淋巴细胞的急剧增加。如果快速增殖淋巴细胞的子种群具有T11受体，那么这个患者就有免疫不正常的危险。
此外，如果T11阳性淋巴细胞的子种群具有T4受体，则这个患者划为通常在日本发生的那一类病人。更进一步，如果T4受体子种群扩展为2H4阳性，则说明病人不仅有多种感染的趋势，而且患有严重的白血病。因为T11、T4、2H4阳性细胞是抑制的诱导体，从功能上抑制了病人产生抗体的能力。因此这病人受到多种感染，必须进行白血病和免疫缺乏治疗(参见K.Takatsuki，etal，GANNmonograPhonCancerResearch2813-22，1982;C.Morimoto，etal，CoulterJapanSymPosium，1984;C.Morimoto，etal，Immunology134(3)1508-1515，1985;C.Morimoto，etal，NewEnglandJournalofMedicine316(2)67-71，1987)。本发明还可用于对怀疑为诸如细菌、包括病毒之类的成形体的分析。
体现本发明的方法和设备可以与诸如涉及反应物和成形体或细胞的免疫反应之类的各种免疫反应一起应用。在使用时，细胞定义成动物细胞和植物细胞，这两种细胞可以分别或一起加以识别。细胞是能作为一个独立单元活动的活体的最小结构体。例如，人体的RBC和WBC种群、从组织或血样中产生的癌或其它不正常细胞都是。成形体定义为可能含有附着物的细菌、病毒和霉菌。本发明也可用于对病人的诊断、监护和治疗。特别是，本发明能用来除去或移动一些种群，以便分析那些不这样就不易识别的种群或子种群。有理由可以相信，那些适于加标的细胞或成形体能用本发明的方法和设备以与人体血细胞的例子相同的方式加以敏感。无论是否有附着物，均可敏感到参数的变化。
本发明提供了一种单独的多用途分析器和使用该分析器的方法。该分析器结合了电子微粒传感技术和具有选择能力的生物分子的特殊性能，大大促进了临床实验室使用和工业应用的自动分析器领域的发展。人体外周血液中的多种白细胞子种群及其相互关系的检测对医学研究和人体疾病诊断是十分重要的。这些数据作为对诸如白血病之类的疾病进行识别和分类的手段非常有用。由采用本发明而识别出来的不正常情况给诊断提供了有关分析信息，分析范围並不只限于检测白细胞种群，正如本发明的说明和附图所示。
本发明的一个极有价值的特点是应用了单独、稳定的柯尔特传感操作。这种操作十分稳定，而且不需要复杂、昂贵的光学系统。附加RF振荡器和检测器所需的电路装置非常经济、紧凑和可靠。所需的就只是一个单一孔径，但再加一个第二孔径或甚至第三孔径能很经济地提高样本通过速率。
本发明提供了一种筛选计数种群的细胞或成形体以识别这些细胞或成形体所呈现的特征和性质的方法和设备。从全血样或从去除红血细胞和/或白血细胞的种群的样品中能将白血细胞的多个部分或五个部分区分开来。可以将全血样或部分血样进行筛选，以提供一种WBC种群或至少其一个WBC种群子集的直接分析。从样品中除去或预先除去RBC种群，这並不会对WBC种群及其子集的有关特性产生多大影响。
改变至少是有关WBC种群子集的体积和/或浊度参数，这样至少该种群和子集就可用电子方法加以分析，以确定该WBC种群的至少一个特征。因此至少一个WBC种群子集在种群和子集分析前从样品中可以首先去掉。通过将大小不同的微球贴附到二个不同的子集就可以同时改变这二个子集。此外，可将多种微球附着到有关WBC子集的各细胞上。这些程序因此就提供了包括对所要求的子集的直接WBC分析，而並不使用光学技术。
因此，本发明的第一个目的是提供一种从其中具有至少一些白血细胞种群、至少一个具有至少一个子集的白血细胞种群的至少是部分全血样中得到至少一种白血细胞种群分析的方法，该方法的特征是改变有关白血细胞种群的至少一个白血细胞种群的子集的体积和/或浊度参数、用电子方法对所改变的白血细胞种群子集和所选有关白血细胞种群进行分析，从而确定该所选白血细胞种群的至少一个特征。
本发明的第二个目的是提供一种从其中具有至少一些白血细胞种群、至少一个具有至少一个子集的白血细胞种群的至少是部分全血样中得到至少一种白血细胞种群分析的设备，该设备的特征是具有改变有关白血细胞种群的至少一个白血细胞种群的子集的体积和/或浊度参数的装置，以及具有用电子方法对所改变的白血细胞种群的子集和所选有关白血细胞种群进行分析从而确定该所选白血细胞种群的至少一个特征的装置。
本发明的所推荐的具体装置将参照说明附图予以举例说明。这些附图有
图1-13说明原先申请025，345中披露的具体装置;
图1为原先申请的一种细胞种群分析器具体装置的原理方框图;
图2为原先申请的第二种分析器具体装置的原理方框图;
图3为与图1和图2相应的先驱申请的一种具体的分析器的具体装置;
图4为原先申请的另一种分析器具体装置的原理方框图;
图5A和5B为用类似于图2和图3所示分析器系统样机得到的一组结果的点散布图;
图6为原先申请的又一种分析器具体装置的原理方框图;
图7为原先申请的再一种分析器具体装置的原理方框图;
图8A和8B、图9A和9B、图10A和10B以及图11A和11B为用类似于图6和图7所示的分析器系统样机得到的一组结果的散布图;
图12为原先申请的又一种分析器具体装置的原理方框图;
图13为用类似于图12所示的分析器系统样机得到的一组结果的散布图;
图14-26D是对于本发明的一些具体装置的;
图14为本发明的一种WBC种群子集分析器具体装置的原理方框图;
图15为本发明的WBC种群子集分析器具体装置的另一个原理方框图;
图16为与图14和15相应的本发明一种具体分析器的具体装置;
图17A和图17B为用类似于图3和图16所示的分析器系统样机得到的一组结果的散布图;
图18A为用类似图16所示的分析器系统样机所得到的L、M和G种群的散布图，而图18B为所得到的L、M和B种群的散布图;
图19A-D、20A-D和21A-D为不同患者血样的CD4、CD8、CD2和CD20子种群的散布图;
图22A为类似于图18A散布图的散布图，图22B为说明E和N种群偏移的散布图，而图22C为说明E、N和CD4种群偏移的散布图;
图23A-D为说明使用一种附着于有关WBC子集的微球和附着于第一种微球的第二种微球进行直接WBC子集分析的散布图。
图24A-C为说明在本发明的偏移分析中所使用的微球大小的影响的散布图;
图25A-D为说明采用本发明技术同时对二个WBC子种群进行分析的散布图;以及图26A-D为根据不同参数的散布图所说明的相同种群的散布图。
图1-13说明原先申请025，345的具体装置。
参照图1，体现原先申请(序号025，345)的细胞种群分析方法和设备的第一种具体装置简标以数字10。分析器10包括含有至少第一批活的生物细胞(未示出)的生物样品12，诸如在全血样中或从全血样中取出的细胞。生物样品12的细胞在进行定量和/或定性测定或分析时要参加生物反应。生物样品12可以含有缓冲剂，细胞就加进这种缓冲剂里。
经通路14的样品12与经通路18的至少一种反应剂16混合。然后，由功能上指定为去除RBC的场所20将红血细胞(RBC)从混合物中除去。场所20可以用好几种方法从混合物中除去RBC。反应剂16中的溶胞剂可以将RBC溶胞。一种这样的优选溶胞剂和可以随同使用的抑制剂在1987年12月归档、题为“用于从全血样中分离、识别和/或分析白血球的方法和反应剂系统”序号为130，911的专利(为1987年3月13日归档、序号为025，303的CIP、标题相同)中有所说明，该专利在此收作参考。反应物16可以是或可以含有许多带抗体的磁性微球，这种抗体是专门对RBC的，附着在RBC上(未示出)。在这个例子中，所用的具体的红血细胞专用抗体在1985年11月19日归档题为“用来分离人体外周血液中白血球的单克隆抗体以及回收使用所述单克隆抗体的方法”的申请799，489中有所说明，该申请在此收作参考。反应剂16除了样品缓冲剂还可以有一种缓冲剂，或者这种缓冲剂可以代替样品缓冲剂。反应剂16还能是优选RBC溶胞剂和RBC专用微球的组合。
一旦RBC基本上从混合物中除去，一部分混合物就通过通路24送到白血细胞(WBC)分析器22。WBC分析器22至少要对混合物中的WBC进行计数。WBC分析器22也能测量WBC的一个或多个体积或浊度参数。由分析器22所得出的结果经通路28送至比较器26。
已除去红血球的混合物的第二部分经通路32送到除去WBC子集的场所30。白血球子集可以用许多方法从混合物中除去。可以将带有专门对WBC某一子集、附着在上面的单克隆抗体的微球加到混合物里。非磁性微球就能粘到WBC上，改变或移动这些细胞的合成浊度或体积参数。磁性微球也能粘到WBC上，这样用一个磁场就可从混合物中将这些WBC除去。
已除去WBC子群或已改变一个或几个参数的混合物然后就经通路36送到WBC子集分析器34。分析器34可以与分析器22完全相同。然后，分析器34所得到的结果经通路38送到比较器26。比较器26能把分析器22送来的WBC结果与分析器34送来的经改变的结果加以比较，确定所选的白血细胞种群的至少一个特征(如在某一特定范围内的细胞数)。
参照图2，体现先驱申请的细胞种群分析方法和设备的第二个具体装置简标为参考数40。分析器40包括也含有至少一个首批活的生物细胞(未示出)的生物样品42，如在全血样中或从全血样中取出的细胞。生物样品42的细胞在进行定量和/或定性测定或分析时要参加生物反应。样品42中也可能有缓冲剂，细胞就加进这缓冲剂中。
经通路44，样品42与经通路48来的至少一种反应物46混合。在分析器40中，由功能指定为除去RBC和移动WBC的场所50从混合物中除去RBC，並同时改变或移动至少一个WBC子集的至少一个特征。如上所述，该场所可以用许多方法来除去混合物中的RBC，这在前面就场所20已经例举了。同时在这同一混合物部分WBC被粘到一般说来是非磁性的微球上，改变或移动了细胞的合成浊度和/或体积参数。
然后，已除去RBC和已移动WBC子种群的混合物经通路54送至分析器52。分析器52可以与分析器22大体相同。因此，分析器40对所选WBC种群或WBC子集的至少一个特征提供了快速直接的分析。
体现原先申请并能完成第一和第二分析器10和40的分析方法的分析设备的详细具体装置在图3中简标为参考数56。
在设备56中，只例示了一种具体的计数。按原先申请的原理可以作出几乎无数的改变。并且，对设备56的说明只是一般性的功能情况，而详细的具体装置的结构可以用许多众所周知的方法来实现。
设备56包括一个用来将有关生物样品(如样品12或42)抽入设备56的抽气泵机构58。抽气机58经通路60与连到采样头63的采样阀62相连。溶胞剂泵64可以含有如同部分反应剂18或46那样的溶胞剂，而且经通路66也与阀62相连。在适当的时候，阀62和泵58能吸取生物样品12或42以及经泵64送来的溶胞剂。
然后，反应剂混合物或生物样品本身经泄放通路68送到混合装置70。混合装置70包括送入样品或反应剂的混合舱72。在这一点上，分析器10和40的工作情况不一样，因此将分别说明。
对于分析器10来说，如果RBC已经被来自泵64的溶胞剂溶胞，则在反应结束时，从场所74经通路76提供抑制剂或停溶剂。通过对舱72内的溶胞剂和样品的搅拌可以促进反应，如在78所示功能。
在此能采用的合适的混合装置70的具体细节在1987年3月13日归档、题为“增强生物反应的小容量高速混合的方法和装置”、序号025，337中有所说明，在此收作参考。由于使用混合器70，反应速度大为提高，但并不显著损害细胞内我们所关心的一些特性，这在诸如提高反应温度就会发生。此外，反应通常可以在远短于1分钟的时间内完成，一般大致为15秒或更短。这使自动化程度高的体积分析设备56能够进行高速分析。
然后，被溶胞剂除去RBC並且已经停止反应的反应剂(当从场所20送出时)经通路80送到容纳舱82，在这种情况下，该舱将容纳第二部分混合物。第一部分混合物将从舱82经通路84送至WBC分析器86(即分析器22)。按照瓦勒斯。H.柯尔特在美国专利2，656，508中说明的以及体现在柯尔特电子公司代理的大量商用血细胞计数器中的计数和测量大小的技术，分析器86可以具有许多实际形式。
通常，分析器86包括一个流式传感器或传感舱88。舱88包括一个具有一个穿通的孔径92的变换器90。舱88包括一个具有与那里的流体进行接触的第一电极96的第一舱段94。
舱段94和电极96通过孔径92与其中具有第二电极100的第二舱段98相联系。电极96和100经反应引线102和104与RF/DC电源和传感电路106相连。电路106将直流(或低频电流或信号)和高频信号耦合到电极96和100之间。
低频信号用来敏感由通过孔径92的一个细胞所引起的信号脉冲的振幅。高频信号用来获得通过孔径92的同一个细胞的电浊度。
瓦勒斯.H.柯尔特和瓦尔特.R.霍克在美国专利3，502，974和此后的几个专利以及柯尔特电子公司代理的出版物中对测量细胞的电浊度作了说明。一种能在这里应用的具体电路在题为“测量微粒的电阻和电抗的微粒分析器”的案例168，008中有所说明，该案例在1986年10月21日归档，现为美国序号921，654，在此收作参考。
由电路106从受感细胞产生的信号经DC信号引线108和RF信号引线110耦合到比较器112(与比较器26相似)。比较器112能保持从第一部分，亦即没有减去WBC子集的那部分，产生的信号，以便与从所说明的第二部分得到的结果相比较。
分析器86能包括一个以众所周知的方式将细胞聚集到传感器88的鞘流。这鞘流可由射流系统114提供，经一对通路116和118以众所周知方式耦合到传感器88。样品反应混合物能经导入管120送入传感器88，也能经排出管122从传感器88排放到容废器124。
当第一部分混合物正在分析器86内进行分析时，第二部分混合物就保持在舱82内，而混合器72由清洗通路126清洗，通过排废通路128排干。一旦舱72清洗完毕，第二部分经通路130送回到舱72。像场所30一样，现在通过经通路134、阀136和舱通路138加入由场所132送出的WBC微球体的方法把WBC子集减去。
混合机构78将WBC微球体与第二部分混合。如WBC微球体是非磁性的，则带有被粘WBC微球体的反应混合物经通路80、舱82和通路84送入分析器86(即分析器34)，在那里对第二部分进行类似对第一部分那样的分析。然后，结呆在比较器112(即比较器26)内进行比较。在第二部分中粘有微球体的WBC子集至少一个WBC子集改变了细胞参数(如细胞浊度)，以提供改变了的结果，然后能对这结果进行分析。
如果这种WBC微球体是磁性的，则粘在这上面的WBC子集在混合过程中和/或混合以后用一个磁场或磁铁140除去。磁场可由相对舱72作机械运动的电磁装置或磁铁140产生，以捕获粘在磁性微球体上的WBC子集。然后，除去了所粘的WBC子集的第二部分经通路80、舱82和通路84送到分析器86(类似分析器34)，其方式与上述相同，以便进行分析。
设备56随后就为取下一次分析样品作准备。探头63可由探头清洗机构142清洗，而一些通路和舱72、82能方便地加以冲洗。对一个接一个的样品混合物的各种分析都是自动快速进行的。接连二个样品混合物分析的间隔能够达到大致几分钟或更短一些。
在操作分析设备56时，与分析器40类似，含有RBC溶胞剂/反应剂46和样品42的反应混合物在舱72内与来自场所132的非磁性WBC微球体混合，这些微球体就粘到一个WBC子集上。将抑制剂74加到反应混合物，然后经通路80、舱82和通路84将这混合物送到分析器86(类似于分析器52)进行分析。
如果不用溶胞剂，无论是在分析器10还是40中，样品12或42可以经阀62送到混合器70，不带任何溶胞剂。在这种情况下，可以利用上面粘有RBC专用抗体的微球体以磁力除去RBC。这些微球体从RBC微球体场所144经通路146所到阀136，再经通路138送到舱70。那里没有溶胞剂，混合后被粘住的RBC用磁铁140以磁力去除，其方式大致与前面所述以磁力去除被粘住的WBC相同。
此外，为了提高反应速度，可以用既含RBC溶胞剂又含RBC磁性微球体的样品反应混合物。将反应混合物搅拌，抑制溶胞;再以磁力去除被粘住的RBC，然后进行如上所述的WBC分析。
现在参照图4，体现原先申请的细胞种群分析方法和设备的另一种具体装置简标以参考数148。分析器148包括生物样品150，这生物样品也至少含有第一批活的生物细胞(如在全血样中或从全血样中取出的细胞)。样品150也可以含有缓冲剂，细胞加在缓冲剂内。
经通路152样品150与经通路156来的至少一种反应物154混合。然后，如前所述，RBC由功能指定为去除RBC的场所158除去。去除了RBC后的反应混合物经通路160送到WBC分析器162。分析器162得出的结果经通路166送到比较器164，提供了具有对单核细胞(M)、淋巴细胞(L)和粒性细胞(G)的结果的三种WBC的差别。
然后，混合物经通路170送到具有去除嗜中性(N)功能的场所168。用移动或改变一个参数(如浊度)的方法或用磁力除去的方法从混合物中移去N，这二种方法均如上述。在这个例子中，所用的具体的N专用抗体在案例168，306、题为“专用于嗜中性细胞的单克隆抗体”、1986年12月8日归档、现为美国序号938，864中有所说明。
已除去或已移动N的混合物然后就经通路174送到另一个WBC分析器172。分析器172得到的结果经通路176送到比较器164。分析器172的结果用来获得四种WBC的差别，仍有对M和S的结果，但现在由于N被除去或移动，还有对嗜酸性(E)和嗜碱性(B)所得到的结果。分析器162和172得出的二个分析结果然后由比较器164加以比较，以便形成五种WBC的差别。具体地说，从G的数目中减去B和E的数目就得出被移去的N的数目。
现在参照图5A和5B，这二个图是用类似于分析器148的典型分析方法从全血样中得到的结果的散布图。生物样品150是20微升的全血样，该血样与掺有140微升缓冲溶液以形成反应剂154的40微升上面粘有RBC专用抗体的磁性微球体混合。反应混合物搅拌15秒后在场所158中的磁场里放置10秒钟。除去了RBC的混合物由分析器162进行分析，结果如图5A的散布图所示，该数为L为45.6(1)，M为5.6(2)，G为48.7(3)。
然后，混合物在场所168中与10微升粘有N专用抗体的磁性微球体混合，该混合物在搅拌30秒后在磁场中放置10秒。再将除去了N的混合物送到分析器176，形成图5B的散布图，结果该数是L为81.0(1)，M为0.6(2)，E为11.0(3)，B为1.8(4)。然后，比较器164给出五种WBC差别，该数是45.6L，5.6M，41.6N，6.0E及1.2B。这与用作将载片上的样品染色计数的读数44.0L，3.4M，45.0N，6.1E及0.4B的标准显示WBC差别相应。
图6为体现原先申请的细胞种群分析方法和设备的又一种具体装置，简标以178。分析器178包括生物样品180，这生物样品也是至少含有第一批活的生活细胞，也可以包括一种缓冲剂。
经通路182，样品180与经通路186来的反应物184混合。功能上说明如下混合物的第一部分经通路188送到具有去除RBC和N功能的场所190。用如前所述的方式除去或移动RBC和N，而后，这第一部分经通路192送到WBC分析器194。
这提供了由分析器194经通路196送到比较器198的一个结果。这结果含有上面所指的包括M、L、E和B的这四种的差别。
同时，样品180的第二部分和反应物184的混合物经通路200送到具有除RBC功能的场所202。除去了RBC后的混合物经通路204送到另一个WBC分析器206，分析器206得出的结果经通路208送到比较器198。分析器206得出的结果只包括上面所指的M、L和G这三种WBC的差别。比较器198比较分析器194和206送来的结果，从而得出五种WBC的差别。
体现分析器178的方法和设备的一个具体的分析设备在图7中简称以210。此外，只示出了一种具体的硬件计数，但与分析设备56一样，分析设备210可用各种不同结构形式来实现。
设备210包括一个由通路216连到采样阀214的抽气泵机构212。阀214可以包括采样头218以抽取有关生物样品(如样品180)。稀释剂输送泵220由通路222连到阀214，以便在需要的时候为诸如全血样之类的样品提供稀释剂。而后混合物的第一部分经通路224和通路226送到第一混合装置228。同时，混合物的第二部分经通路224和230送到第二混合装置232。
混合器228(相当于场所190)大体上与混合器232(相当于场所202)相同，将予首先说明。混合器228包括一个混合舱234，混合物的第一部分就送到这个舱内。混合器228包括所有上述各种选择方案，如果需要可以包括RBC溶胞剂的溶胞剂输入通路236。
如果采用溶胞剂，则在236所示的功能进行混合后，经抑制剂通路240加入抑制剂。同时，通过加入粘有N专用抗体的合适的磁性或非磁性微球体来除去N。这种微球体是从微球体源242经通路244送入舱234内的。如果对N或RBC用磁性微球体，则要用磁铁246或磁场以磁力来除去粘住的细胞。
已混合和停止溶胞(如果需要的话)的混合物经通路248通过阀250和通路252送到WBC分析器254(即分析器194)。分析器254与分析器86相同，就不再详细说明。此外，分析器254包括带有孔径258的传感舱256，混合物和细胞穿过这个孔径。鞘流射流系统260能连到舱256。细胞所产生的信号由RF/DC源和传感电路262检测，其输出送到比较器264，如同前述。
同时，混合物的第二部分送入混合舱266。在这第二部分中只要除去RBC(即类似于场所202)，RBC能用经通路268送入舱266的RBC溶胞剂除去。把溶胞剂与样品混合，而后经抑制剂通路270加入抑制剂。或者，用粘有RBC专用抗体的磁性微球体来除去RBC，这种微球体是从微球体源272经通路274送入舱266内的。微球体经搅拌混合后(该功能由276完成)用磁铁278将粘在磁性微球体上的RBC除去。
而后，已除去RBC的混合物经通路280送到阀250，再经通路252送到分析器254，以便得到以上所提到的结果。混合器228和232包括相应合适的清洗通路282和284以及排废通路286和288，还包括探头清洗机构290，以便在吸入下一个或一些要分析的样品前清洗设备210。
图8A和8B示出了用类似于分析器178的分析方法从一个全血样品得到的结果的散布图。在这个例子中，样品180为20微升的全血，而反应物184为40微升的粘有RBC专用抗体的磁性微球体，掺以140微升的缓冲剂溶液。混合物的一部分在场所202内搅拌20秒，再在磁场内放置10秒。然后，除去了RBC的混合物在分析器206内进行分析，得到图8A的散布图，该图给出读数L为29.4(1)，M为8.1(2)，G为62.4(3)。
同时，相同混合物的另一部分在场所190与10微升的粘有N专用抗体的磁性微球体相混合，以便在场所190除去RBC和N。混合物搅拌30秒，再在磁场中放置10秒。除去了N和RBC的混合物然后由分析器194进行分析，得到图8B的散布图，该图给出的数L为73.5(1)，M为21.7(2)，E为34.3(3)，B为1.4(4)。这二种读数在比较器198内进行比较，得到五种WBC差别的读数L为29.4，M为8.0，N为60.8，E为1.2，B为0.6。並且还与显微镜方法测定的结果作了比较，其读数为L为29.4，M为5.0，N为65.0，E为1.0，而B小于1。
图9A和9B为类似于图8A和8B的五种WBC差别的例子的散布图的结果。用图8A和8B所作说明中的步骤对20微升的全血样进行分析，得到图9A的散布图，其读数L为35.4(1)，M为14.6(2)，G为50.3(3)。图9B的散布图的读数L为66.4(1)，M为25.0(2)，E为6.6(3)，B为2.0(4)。所得出的五种WBC差别给出读数L为35.4，M为14.6，N为45.5，E为3.5，B为1.1。与此相对应的显微镜方法的读数L为36，M为11，N为49，E为3，B为1。
图10A和10B为也类似于图8A、8B和图9A、9B的五种WBC差别的散布图结果，但在这个例子中使用了溶胞剂。在这个例子中，20微升的全血样与80微升的缓冲物以及240微升的上面所提到的RBC优选溶胞物相混合。混合物搅拌6秒以后加入抑制剂。时间非常关键，因为大于10秒以后，尚未被抑制的溶胞剂将开始对WBC的性质发生非常显著的影响。对除去了RBC的混合物进行分析，从而得出图10A的散布图，其读数为L为25.7(1)，M为9.6(2)，G为65.0(3)。
含有第二个20微升全血样的混合物的第二部分与120微升的缓冲剂和10微升粘有N专用抗体的磁性微球体混合，搅拌30秒后在磁场内放置10秒。然后将RBC优选溶胞剂加入到除去了N的混合物内，在停溶前搅拌6秒。得到的散布10B给出百分比读数为L为74.6(1)，M为21.6(2)，E为2.9(3)，B为0.8(4)。得到的五种WBC差别的百分比读数为L为25.6，M为9.6，N为63.5，E为1.06，B为0.3。用显微镜方法得出的读数为L为29.4，M为5.0，N为65.0，E为1.0，而B小于1。
类似于图10A和10B的五种WBC差别的散布图结果的另一个例子示于图11A和11B。全血样有二个同时进行分析的样品，分析步骤与对图10A和10B可作的说明相同。图11A这个散布图提供的读数为L为31.9(1)，M为17.6(2)，G为50.4(3)。而图11B这个散布图提供的读数为L为67.1(1)，M为24.1(2)，E为7.6(3)，B为1.2(4)。得到的五种WBC差别的结果是L为31.9，M为11.4，N为46.0，E为3.6，B为0.7。作为比较，相应用显微镜方法得到的读数为L为36，M为11，N为49，E为3，B为1。
体现在原先申请的细胞种群分析方法和设备的又一个具体装置在图12中简标为292。分析器292包括一个还是至少含有第一批活的生物细胞，如果需要也含有缓冲剂的生物样品294。经通路296样品294与经通路300来的至少一种反应剂298混合。在分析器292中，在功能指定场所302中顺序地或同时地将RCB去除和将N移位。RBC去除功能标为304，而移动N功能标为306，以便指示这二个功能可以同时执行，也可以顺序执行。可以用磁力或溶胞物，或如上所述用这二者的组合来除去RBC。用将粘有一种N专用抗体微球体加入混合物来除去或移动N。
一旦除去了RBC和移动了N，所得到的混合物经通路308送到分析器310。在这种情况下，由于N很明显地离开E和B的图形，因此可以直接得到M、L、E、B和N这五种WBC的差别。用设备56和210或稍加变动，分析器292就能完成这个功能。
用分析器292直接得出五种WBC差别的一个例子的散布图结果示于图13。在这个例子中，生物样品294为20微升的全血样，而反应物298为10微升粘有N专用抗体的非磁性微球体掺了100微升的缓冲剂、在子场所306内搅拌了30秒。240微升的RBC优选溶胞剂加到子场所304内的混合物中，搅拌6秒后加入抑制剂。而后，除去了RBC和移动了N的混合物由分析器310加以分析，得到图13的这个散布图。该散布图所给出的直接读数为L为29.6，M为13.6，N为52.2，E为3.4，B为1.06。作为比较，显微镜测量的读数为L为35，M为5，N为56，E为4，B为0，在这个具体例子中，该血样也用柯尔特电子公司的通用细胞计数仪进行了分析，结果是L为29，M为11.1，G(包括N、E和B)为59.9。
现在参照图14-26D对本发明的一些具体装置加以说明。
参照图14，WBC种群子集分析器的方法和设备的第一个具体装置标记为320。分析器320包括至少含有第一批语的生物细胞(未示出)的生物样品322，它包括具有至少一个可确定子集的至少一种白血细胞种群，诸如在全血样中或从全血样中取出的细胞。如在此所采用的，WBC子集是专用单克隆抗体能粘在上面的一个WBC种群的子集。世界健康组织和国际免疫学会对单克隆抗体现已规定了一种命名法。单克隆抗体由分化簇(CD)术语来定义，这种术语为细胞或细胞群和专用于这种CD群的单克隆抗体定义了具体的特性。仅作为例子而言，在以后的例子中要用到四个CD群CD4、CD8、CD2和CD20。单克隆抗体的CD术语、特性和一些商品源情况说明于表1中。
表1分化簇抗体特性(商品来源)CD2(gp50)T11(Coulter)ERossetteOKTLL(Ortho);受体Leu5a(BD)CD4(pg56)T4(Coulter)协助/诱导物TOKT4a(Ortho);
Leu3a(BD)CD8(gp32-33)T8(Coulter)细胞毒素/抑制者TOKT8(Ortho);
Leu2a(BD)CD20(gp35)BL(Coulter)除了原生细胞的所有Leu16(BD)B细胞除了骨髓，一些非T细胞的B肿瘤细胞表中
agp-糖蛋白分子重量千道尔顿bCoulter-CoulterImmunologyDivisionofCoulterCorporation(Hialeah，Florida)BD-Becton-DickinsonImmunocytometrySystems(MountainView，California)Ortho-OrthoDiagnosticSystems(Raritan，NewJersey)生物样品322的细胞在进行定量和/或定性测定或分析时要参加生物反应。样品322可能包括缓冲剂，细胞加在这缓冲剂里。
经通路324样品322与经通路328来的至少一种反应剂326混合。在分析器320中，由具有去除RBC和偏移WBC子集功能的场所330同时或顺序将RBC从混合物中除去和改变至少一个WBC子集的至少一个参数。如在先驱申请中所述，场所330从混合物中除去RBC可以有许多方法，诸如对场所20所列举的。同时或顺序，在同一混合物部分至少一个WBC子集被粘到具有专用于粘到这种子集上的单克隆抗体的WBC微球体上，改变了这种细胞的合成浊度和/或体积参数。
除去了RBC和移动了WBC子种群后的混合物然后经通路334送到分析器332。分析器332可以大体与分析器22相同。通常将有关的WBC子集表示成有关WBC种群的百分比。因此，分析器320对WBC种群的所选子集的至少一个特征提供了快速直接分析。分析器320可以用于其它数目较多的细胞遮蔽不了所移动的WBC子集的情况，或虽有遮蔽但该WBC子集的所移动的细胞数占有足够大的百分比，使它们容易被识别出来的情况。
参照图15，WBC种群子集分析的方法和设备的第二种具体装置简标为340。分析器340包括含有至少第一批活的生物细胞(未示出)的生物样品342，它至少包括具有至少一个子集的一个白血细胞种群，如在全血样中或从全血样中取出的。生物样品342的细胞在进行定量和/或定性测定或分析时也要参加生物反应。生物样品342可以包括加有细胞的缓冲剂。
经通路344样品342与经通路348来的至少一种反应剂346混合。在分析器340中，具有除去RBC和移动WBC子集功能的场所350同时或顺序将RBC从混合物中除去和使至少一个WBC子集的至少一个特征发生改变或偏移。如前所述，可以有许多方式使场所350将RBC从混合物中除去，诸如对场所20所列举。此外，同时或接着在相同的混合物部分至少有一个WBC子集粘到微球体上，改变了这些细胞的合成浊度和/或体积参数。
同时或接着至少有一个WBC种群或子集从混合物中除去。由于除去了WBC的种群或子集，所以所关心的WBC子集就不会被那个WBC种群搞混。最好是在WBC种群粘到粘有专用于这种WBC种群的单克隆体的磁性微球体上以后用磁力将它们除去。
除去了RBC和WBC的种群和移动了WBC子集种群后的混合物然后经通路354送到分析器352。分析器352也可以与分析器22大体相同。
体现原先申请和能够实现第一种和第二种分析器320、340的分析方法的一种详细的具体装置在图16上概略地标为360。
在设备360中，像设备56一样，只说明一种具体的计数情况，按第一个原先申请的原理可以作出几乎无穷的变化。此外，对设备360的说明只是一般原理性的，而具体的装置可以用许多所知的方式构成。
设备360包括抽气泵机构362，用来将有关的生物样品(如样品322或342)抽入到设备360。抽气机362经通路364连到与采样头368相连的采样阀366。溶胞剂泵370含有溶胞剂(如部分反应剂326或346)，经通路372也连到阀366。阀366和泵362在适当时候能吸取生物样品322或342以及经泵370来的溶胞剂。最好，生物样品322或342与溶胞剂分开加入。
然后，反应的混合物或就是生物样品本身经排放通路374送入到混合装置376。混合器376包括混合舱378，样品或反应剂送入该舱。分析器320和340仅在工作上略有不同，这里将一起说明。
在工作时，如果RBC已经由来自泵370的溶胞剂溶胞，则在反应完成时加入经通路382由场所380所提供的抑制剂或停溶剂。于是除去RBC的反应就结束了。通过在舱378内搅拌溶胞剂和样品可以促进反应，功能如在384所示。
无论是在除去RBC前、后或同时都可以移动WBC，在使用分析器340的情况下，也可以除去一个WBC种群或子集。通过加入从场所386经通路388、阀390和舱通路390来的专用WBC微球体使WBC子集发生偏移。WBC微球体与混合物或样品用搅拌机384搅拌混合。
适当的混合装置376的具体情况与混合装置70大体相同。使用了混合器大大提高了反应速度，而且不会像提高反应温度那样发生明显损害细胞有关性质的现象。此外，反应一般在少于几分钟内就可完成，大致是二分钟或者更短。这使自动化程度高的体积分析设备360可以进行快速分析。
在分析器320中，在用溶胞剂除去RBC和WBC子集被移动后，经抑制的反应物就经通路394送到WBC分析器396(即分析器332)。按照瓦拉斯·H·柯尔特在美国专利2，656，508中所说明总、体现在柯尔特电子公司的许多血细胞计数器商品中的计数和测量大小的技术，分析器396可以具有许多具体型式。
如前所述，一般说来分析器396包括一个流式传感器或敏感舱398。舱398包括一个具有一个贯穿的孔径402的变换器400。舱398包括一个具有与那里的流体接触的第一电极406的第一舱段404。
舱段404和电极406通过孔径402与具有第二电极410的第二舱段408通信。电极406和410通过反应引线412和414连接到RF/DC源和传感电路416。电路416将直流(或是低频电流或信号)和高频信号耦合到电极406和410之间。
低频信号用来敏感由通过孔径402的一个细胞所引起的一个信号脉冲的振幅。高频信号用来得出通过孔径402的这个细胞的电浊度。
对于测量细胞电浊度的情况，瓦拉斯·H·柯尔特和瓦尔特·R·霍夫在美国专利3，502，974及以后的一些专利和柯尔特电子公司代理出版物中有所说明。在此可用的一种具体电路揭示在美国序号921，654的专利中，在此收作参考。
由电路416从被敏感的细胞产生的信号通过DC信号引线418和RF信号引线420耦合到比较器422(与比较器26相似)。
分析器396可以包括一个将细胞聚集到传感器398内的鞘流，其方式是众所周知的。鞘流由射流系统424提供，通过一对通路426和428以众所周知的方法耦合到传感器398。样品反应的混合物经导入管430送到传感器398，而通过排出管432排放到容废器434。
每次操作后，混合器378都要由清洗通路436加以冲洗干净，由排废通路438排干。一旦舱378清洁完毕，另一个样品或样品部分就可以送入设备3603。
在分析器340中，工作情况与加有磁性白血细胞种群或子集微球体的分析器320相同。被粘住的WBC子集在混合过程中和/或混合后用磁场或磁铁440除去。磁场可以用电磁装置或磁铁440产生，电磁装置或磁铁440相对舱378作机械运动，把粘有磁性的WBC子集捕获。除去了被粘的WBC子集后的混合物就通过通路394送到分析器396(其方式同前述)以便得出分析结果(与分析器320相同)。
然后，设备360准备为下一次分析取下一个样品。探头368由探头清洗机构442清洗，各通路和舱378也以方便的方式冲洗干净。接连着的样品混合物的每次分析都是以自动方式快速进行的。接连二个样品混合物分析之间的时间大致小于5分钟。
如果不用溶胞剂，无论是在分析器320或340中，经阀366样品322或342送到混合器376並不带任何溶胞剂。在这种情况下，RBC可以利用粘有RBC专用抗体的微球体以磁力除去。这种微球体从RBC微球体场所444经通路446送到阀390，再经通路392送到舱376。如果不用溶胞剂，被粘住的RBC在混合后也要用磁铁440以与对粘有磁性的WBC上面所述的大体相同的方式用磁力除去。
此外，在第二种情况下，为了促进反应的速度和效率，可以采用样品与RBC溶胞剂和RBC磁性微球体的反应混合物。搅拌这种反应混合物，抑制溶胞后用磁力将被粘的RBC除去，然后再进行如前所述的WBC分析。
现在参照图17A和17B，以散布图的方式示出了用一个类似设备360的典型分析器从一个全血样中得出的二组结果。除去二个WBC种群直接对T8子集进行分析。T8子集是那些具有T8专用抗体可粘在上面的受主式抗原的细胞或成形体。在图中，这些细胞或成形体标为T+8。那些没有T8专用抗体的受主式抗原的细胞或成形体则标为T-8。在这个例子中，生物解质342是20微升混合器376使用的全血样。在图17A和17B中，20微升的全血样(即解质342)与40微升的粘有RBC专用抗体的磁性微球体混合，与120微升的缓冲剂溶液和10微升的粘有N和E专用抗体的磁性微球体混合，与30微升的缓冲剂溶液混合，一起形成反应剂346。一种典型的N和E专用抗体在美国序号068，618、题为“专用于嗜中性和嗜酸性的一般遗传素部位的单克隆抗体”、1987年6月3日归档的专利中有所说明，在此收作参考。
磁性微球体可以具有任何合适的型式，在本例中用的是印第安那州的印第安那城的赛拉定公司出售的聚苯乙烯磁性微球体，直径为0.7微米。10%固体粒子的重量体积比反应混合物在混合器376内搅拌10秒后在磁铁440的磁场内放置15秒，然后除去了RBC、E、N后得到的混合物在分析器396内进行分析。得到的散布图A如图17A中所示。
在12.5微升的粘有T8专用抗体的非磁性微球体与12.5微升的缓冲剂溶液混合组成的反应剂346的情况下，用相同的程序得到散布图(图17B)。T8专用抗体的商标为柯尔特·克隆，由柯尔特公司的柯尔特免疫部推出。非磁性微球体也可以具有任何合适的型式，在本例中采用由俄勒冈州普德兰的交换面动力公司推出的IDC微球，(直径为1.76微米，8%固体粒子的重量体积比)。
加入T8微球体将被粘的CD8细胞移到区域B，通过比较散布图17A和17B可以看到，在B区这些CD8细胞就可分开，进行识别和计数。在图17A中，CD8细胞被其它的WBC细胞遮蔽了。从散布图上要移去N和S，否则这些细胞会影响图17B中的经移动的CD8细胞的识别。图17A示出了移去了N和S的情况，而图17B则清楚地示出了CD8的被粘细胞从区域A移到区域B的情况。缓冲溶液可以是密索里州圣路易斯的西格玛化学公司推出的磷酸盐缓冲盐溶液。
图18A还示出了由分析器352得出的正常散布图或M、L和G细胞种群的三个参数的组织图的位置情况。不除去G，则如图17B可见，经移动的WBC子集所在的区域B会被数目相当大的G细胞弄模糊。图18B为说明在除去E和N后留下WBC种群M、L和B的情况的散布图。虽然B还部分地弄模糊了我们所关心的那个区域，但这些WBC种群的百分数很小，不会对子集百分数进行所需计算发生多大影响。然而如果需要的话，也可从子集百分数中减去B所产生的影响。
现在参照图19A-D，20A-D和21A-D，说明对从三个不同患者取出的各个样品进行CD2、CD4、CD8和CD20WBC子种群直接子集分析的情况。对每个子种群，将28微升的全血样与20毫升的粘有N和E专用抗体的磁性微球体(2.5%重量/体积溶液)混合。此外，粘有与各个有关WBC子集相应的单克隆抗体的非磁性微球体也与样品混合。包覆在微球体上的T4、T8、T11或B1的量分别为40微升(每种均为1%重量/体积溶液)。各相应的总混合物(例如N和E微球体加上T8)与磷酸盐缓冲盐水和1%牛血清白蛋白组成的总量为150微升、PH值为7.2至7.4的缓冲溶液相混合。各相应的混合物在舱378内用搅拌器376搅拌2分钟，然后在磁场440内放置1分钟。在这些例子中，用上面提到的溶胞剂接着将RBC除去。首先加入WBC微球体，然后用来自落胞剂源370的300微升的溶胞剂(如由柯尔特电子公司推出的红血球溶胞剂)除去RBC。然后混合物用来自源380的120微升抑制剂(如也由柯尔特电子公司推出的稳定剂，一种白细胞保存剂)抑制，再送到分析器396分析。
在各个散布图中的右边的方框(1)表示相应所关心的WBC子种群。图中所示的方框1、2、3、等人工式自动地套在所关心的WBC种群式子集周围。
这些结果与用常规的流式细胞计所得的结果作了比较。对于三种样品以百分数给出了用本发明方法(SHIFT)与流式细胞计(CYT)的下列比较结果
图22A也示出了由分析器352得出的正常散布图或M、L和G种群的三个参数分布情况。不除去N和E，CD4细胞种群就要被遮住分不清楚。通过用N和E专用单克隆抗体微球体将N和E移到一个区域或图22B中所示方框1，则就能将CD4种群移入这个方框或区域2进行观察。这个区域会已经被N和E遮住，如在图22A中所见。在这个例子中，对于图22C来说，28微升的全血样与50微升的粘有N和E专用单克隆抗体的2.2微米的微球体、50微升的粘有T4专用单克隆抗体的微球体以及22微升的稀释剂相混合。图22B是无T4微球体而稀释剂为72微升，其它不变的情况，图22A是无任何微球体而稀释剂为122微升其它不变的情况。
参照图23A-D，可以看到采用多种粘到所关心的WBC子集上的微球体直接对WBC进行分析的情况。图23A和23B分别示出了就L种群与分别都用0.8微米的非磁性微球体移动的T4WBC子集和T11WBC子集的散布图。这移动不是以区分图23A和23B中的WBC子集。图23C和23D分别示出了就L种群与粘在0.8微米和2.2微米的二种微球体上被移动的T4WBC子集和T11WBC子集的散布图。由于2.2微米的微球体有Goat抗游动IgG抗体粘在上面，而这种抗体粘到粘在0.8微米微球体上的T4或T11抗体，因此2.2微米的微球体就粘到0.8微米的微球体上。
粘到所关心的WBC子集上的非磁性微球体的大小的影响例示于图24A-C。在这个例子中，28微升的全血样与10微升的粘有N和E专用抗体的磁性微球体(2.5%重量/体积溶液)和40微升的粘有T0专用抗体的非磁性微球体(1%重量/体积溶液)。T8的微球体具有二种不同的粒径，说明在散布图上偏移的不同。将缓冲溶液加入，形成体积为150微升的混合物。混合物搅拌2分钟后在磁场内放置1分钟。除去N和E后的混合物再加以溶胞，除去RBC后进行分析。图24A示出了一个没有附着一个微球体的作参考标准的WBC子集、一个粘有2.2微米的非磁微球体的T8WBC子集和一个粘有30微米的非磁微球体的T8WBC子集。宽度和高度表示所检测的信号的标准偏差。图24b为说明T8WBC子集用粘在上面的3.0微米的微球体移动的情况，而图24C为说明T8WBC子集用粘在上面的2.2微米的微球体移动情况的散布图。对于不同的微球体分析得T8WBC子集的百分比相应为20.9和19.3。显然，较大的微球体形成较清晰的图形，如图24B所示。
现在参照图25A-D，来说明按照本发明同时直接分析二个WBC子群的情况。在这个例子中，28微升的全血样与10微升的粘有N和E专用抗体的磁性微球体、52微升的缓冲溶液和40微升的粘有T8专用抗体、3.0微米的非磁性微球体混合，搅拌2分钟。然后将混合物放在磁场里1分钟，再将除NN和E的混合物溶胞以除去RBC，然后进行分析。图25A示出了一个不粘有任何微球体的WBC子集的参考样本、一个粘有2.2微米的非磁性微球体的T4读数和一个粘有3.0微米的非磁性微球体的T8读数。这说明二个被移动了的WBC子种群之间的差别。图25B是一个散布图分析，只有粘到2.2微米的微球体上的T4WBC子种群被移到区域A，而图25C也是一个散布图分析，只有粘到3.0微米的微球体上的T8WBC子种群被移到区域B。图25D示出了一个散布图分析，T4和T8WBC子种群被移到相应的区域A和B。这使我们可以同时对T4和T子种群进行分析。
现在参照图26A-D，在利用不同的参数得到的四个不同的散布图上表示L、M和G这三个种群。虽然前面的例子是用DC对浊度(RF/DC)的关系来说明的，但是实际上可以利用任何二个不同参数来形成散布图。图26A示出了一个用DC对RF的散布图，图26B用RF对浊度，图26C用DC-RF对浊度而图26D则用与前面一样的DC对浊度。此外，虽然已经用了DC对RF或RF/DC，只要信号可以相互能够分开那么可以用任何二种不同的频率信号，因为它们的频谱位置和/或相位关系是不同的。浊度是一个优选参数，因为它基本上是RF信号的归一化。显然，如图26A-D所示，数据的表示形式可以随需要而变。DC是所要敏感的细胞或成形体的体积的函数，而RF是所要敏感的细胞或成形体的内部导电性和体积的函数。
此外，虽然本发明方法和设备已经利用全血样作了说明，但有时候也有要用除去了RSC和/或一些WBC部分样品的情况。显然，还要除去RBC，但有争议的是在本发明的设备的外部而不是在内部除去RBC。可以用许多常规方式来实现这种去除RBC或配制，如使用溶胞试剂、密度或浓度技术等。在使用本发明的自动化分析器中最好是用全血样，这样，样品分析既快又完整。
根据以上说明本发明可作许多发动和变化。样品12、42、150、180、294、322和342可以包括全血、含有细胞的人类体液或含有诸如细菌、病毒、霉菌之类成形体的其它液体。微球体的量规定为每单位体积稀释剂中微球体的重量。虽然有些例子是顺序执行的，但这些工序也可以同时执行。同时分析要考虑使用稍为复杂一点的设备组件。因此，可以理解，在所附权利要求范围内，不用说本发明是可以实现的。
权利要求
1.从其中具有至少白血细胞种群、至少一个白血细胞种群具有至少一个子集的至少部分全血样中获得至少一个白血种群分析的方法，其特征是改变所关心的所述白血细胞种群的至少一个白血细胞种群子集的体积和/或浊度参数用电子技术对所述被改变的白血细胞种群子集和所述选定所关心的白血细胞种群进行分析，从而确定所述选定的白血细胞种群的至少一个特征。
2.按照权利要求1的方法进一步表征为在对所述被改变的白血细胞种群子集进行分析前从所述白血细胞种群中减去至少一个白血细胞种群。
3.按照权利要求2的方法进一步表征为提供粘有专用于所述白血细胞种群的单克隆抗体的磁性微球体，将所述磁性微球体与所述样品混合，使得所述磁性微球体粘到所述白血细胞种群上，通过在吸引磁场内所述磁性微球体同时除去所述样品的至少一部分剩余的方法除去所述白血细胞种群。
4.按照权利要求1的方法进一步表征为在分析所述被改变的白血细胞种群前从所述白血细胞种群中至少减去嗜中性和嗜酸性种群。
5.按照权利要求4的方法进一步表征为加入粘有专用于所述嗜中性和嗜酸性种群的单克隆抗体的磁性微球体，将所述磁性微球体与所述样品混合，使得所述磁性微球体粘到所述嗜中性和嗜酸性的种群上，通过在吸引磁场里的所述磁性微球体时除去所述样品的至少一部分剩余的方法除去所述嗜中性和嗜酸性种群。
6.按照权利要求1的方法进一步表征为通过加入粘有专用于CD4白血细胞种群子集的专用单克隆抗体的微球体，将所述微球体与所述样品混合以使所述微球体粘到所述CD4子种群上来移动所述CD4子种群的至少一个电特征的途径来改变所述CD4白血细胞种群子集。
7.按照权利要求1的方法进一步表征为通过加入粘有专用于CD8白血细胞种群子集的专用单克隆抗体的微球体、将所述微球体与所述样品混合以使所述微球体粘到所述CD8子种群上来移动所述CD8子种群的至少一个电特征的途径来改变所述CD8白血细胞种群子集。
8.按照权利要求1的方法进一步表征为通过加入粘有专用于CD2白血细胞种群子集的专用单克隆抗体的微球体、将所述微球体与所述样品混合以使所述微球体粘到所述CD2子种群上来移动所述CD2子种群的至少一个电特征的途径来改变所述CD2白血球种群子集。
9.按照权利要求1的方法进一步表征为通过加入粘有专用于CD20白血球种群子集的专用单克隆抗体的微球体、将所述微球体与样品混合以使所述微球体粘到所述CD20子种群上来移动所述CD20子种群的至少一个电特征的途径来改变所述CD20白血细胞种群子集。
10.按照权利要求1的方法进一步表征为改变所述关心的白血细胞种群的至少一个第二白血细胞子集的体积和/或浊度参数;用电子方法分析至少其中一个所述被改变的白血细胞子集和所述选定关心的白血细胞种群，以便确定所述选定的白血细胞种群的至少一个特征。
11.按照权利要求10的方法进一步表征为用电子方法分析二个所述被改变的白血细胞子集。
12.按照权利要求10的方法进一步表征为通过加入粘有一种专用于所述第一白血细胞子集的单克隆抗体、具有第一粒径的微球体和加入粘有一种专用于所述第二白血细胞子集的单克隆抗体、具有与所述第一粒径不同的第二粒径的微球体、将所述微球体与所述样品混合使所述微球体粘到所述二个白血细胞种群上的途径来改变所述二个白血细胞子集。
13.按照权利要求1的方法进一步表征为通过加入粘有一种专用于所述白血细胞子集的单克隆抗体的第一组微球体、将所述微球体与所述样品混合以使所述微球体粘到所述白血细胞种群上，然后加入粘有专用于粘在所述第一组微球体上的所述单克隆抗体的一种单克隆抗体的第二组微球体、将所述第二组微球体与所述样品和所述第一组微球体混合使所述第二组微球体粘到上面的途径来改变所述白血细胞种群。
14.一种用来从其中具有至少白血细胞种群、至少一个白血细胞种群有至少一个子集的至少部分全血样中得出至少一个白血种群分析的设备表征为用来改变所关心的所述白血细胞种群的至少一个白血细胞种群子集的体积和/或浊度的装置(330，350，376);用电子技术对所述被改变的白血细胞种群子集和所述选定所关心的白血细胞种群进行分析，从而确定所述选定的白血细胞种群的至少一个特征的装置(332，352，416)。
15.按照权利要求14的设备进一步表征为用来在对所述被改变的白血细胞种群子集进行分析前从所述白血细胞种群中减去至少一个白血细胞种群的装置(350，376)。
16.按照权利要求15的设备进一步表征为用来通过加入粘有一种专用于所述白血细胞种群的单克隆抗体的磁性微球体来减去所述白血细胞种群的装置(386)，用来将所述磁性微球体与所述样品混合使得所述磁性微球体粘到所述白血细胞种群上的装置(384)以及用来通过在吸引磁场里的所述磁性微球体时除去所述样品的至少部分剩余的方法来除去所述白血细胞种群的装置(440)。
17.按照权利要求14的设备进一步表征为用来在分析所述被改变的白血细胞种群子集前从所述白血细胞种群中减去至少嗜中性和嗜酸性种群的装置(386)。
18.按照权利要求17的设备进一步表征为用来通过加入粘有一种专用于所述嗜中性和嗜酸性种群的单克隆抗体的磁性微球体来减去所述嗜中性和嗜酸性种群的装置(386)，用来将所述磁性微球体与所述样品混合使所述微球体粘到所述嗜中性和嗜酸性种群上的装置(384)和用来通过在吸引磁场内所述磁性微球体时除去所述样品的至少部分剩余来除去所述嗜中性和嗜酸性种群的装置(440)。
19.按照权利要求14的设备进一步表征为用来通过加入粘有一种专用于CD4白血细胞种群子集的专用单克隆抗体的微球体来改变所述CD4白血细胞种群子集的装置(386)和用来将所述微球体与所述样品混合、使所述微球体粘到所述CD4子种群从而移动所述CD4子种群的至少一个电特征的装置(384)。
20.按照权利要求14的设备进一步表征为用来通过加入粘有一种专用于CD8白血细胞种群子集的专用单克隆抗体的微球体来改变所述CD8白血细胞种群子集的装置(386)和用来将所述微球体与所述样品混合，使所述微球体粘到所述CD8子种群从而移动所述CD8子种群的至少一个电特征的装置(384)。
21.按照权利要求14的设备进一步表征为用来通过加入粘有一种专用于CD2的白血细胞种群子集的专用单克隆抗体的微球体来改变所述CD2白血细胞种群子集的装置(386)和用来将所述微球体与所述样品混合、使所述微球体粘到所述CD2子种群上从而移动所述CD2子种群的至少一个电特征的装置(384)。
22.按照权利要求14的设备进一步表征为用来通过加入粘有一种专用于CD20的白血细胞种群子集的专用单克隆抗体的微球体来改变所述CD20白血细胞种群子集的装置(386)和用来将所述微球体与所述样品混合、使所述微球体粘到所述CD20子种群上从而移动所述CD20子种群的至少一个电特征的装置(384)。
23.按照权利要求14的设备进一步表征为用来改变所述关心的白血细胞种群的至少一个第二白血细胞子集的体积和/或浊度参数的装置(386)，和用来用电子技术分析至少其中一个所述被改变的白血细胞子集和所述选定关心的白血细胞种群从而确定所述选定的白血细胞种群的至少一个电特征的装置(416，422)。
24.按照权利要求23的设备进一步表征为用来用电子技术分析二个所述被改变的白血细胞子集的装置(416，422)。
25.按照权利要求23的设备进一步表征为用来通过加入粘有一种专用于所述第一白血细胞子集的单克隆抗体的、具有第一粒径的微球体和加入粘有一种专用于所述第二白血细胞子集的单克隆抗体、具有与所述第一粒径不同的第二粒径的微球体来改变所述二个白血细胞子集的装置(386)和用来将所述微球体与所述样品混合、使所述微球体粘到所述白血细胞种群上的装置(384)。
26.按照权利要求14的设备进一步表征为用来通过加入粘有一种专用于所述白血细胞子集的单克隆抗体的第一组微球体来改变所述白血细胞种群子集的装置(386)，用来将所述微球体与所述样品混合使所述微球体粘到所述白血细胞种群上，再加入粘有一种专用于粘在所述第一组微球体上的所述单克隆抗体的单克隆体的第二组微球体的装置(384)和用来将所述第二组微球体与所述样品和所述第一组微球体混合、使所述第二组微球体粘到上面的装置(384)。
全文摘要
本发明提供自动、快速回收、计数和/或分析细胞或成型体的至少一个所选定的种群和全血样或部分血样的至少一个子的方法和设备。制备一定量的含有白血细胞的生物解质，将专用或至少对某些所选定的生物细胞是优选的至少一种反应剂引入到生物解质，快速搅动，就能改变这些细胞的浊度和/或体积参数，然后在一个工序或几个工序中对混合物进行计数和分析，从而得出对所要求的白血细胞种群和子集的分析。
文档编号G01N33/553GK1043566SQ8910934
公开日1990年7月4日 申请日期1989年12月16日 优先权日1988年12月16日
发明者托马斯·卢塞尔, 肯尼恩·H·科特莱特, 沃莱斯·H·库尔特, 卡洛斯·M·罗德里格斯, 罗纳德·鲍尔, 康斯坦斯·马丽·哈杰克, 杰姆斯·卡雷·修德森 申请人:科特电子公司