专利名称：磷酸酶靶向毒素的测定的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测通常由藻类微生物(Microalgae)，如蓝细菌(cyanobacteria)和腰鞭毛藻类(dinoflagellate)产生的磷酸酶-靶向毒素的试验方法。
腰鞭毛藻通常是单细胞、光合作用、二鞭毛的藻类。某些海洋腰鞭毛藻类(如双甲藻亚种(Prorocentrum sp.)和沟鞭藻亚种(Dinophysis sp.))产生磷酸酶靶向的毒素，如冈田酸和沟鞭藻毒素，如果被人摄入，会导致胃肠道疾病。因此如果这些藻类污染食用蛤贝的居住地时，会引起问题。
蓝细菌(常常称作蓝绿藻)，也是光合作用的生物，主要是水生的，生活在沿海水域、外海和大洋、河流、湖泊和地下水中，但也可是陆生的，见于落叶层和土壤中。
蓝细菌的许多种类，特别是微囊蓝细菌亚属(Microcystis sp.)、蓝束丝蓝细菌亚属(Aphanizomenon sp.)、鱼腥蓝细菌亚属(Anabena sp.)、节球蓝细菌亚属(Nodularia sp.)和颤蓝细菌亚属(Oscillatoria sp.)产生毒素，如果被人或其它哺乳动物、鸟类、甚至鱼类摄取，会引起疾病。这些毒素的摄取通过两种主要途径，饮用污染的水或食用污染的海鲜。
蓝细菌和腰鞭毛藻类产生两类特别的毒素。神经毒素(如类毒素和贝类毒素)导致受害者瘫痪，因此该症状常常称为瘫痪性贝类中毒。这些神经毒素引起的中毒极少，但证明是致命的。
另一种类型的毒素通过与体细胞中的蛋白磷酸酶结合并影响它们对蛋白质底物脱膦酸的能力而灭活该酶。这些毒素相对常见，一些(如腰鞭毛藻类毒素冈田酸和沟鞭藻毒素)可引起恶心、呕吐和腹泻，因此症状常称为腹泻性贝类中毒。一些蛋白质磷酸酶靶向毒素是肿瘤促进剂，和这些毒素接触会致癌。其它毒素，如蓝细菌毒素微藻素和节球藻素是肝毒性的，能引起肝脏损伤。磷酸酶靶向毒素中最多见的是微藻素、节球藻素和冈田酸。
腰鞭毛藻毒素中毒的最常见来源是贝类和鱼肝，而蓝细菌毒素中毒的最常见原因是污染的饮用水和/或海滨浴场水。然而，贝类和水中都可同时藏匿蓝细菌毒素和腰鞭毛藻毒素。藻类毒素中毒的最常见来源是贻贝(mussel)，因为它们食用产毒藻类后聚集毒素。其它贝类，如牡蛎、蛤和扇贝也可受感染。
另外，民用供水，特别是如果来自地下水，可被蓝细菌污染，因而提供了毒素摄入的直接途径。
对于食用藻类和蓝细菌，作为高蛋白保健食品和辅助食品给予了某种关注。关于监测收集的藻类或蓝细菌中是否有产毒菌株的污染还没有官方标准，由于在鱼腥蓝细菌和蓝束丝蓝细菌属中发现了许多产毒菌株，而特别担心这些蓝细菌属的营销。
除了与藻类毒素接触引起的短期不适、医药开支、贝类产业的商业成本、工作时间缩短等以外，已发现上述磷酸酶靶向毒素微藻素和节球藻素是肿瘤促进剂，据信在临床或亚临床水平反复接触这些毒素，尤其是结合大量饮酒或吸烟，会(尤其是肝脏)导致癌症。
目前，检测和定量测定藻类和蓝细菌的磷酸酶靶向毒素存在许多不同方法。一种标准方法涉及磨碎贻贝或其它磷酸酶靶向毒素的可能来源物，并用磨碎的贻贝组织的提取物注射小鼠。然后根据小鼠存活率确定磷酸酶靶向毒素污染的存在和水平(Stabell等，(1992)，食品化学毒物学30(2)139-44)。很清楚，这是一种费时、粗糙和昂贵的评估食品安全性和质量控制的方法。
另一种方法涉及测定外源加入的磷酸酶酶活性的减弱，从而检测贝类中磷酸酶靶向毒素的存在。这也涉及磨碎贻贝或其它贝类组织，释放干扰加入的磷酸酶的内源磷酸酶，损害试验的灵敏度和准确性(Sim和Mudge(1994)于蓝细菌毒素的检测方法，Codd，Jefferies，Keevil和Potter编，皇家化学协会)。
因此，对能定量或定性测定水、贝类和/或可食用藻类或蓝细菌产品中磷酸酶靶向毒素的存在，尤其是藻类和蓝细菌的磷酸酶靶向毒素存在的快速、灵敏和便宜的试验和方法有很大的需要。特别是，需要一种足够简单，能由相对不熟练或非技术人员(如鱼贩或水公共卫生人员)执行的，而且不需要实验设备或专门设施进行该检测的试验法。
因此，根据第一个方面，本发明提供了一种试验法，来检测抑制蛋白磷酸酶的磷酸酶靶向毒素，包括使具有固定化配体的固相载体接触(i)怀疑受毒素污染的样品和
(ii)非固定化配体，其中所述固定化配体能与至少一种所述毒素、所述非固定化配体或所述毒素和所述非固定化配体的复合物结合，所述非固定化配体能与至少一种所述固定化配体、所述毒素或所述毒素和所述固定化配体的复合物结合，所述毒素、所述非固定化配体或所述毒素和所述非固定化配体结合所述固定化配体的比例依赖于所述样品的毒素含量，而且其中所述固定化配体当不与所述毒素复合时、当与所述毒素和所述非固定化配体的复合物复合时，或与所述非固定化配体复合时，能产生可直接或间接检测信号，或所述非固定化配体当未复合时或复合时能产生可直接或间接检测的信号，从非结合组分中分离出结合组分；和直接或间接检测水溶液中与固定化配体结合的(结合组分)或非复合的(非结合组分)非固定化配体；其中可以分别、依次或同时将(i)和(ii)施加于固相载体，如果分别或依次加入，可不论先后进行。
因此在一个实施例中，毒素检测可能涉及检测不能直接或间接与固定化配体结合的非固定化配体。当非固定化配体与毒素竞争结合固定化配体时，高水平的未结合配体表明了高毒素浓度。当非固定化配体能和结合于固定化配体的毒素复合时，高水平的未结合配体表明低水平的毒素浓度。
在另一个实施例中，毒素检测涉及检测直接或间接与固定化配体结合的非固定化配体。当毒素和非固定化配体竞争结合固定化配体时，高水平的结合配体表明低水平的毒素浓度。当非固定化配体能和结合于固定化配体的毒素复合时，高水平的结合配体表明高水平的毒素浓度。
然而，本发明的方法优选包括一种检测磷酸酶靶向毒素，特别是藻类和蓝细菌毒素的竞争性结合试验，其中存在于样品中的毒素分子与非固定化配体竞争数量有限的固定化配体的结合位点，而且所述样品中存在的毒素的测定与非固定化配体与固定化配体的结合位点结合或不结合的程度相关。
本文所用的术语“检测”、“测定”或“评估”包括定量测定(指获得样品中存在的磷酸酶靶向毒素的量或浓度的绝对值)，和半定量测定和质量评估或测定。可测定存在的毒素水平或量的指数、比率、百分数或摩尔指标，或获得样品中存在或不存在这种毒素的简单指示。在本发明的一个优选方面，获得了对毒素存在进行简单的存在或不存在或半定量的测定。关于这点，毒素“不存在”可能指毒素浓度低于试验的检测极限，或在认为安全或可耐受的水平以下。
本发明试验方法中所用的样品可以是任何怀疑接触了产磷酸酶靶向毒素的微生物，或接触了磷酸酶靶向毒素的样品，例如海水、淡水、地下水、取自湖、井、溪、水库的水、家用供水设施的水，或可以是从贝类提取的水分，例如用吸管吸取或抽提的水或浸过贝类的水，或可以是食品、食物添加剂、营养补充剂、从藻类或蓝细菌生产的其它药物或类似产品。当贝类含有淡水时(如牡蛎中)，该试验可以将一种吸水物质(固相载体)蘸入该水中。或者，可在打碎或打开贝壳后，简单的将一种吸水物质按在贝类的湿肉上。
在本发明的一个优选方面，调查的样品是贝类的表面或游离水分。
所有种类的贝类，例如扇贝、对虾、蛤贝和牡蛎对本发明的试验方法敏感，但在一个优选方面中，贝类是蛤贝。在另一个优选方面，调查的样品是从这些贝类生活的栖息地取得的水，而在另一个优选方面，样品是取自家用供水设施的水。
用于分析的样品可以基本上未处理的形式使用，但可在分析前任选的用已知方法过滤或加水、缓冲液或其它水性介质稀释，并可在分析前通过冷藏或冷冻储藏或保存。
可在本发明的方法中使用毒素结合配体，作为固定化或非固定化配体，例如抗体，它可以是多克隆或单克隆的，或抗体片段，如F(ab)、F(ab’)2或F(v)片段。这些抗体或抗体片段可以是单价的或二价的，并可通过杂交瘤技术产生，或合成，作为重组DNA技术或化学合成的产物。可采用例如单链抗体或其它抗体衍生物或模拟物。抗体或抗体片段可针对磷酸酶靶向毒素的任何表位、组分或结构，如果合适的话。另外，可使用对毒素(如小有机分子或肽(如寡肽或多肽))具有亲和力，能和毒素特异性结合的化合物，例如选自配位化学，或噬菌体展示文库或DNA或RNA的特异性结合序列的特异性结合剂。
然而本发明的优选毒素结合配体是蛋白磷酸酶，甚至更优选的是在试验方法中使用结合性配体蛋白磷酸酶2A(pp2A)。
类似的，本发明方法中所用的第二种配体可以是任何与第一种配体竞争性或非竞争性结合毒素的配体。另外，第二种配体可以是任何与毒素竞争结合第一配体的配体。第一种配体优选是毒素结合性配体，更优选是蛋白磷酸酶。这两种配体之一必须固定化，而另一种必须是非固定化的，而且配体之一必须是可直接或间接检测的。在一个优选例中，非固定化配体应符合能竞争性抑制毒素与固定化配体结合，并可直接或间接产生可检测信号的功能要求，例如，它可以是能用任何已知形式的直接或间接信号形成分子标记的分子。这些配体也可采取抗体形式，可以是多克隆或单克隆、或F(ab)、F(ab’)2或F(b)片段等抗体片段。这些抗体或抗体片段可以是单价或多价的，还可以由杂交瘤技术产生或用重组DNA技术或化学合成经合成而来。例如，可使用单链抗体或其它抗体衍生物、或模拟物和小型有机分子、选自组合或噬菌体显示文库的肽、寡肽和多肽。抗体或抗体片段可针对磷酸酶靶向毒素分子或与磷酸酶靶向分子适当结合的配体的任何表位、组分或结构。另外，可使用对毒素或对结合毒素的配体(如)具有亲和力，例如能与毒素或与结合毒素的配体特异性结合的化合物，例如选自配位化学或噬菌体展示文库的的特异性结合剂，或DNA或RNA的特异性结合序列。
配体之一通常将携带的报道基团可以是一直接可检测基团，如金属溶胶(如金溶胶)、发色团或荧光团(如花青、酞菁、部花青、三苯基甲基、equinance(马菁)等的结合位点，见应用化学论题，红外吸收发色团、M.Matsuoka编，Plenum Press，New York，NY，1990，应用化学论题，染料的化学和应用，Waring等，Plenum Press，New York，NY，1990，和荧光探针和研究化学手册，Haugland，Molecular Probes，Inc.1996，和放射性标记、酶、磁性颗粒，浊度诱导剂等的结合位点，或它可已携带这样的可直接检测的基团。当报道基团是由固定化配体携带时，它通常是可直接检测基团的结合位点，当配体复合时，结合位点被活化或更通常失活。
优选报道基团由非固定化配体携带。
在本发明的优选例中，非固定化配体是标记的酶、或发色团或荧光团标记的肽(如选自节球藻素、微藻素LC或微藻素YR或可另选的冈田酸的肝毒素)。
虽然用放射性标记是可能的，但由于试验主要由外行用户就地使用，最好采用能提供肉眼可见信号的报道基团，如发色团、荧光团、磷光基团、浊度诱导剂、气体放出诱导剂等。
当信号形成基团是一种能与配体之一上的结合位点结合的材料时，在分离结合和未结合组分后，它将方便的和结合或未结合的组分恰当接触。
一般当信号来自结合组分时，最好用水等冲洗底物，以在配体被检测或产生并检测前冲走未结合的组分。
本发明可用于任何产生磷酸酶靶向毒素的藻类和蓝细菌物种。但特别适用于蓝细菌的产毒株，如铜绿微囊蓝细菌(Microcystis aeroginosa)、鱼腥蓝细菌、节球蓝细菌(Nodularia spuragena)和水华鱼腥蓝细菌(Anabena flus-aque)或藻类。因此例如，微囊蓝细菌亚属产生毒素微藻素LR和微藻素YR，节球蓝细菌产生毒素节球藻素，双甲藻亚属产生毒素冈田酸。
本发明方法测定的毒素也可能是藻类或蓝细菌产生的磷酸酶靶向毒素，但在优选方面中肽毒素是肝毒素(其中微藻素和节球藻素最常见)或冈田酸。
因此，就其最普遍的意义而言，本发明的方法涉及将怀疑含有磷酸酶靶向毒素污染的样品与毒素结合配体和报道分子同时、依次或以不同顺序分别接触，该报道分子能和所述毒素竞争配体结合位点，在和调查的样品接触前，该报道分子可任选的和该结合配体结合，并测定和固相载体结合或游离于溶液中的报道分子。
评估报道物之前将结合组分和未结合组分用任何合适方法，如沉淀、离心、过滤、层析方法、毛细管作用或简单抽提分开。固相可以是量杆的形式或任何已知形式的固相基质，如聚合物或磁性珠(如Dynabead(购自Dynal AS))。在本发明的优选例中，固定毒素结合配体的固相载体是Dynabead形式。
根据本发明的具体实施例，可用结合或未结合组分评估报道分子，但优选用结合组分评估。
可用任何已知方法，例如将配体和任何熟知的固相载体或基质结合或偶联，来固定化配体。固相载体和基质是目前广泛使用或提议用于分离或固定化的那些，例如，固相载体可以采取颗粒、片层、凝胶、滤纸、膜、纤维或毛细管或微量滴定条、试管或孔板等，常规用玻璃、二氧化硅、乳胶、聚合材料或磁珠制造。将配体和固相载体结合的技术在本领域中是熟知的，在文献中被广为描述。在本发明的优选例中，磷酸酶靶向毒素结合配体固定化的固相载体是Dynabeads形式的。
本发明的试验方法的优点在于它无需复杂实验设备即可进行，而且可由相对不熟练或不熟练的人员进行。因此，该实验方法适用于家庭、商店和野外，而且它可快速和方便的进行，而无需繁重劳动或危险的化学品。
在本发明试验方法中的独特优点是灵敏度非常高，当分析其中毒素水平非常低的样品，例如在测试饮用水或评估磷酸酶靶向毒素可能的污染时，这是非常重要的。通常该试验能检测皮摩尔浓度，如低至10pM的毒素。该试验常规用于检测范围在15-560pM之内的毒素。
本发明试验方法相对于现有技术的另一个优点是，该试验不受可能存在于分析样品中(特别是如果样品取自贝类)的内源磷酸酶的影响。
在本发明的一个实施例中，一种蛋白磷酸酶被固定在固相载体上，固定化的磷酸酶和调查的样品接触，样品中存在的任何磷酸酶靶向毒素则与固定化磷酸酶结合。加入和毒素竞争磷酸酶结合位点的报道分子源。报道分子在一定程度上将毒素分子从结合位点上置换下来，视毒素分子和报道分子的相对浓度而定。报道分子结合的程度能确定调查的样品中存在的毒素。优选的报道物/标记包括放射性标记、发色团(包括荧光团)和酶(产生发色或荧光产物)。还考虑闪烁临近标记和产生可测量光散射变化的标记。
在另一个实施例中，固相载体固定化的报道-封阻磷酸酶分子和调查的样品接触，样品中存在的磷酸酶靶向毒素和磷酸酶结合的报道分子竞争，将它们从固相载体上置换下来，进入水溶液中，其程度和样品中存在的毒素成比例。接着评估依旧与固相载体结合的报道分子量，能确定调查的样品中存在的毒素。
从另一个方面看，本发明提供了一种检测蓝细菌或藻类磷酸酶靶向毒素的试剂盒，根据本发明，所述试剂盒包括一种固相载体，其上固定有一种配体；一种非固定化配体，优选在水溶液中或和固定化配体形成复合物；所述固定化和非固定化配体都不含可直接或间接检测的分子，一种报道分子能与所述固定化和非固定化配体之一结合，并产生可检测信号，优选所述可检测分子或信号不需实验设备而可直接读出。
在一个优选例中，本发明的试剂盒包含一种固相载体，其上固定有磷酸酶靶向毒素结合配体；一种能竞争性抑制磷酸酶靶向毒素和所述毒素结合配体的结合，而且无需实验设备即可产生可检测信号的报道分子；能竞争性抑制蓝细菌毒素和所述蛋白磷酸酶的结合的金溶胶标记的肽肝毒素分子。
本发明试剂盒的另一个特别优选的实施例包含磁性可置换性聚合物微球，在其上固定有一种蛋白磷酸酶；能竞争性抑制藻类毒素和所述蛋白磷酸酶结合的金溶胶标记的冈田酸分子。
在另一个优选方面，试剂盒的使用涉及将一种多孔纤维素底物(上面固定有毒素结合配体，并用竞争性结合发色团(或荧光团等)标记的配体浸润)蘸取水或贝类液的样品，温育饱和的底物一段预定时间(从样品或预定体积的样品取出)，通过用无毒素的水冲洗底物，或使底物在预定体积的无毒素的水中浸泡一段时间，来除去未结合的标记配体，并观察底物或浸泡用水的颜色。最好底物固定在载体上，优选用标准颜色标记的载体，能比较底物或浸泡用水的颜色，以确定毒素浓度或指示毒素浓度是否高于或低于一个或多个阈值。
本发明现在将用下列非限制性实施例阐明材料微藻素YR、微藻素LR、冈田酸、节球藻素、花萼海绵诱癌素A和互变霉素购自Calbiochem(San Diego，CA)。从Amersham(Little Chalfont，UK)获得了无载体的Na125I和[γ-32P]ATP。白蛋白(RIA级)、乙酸铵、氯亚明T、二甲基亚砜(DMSO)、二硫赤藓糖醇(DTE)、EDTA、EGTA、甘油、Hepes、组蛋白II-AS、偏亚硫氢酸钠和胰蛋白酶抑制剂(大豆)购自Sigma(St Louis，MO)。乙腈和三氟乙酸(TFA)购自Rathburn(Walkerburn，Scotland)。特别纯化的蛋白磷酸酶2A购自UpstateBiotechnology(Lake Placid，NY)或根据Resink等(欧洲生物化学杂志，133455-461(1993))纯化。
微藻素YR的碘化如Ciechanover等所述(PNAS 771365-1368(1980))，使用氯亚明T，用ImCi无载体的Na125I(37MBq)碘化微藻素YR(10微克)。碘化反应后，用Sep-PakPlus柱(Waters，Milford，MA)按照Runnegar等的方法(Toxicon 24506-509(1986))将[125I]微藻素YR与碘分离。将[125I]微藻素YR加到3×250mm Inertsil ODS-2 HPLC柱(购自Chrompack(Raritan，NJ))上，用乙腈梯度洗脱。
竞争性结合试验在含0.5ml的50mM Hepes(pH7.2)、1mM EDTA、0.3mM EGTA、1mM DTE、5mM MnCl2、0.5mg/mlBSA和0.2mg/ml胰蛋白酶抑制剂的缓冲液中进行竞争性结合试验。在试验中加入0-100nM的以100％DMSO稀释的藻类毒素，最终浓度为10％DMSO。加入35pM的[125I]微藻素YR(1ci/13ng)。最后加入蛋白磷酸酶2A(30pm)，该反应混合物在冰上培育过夜。用SephadexG-50细胶(购自Pharmacia(Uppsala，Sweden))在Bio-Rad(Hercules，CA)的0.7×15cm柱中进行凝胶过滤，将游离的[125I]微藻素YR与结合于蛋白磷酸酶2A的[125I]微藻素YR分开。在4℃进行的分离中使用了含1mM EDTA和0.3mM EGTA的50mM Hepes缓冲液。收集与蛋白磷酸酶2A结合的含[125I]微藻素YR的组分，用闪烁计数定量放射性。在过量加入微藻素LR(1μM)的对照反应中检测非特异性结合的[125I]微藻素YR。
实施例1蛋白磷酸酶2A与磁珠偶联(直接与磁珠或通过磷酸酶的生物素化)。然后将固定化蛋白磷酸酶与样品和放射性标记的毒素(如[125I]微藻素YR)混合。通过磁力使反应混合物与固定化蛋白磷酸酶相分离。用闪烁计数检测与蛋白磷酸酶(磁珠)结合的放射性。和蛋白磷酸酶结合的放射性标记量以样品中磷酸酶结合毒素的函数下降。
实施例2蛋白磷酸酶2A与磁珠偶联(直接与磁珠或通过磷酸酶的生物素化)。然后将固定化蛋白磷酸酶与样品和与着色珠偶联的毒素混合。通过磁力使反应混合物与固定化蛋白磷酸酶相分离。目测或用低倍显微镜(如Nikon TMS)检测与蛋白磷酸酶(磁珠)结合的着色珠。和蛋白磷酸酶(磁珠)结合的着色珠数量以样品中磷酸酶结合毒素的函数下降。
实施例3蛋白磷酸酶2A与磁珠偶联(直接与磁珠或通过磷酸酶的生物素化)。然后将固定化蛋白磷酸酶与样品和固定在携带有固定化酶的珠上的毒素混合。该酶在与发色或发荧光底物一起适当培育，能产生可检测的产物(着色或荧光)。通过磁力将反应混合物与固定化蛋白磷酸酶相分离。用分光光度计或荧光光度计分别测量和蛋白磷酸酶(磁珠)结合的颜色或荧光。和蛋白磷酸酶(磁珠)结合的颜色/荧光量以样品中磷酸酶结合毒素的函数下降。
实施例4闪烁接近试验
生物素化蛋白磷酸酶并将其固定在用链霉亲和素和闪烁材料(如FlashPlatePlus链霉亲和素SMP103，补充了NEN)预包被的孔内。在孔内加入样品和[125I]微藻素YR。用闪烁计数检测和固定化蛋白磷酸酶结合的[125I]微藻素YR量。
实施例5在各种毒素存在下[125I]微藻素YR和蛋白磷酸酶2A结合的抑制测试的化合物1IC502(pM)节球藻素15微藻素LR17微藻素YR75冈田酸 100花萼海绵诱癌素A 251互变霉素5621将测试的化合物和[125I]微藻素YR、蛋白磷酸酶2A一起如上所述培育。
2IC50值代表获得[125I]微藻素YR和蛋白磷酸酶2A结合50％抑制所需的浓度。这些值根据图3确定。数据代表至少3个独立实验的平均值。
实施例6和蛋白磷酸酶试验比较，外源化合物对竞争性结合试验的影响测试的化合物1％活性2竞争性结合试验 蛋白磷酸酶试验2mM ATP 103.34±0.2 9.8±3.40.5mM ATP 101.6±1.7 29.8±5.60.05mM NaPPi101.4±4.1 14.2±1.250mM NaF101.5±1.9 7.7±1.45mM NaF 102.0±3.3 62.6±0.41mg/ml酪蛋白98.64±4.5 3.44±0.20.02mg/ml酪蛋白 98.9±6.1 33.3±4.95mg/ml组蛋白2A 91.9±1.8 1.4±0.10.002mg/ml组蛋白95.2±4.7 63.6±4.00.5M NaCl 41.2±0.7 44.4±1.6海水 34.8±0.4 ND10％海水 87.3±0.4 ND10％DMSO 72.8±2.3 97.9±3.310％MeOH 73.9±0.5 87.4±4.110％乙腈 90.4±5.4 88.2±2.70.4％Triton X-100 122.3±1.060.2±5.70.4％Nonidet P-40 106.0±2.061.1±1.30.4％CHAPS 90.9±9.9 138.0±34.41在冰上预先保温蛋白磷酸酶2A和溶于50mM肝素(pH7.2)的化合物或单独和缓冲液(对照)30分钟。用磷酸组蛋白的去磷酸化如所述测量磷酸酶活性。％活性是相对于对照反应。
2竞争性结合试验中的活性代表相对于单用缓冲液，竞争性结合试验中的活性代表在溶于缓冲液的外源化合物存在下，蛋白磷酸酶2A和[125I]微藻素YR结合的能力。数据代表至少三个独立实验的平均值±SEM。
实施例7节球藻素和微藻素LR结合试验的灵敏度[125I]微藻素YR结合的抑制(％)1毒素(M) milliQ水 饮用水海水 海水1/102节球藻素1E-10 88.37±0.31 88.75±0.16 72.18±0.8267.24±0.665E-11 36.37±2.28 36.12±1.04 48.47±0.7952.98±1.98微藻素-LR 1E-10 84.91±0.42 86.97±1.12 73.31±1.2046.41±5.975E-11 13.87±3.16 12.85±0.88 49.34±3.8238.61±1.491将节球藻素和微藻素LR以所示浓度溶于MilliQ水、饮用水或海水中。如上所述测试了300微升等份的这些溶液与[125I]微藻素YR竞争与蛋白磷酸酶2A的结合的能力。
2以milliQ水稀释的1/10的海水。
数据表示成平均值±SEM。
实施例9用HPLC分析和蛋白磷酸酶结合试验测定贝类抽提物中冈田酸当量抽提物1HPLC分析的OA当量2结合试验的OA当量2(μg/g肝胰腺)(nM) (nM)100 85200 45300 70442480 210051.2 748 75560.8 496 8051从挪威沿海收集的蛤贝肝胰腺制备抽提物。
2用HPLC分析抽提物的冈田酸当量。
3抽提物以100％DMSO稀释，如上所述用竞争试验测试它们和[125I]微藻素YR竞争与蛋白磷酸酶2A结合的能力。将数据与溶于100％DMSO的冈田酸标准曲线比较，确定冈田酸等价物的浓度。
实施例9附图
附1是检测蛋白磷酸酶结合毒素的竞争性结合试验的示意图。
将蛋白磷酸酶2A和[125I]微藻素YR以及另一种针对蛋白磷酸酶2A的毒素一起培育。毒素和[125I]微藻素YR竞争与磷酸酶结合。加入大量毒素导致[125I]微藻素YR和磷酸酶的结合减少，反之亦然。达到结合平衡后，用凝胶过滤层析从游离[125I]微藻素YR中分离出与蛋白磷酸酶2A结合的[125I]微藻素YR。收集含有与磷酸酶结合的[125I]微藻素YR组分，用闪烁计数确定放射量。
附2显示了递增量的不同藻类毒素对[125I]微藻素YR和蛋白磷酸酶2A结合的作用。
在35pM[125I]微藻素YR(1Ci/13ng)和图中所示0-100nM不同的藻类毒素存在下，培育蛋白磷酸酶2A(30pM)。用凝胶过滤层析分离与蛋白磷酸酶2A结合的[125I]微藻素YR，并用闪烁计数确定放射性。每条曲线代表至少3个独立实验的平均值。
附3显示了竞争性结合试验中微藻素LR结合的IC50。
用未结合[125I]微藻素YR(Co-Cx)和结合的[125I]微藻素YR(Cx)之比对微藻素LR浓度作图，表示[125I]微藻素YR和蛋白磷酸酶2A的结合。Co代表显示不存在微藻素YR时，结合的[125I]微藻素YR的量，而Cx代表在各种微藻素LR浓度存在下，结合的[125I]微藻素YR量。
附4表示在过量微藻素LR存在下，和蛋白磷酸酶2A结合的[125I]微藻素YR的稳定性。
在[125I]微藻素YR(100pM)存在下，培育蛋白磷酸酶2A(1nM)1小时。在时间0时，在反应混合物中加入微藻素LR(2μM)。如所述，用凝胶过滤和闪烁计数测定指定时间点和蛋白磷酸酶2A结合的[125I]微藻素YR量。曲线代表了4个独立实验的平均值。
权利要求
1.一种用于测定抑制蛋白磷酸酶的磷酸酶靶向毒素的试验方法，其特征在于，该方法包括使一种上面固定有固定化配体的固相载体接触(i)怀疑被毒素污染的样品和(ii)非固定化配体，其中所述固定化配体能与所述毒素、所述非固定化配体或所述毒素和所述非固定化配体的复合物中的至少一种结合，而所述非固定化配体能和所述固定化配体、所述毒素或所述毒素和所述固定化配体的复合物中的至少一种结合，与所述毒素、所述非固定化配体或所述毒素和所述非固定化配体结合的所述固定化配体的比例取决于所述样品的毒素含量，和其中当未复合时、当所述毒素复合时、当所述毒素和所述非固定化配体的复合物复合时、或当所述非固定化配体复合时，所述固定化配体能产生可直接或间接检测的信号；或当未复合时或复合时，所述非固定化配体能产生可直接或间接检测的信号。将未结合组分与结合组分相分离；和直接或间接测定与固定化配体结合的非固定化配体，即结合组分，或水溶液中未复合的非固定化配体，即非结合组分；其中可以分别、依次或同时将(i)和(ii)施加于固相载体，而且如果分别或依次进行，可不论先后进行。
2.如权利要求1所述的试验方法，其特征在于，所述磷酸酶靶向毒素是由藻类或蓝细菌产生的。
3.如权利要求1或2所述的试验方法，其特征在于，要测定的毒素是肝毒素或冈田酸。
4.如权利要求1-3任一项所述的试验方法，其特征在于，存在于样品中的毒素分子与非固定化配体竞争数量有限的固定化配体的结合位点，而且存在于所述样品中的毒素是根据非固定化配体与固定化配体的结合位点结合或不结合的相对程度测定的。
5.如权利要求1-4任一项所述的试验方法，其特征在于，该方法测定磷酸酶靶向毒素的存在与否。
6.如权利要求1-5任一项所述的试验方法，其特征在于，调查的样品是贝类的表面或游离水、从这些贝类生活的栖息地获得的水或家用供水设施的水。
7.如权利要求1-6任一项所述的试验方法，其特征在于，固定化和/或非固定化配体是抗体或抗体片段。
8.如权利要求1-7任一项所述的试验方法，其特征在于，毒素结合配体是一种蛋白磷酸酶。
9.如权利要求8所述的试验方法，其特征在于，所述蛋白磷酸酶是结合配体蛋白磷酸酶2A。
10.如权利要求1-9任一项所述的试验方法，其特征在于，固定化或非固定化的配体携带一报道分子。
11.如权利要求10所述的试验方法，其特征在于，所述非固定化配体携带一种报道分子。
12.如权利要求11所述的试验方法，其特征在于，非固定化配体是标记的肽肝毒素或标记的冈田酸。
13.如权利要求12所述的试验方法，其特征在于，肝毒素选自节球藻素、微藻素LC或微藻素YR。
14.如权利要求1-13任一项所述的方法，其特征在于，固相载体是一种蘸棒或固相基质。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述固相基质是聚合物珠或磁性珠。
16.一种根据本发明检测磷酸酶靶向毒素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含一种固定有一种配体的固相载体；一种非固定化配体，优选在水溶液中或与固定化配体复合的；所述固定化和非固定化配体都不含可直接或间接检测的分子，一种报道分子能够和所述固定化和非固定化配体之一结合，并产生可检测信号，优选所述可检测分子或信号不需实验设备可直接读出。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述磷酸酶靶向毒素由藻类或蓝细菌产生。
18.如权利要求16和17所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含一种其上固定有磷酸酶靶向毒素结合配体的固相载体；一种能竞争性抑制磷酸酶靶向毒素和所述毒素结合配体的结合，而且无需实验设备即可产生可检测信号的报道分子。
19.如权利要求16-18任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含其上固定有一种蛋白磷酸酶的磁性可置换的聚合物微球；能竞争性抑制蓝细菌毒素和所述蛋白磷酸酶结合的金溶胶标记的肽肝毒素分子。
20.如权利要求16-18任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含固定有一种蛋白磷酸酶的可磁性置换的聚合物微球；能竞争性抑制蓝细菌毒素和所述蛋白磷酸酶结合的金溶胶标记的冈田酸分子。
21.权利要求16-20任一项所述的试剂盒用于测定磷酸酶靶向毒素的用途。
全文摘要
本发明提供了一种试验方法,测定抑制蛋白磷酸酶的磷酸酶靶向毒素,包括使其上固定有固定化配体的固相载体接触:(i)怀疑被毒素污染的样品,和(ii)非固定化配体,其中所述固定化配体当未复合时、当与所述毒素复合时、当与所述毒素和所述非固定化配体的复合物复合时、或与所述非固定化配体复合时,能产生可直接或间接检测的信号,或所述非固定化配体能在未复合时或复合时,产生可直接或间接检测的信号,将结合组分与非结合组分分开;并直接或间接检测与固定化配体(结合组分)结合的非固定化配体、或水溶液中的未复合的配体(非结合组分)。
文档编号G01N33/553GK1338051SQ99814568
公开日2002年2月27日 申请日期1999年11月11日 优先权日1998年11月11日
发明者S·O·多史凯兰德, M·H·塞尔, K·E·弗拉德马克 申请人:巴依奥桑斯实验室联合股份有限公司