一种检测大肠杆菌的生物传感器及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及传感器技术领域，特别涉及一种检测大肠杆菌的电化学传感器，还涉 及一种检测大肠杆菌的电化学传感器的制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，致病性大肠杆菌对生产发展的危害越来越严重。分析原因主要有以下几 点：单纯由致病性大肠杆菌所引起的原发病较少，并发、继发的形式增多，间接增加了大 肠杆菌病的危害。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研宄表明， 大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜 粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为 主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
[0003] 如果食品的菌落总数严重超标，说明其产品的卫生状况达不到基本的卫生要求， 将会破坏食品的营养成分，加速食品的腐败变质，使食品失去食用价值。消费者食用微生物 超标严重的食品，很容易患痢疾等肠道疾病，可能引起呕吐、腹泻等症状，危害人体健康安 全。而大肠菌群超标，也同样会引起腹泻、肠胃感染等。
[0004] 检测大肠杆菌的传统方法主要有三种，分别是多管发酵法、滤膜法和平板计数法， 这些方法有仪器操作复杂，需要专业操作人员等缺点。
[0005] 滚环复制放大技术是借鉴自然界中环状DNA分子滚环式的扩增机制而发展起来 的一种核酸扩增技术，这种扩增形式能在同温下对单链环状DNA进行相对无限单链扩增， 不需要特定的热循环仪，且每条链使用1-2个引物就能实现指数扩增，并具有快速、特异、 灵敏等特点，因而近年来在一些基因检测技术的研宄中被广泛采用。由于滚环复制的模板 必须是封闭的单链环状DNA，因而许多研宄者将这一特性用于单核苷酸多态性检测、基因表 达图谱和病毒基因检测等的研宄中，还有一些实验直接将滚环的无限复制作为一种信号放 大系统，并在此基础上开发出许多相关的技术。
【发明内容】
[0006] 针对现有检测方法中仪器操作复杂，需要专业操作人员的缺陷，本发明提供了一 种检测大肠杆菌的电化学传感器。
[0007] 本发明还提供了检测大肠杆菌的电化学传感器的制备方法。
[0008] 本发明的技术方案如下： 一种检测大肠杆菌的电化学传感器，从内到外依次为金电极、戊二醛-大肠杆菌抗体 层、牛血清白蛋白封闭层、大肠杆菌层和RCA产物层。
[0009] 所述的戊二醛-大肠杆菌抗体层厚度为120±10nm，牛血清白蛋白封闭层厚度为 100±10nm，RCA产物层厚度为 55±10nm。
[0010] 所述的电化学传感器，是通过如下步骤制备得到的： 1.制备环状挂锁探针： (1) 取3yL挂锁探针9uL连接探针于已灭菌的IOOuL离心管内，加入6uIT 4DNA连接酶缓冲溶液，50yL灭菌水，震荡均匀，生料带封闭； (2) 将此离心管放入95°C恒温lOmin，37°C恒温2h，使之杂交完全； (3 )加入2yLT4DNA连接酶，封口膜封口，16 °C恒温2h，是挂锁探针连接完全后，65 °C恒 温20min使T4DNA连接酶变性； (4)加入Iy1核酸外切酶I在37°C保温Ih将连接探针水解后80°C恒温20min使核酸 外切酶I变性； 2. 金电极的预处理； 3. 配制2%的戊二醛溶液，以此溶液将大肠杆菌抗体交联到电极表面，60min干燥，用 二次水和PBS冲洗电极除去未结合的抗体，得戊二醛-大肠杆菌抗体层； 4. 待用二次水冲洗几次之后，在戊二醛-大肠杆菌抗体层后修饰牛血清白蛋白，使牛 血清白蛋白封闭未特异性结合的位点，得牛血清白蛋白封闭层； 5. 电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，在大肠杆菌菌液中孵育，并用PBS缓冲液冲， 大肠杆菌由于和捕获电极之间的特异性结合而结合到电极上得大肠杆菌层； 6. PBS冲洗，在适配体-引物的PBS溶液中孵育，适配体通过与目标物之间的强识别 能力，被修饰在电极表面，再在其上修饰步骤1所得环状挂锁探针，后加入到含IUldNTP、 Iylphi29DNA聚合酶、IyIBSA的溶液中37°C孵育2h完成RCA反应得RCA产物层。
[0011] 所述的电化学传感器，优选RCA产物制备中挂锁探针和适配体-引物物质的量比 为 3:1〇
[0012] 所述的牛血清白蛋白的浓度为0. 1%。
[0013] 检测时采用三电极系统，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，修饰电极为 工作电极，以含对苯二酚和双氧水的PBS为工作底液采用差分脉冲伏安法检测，电位设置 为O到-0. 6V，脉冲宽度0. 05V，脉冲宽度扫描为0. 06S，进行检测。
[0014] 本发明的工作原理：
【主权项】
1. 一种检测大肠杆菌的生物传感器，其特征在于，从内到外依次为金电极、戊二醛-大 肠杆菌抗体层、牛血清白蛋白封闭层、大肠杆菌层和RCA产物层。
2. 根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述的戊二醛-大肠杆菌抗体层厚 度为120± 10nm，牛血清白蛋白封闭层厚度为100± 10nm，RCA产物层厚度为55±IOnm0
3. -种权利要求1或2所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，是通过如下步骤制 备得到的： 1)制备环状挂锁探针： 取3yL挂锁探针9uL连接探针于已灭菌的I0 0uL离心管内，加入6uIT4DNA连接酶缓冲溶液，50yL灭菌水，震荡均匀，生料带封闭； 将此离心管放入95°C恒温lOmin，37°C恒温2h，使之杂交完全； 加入2yLT4DNA连接酶，封口膜封口，16°C恒温2h，是挂锁探针连接完全后，65°C恒温 20min使T4DNA连接酶变性； 加入IU1核酸外切酶I在37°C保温Ih将连接探针水解后80°C恒温20min使核酸外 切酶I变性； 2) 金电极的预处理： 3) 配制2%的戊二醛溶液，以此溶液将大肠杆菌抗体交联到电极表面，60min干燥，用二 次水和PBS冲洗电极除去未结合的抗体，得戊二醛-大肠杆菌抗体层； 4) 待用二次水冲洗几次之后，在戊二醛-大肠杆菌抗体层后修饰牛血清白蛋白，使牛 血清白蛋白封闭未特异性结合的位点，得牛血清白蛋白封闭层； 5) 电极在PBS缓冲液中充分搅动清洗后，在大肠杆菌菌液中孵育，并用PBS缓冲液冲， 大肠杆菌由于和捕获电极之间的特异性结合而结合到电极上得大肠杆菌层； 6. PBS冲洗，在适配体-引物的PBS溶液中孵育，适配体通过与目标物之间的强识别 能力，被修饰在电极表面，再在其上修饰步骤1所得环状挂锁探针，后加入到含IUldNTP、 Iylphi29DNA聚合酶、IyIBSA的溶液中37°C孵育2h完成RCA反应得RCA产物层， 所述挂锁探针的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示； 所述连接探针的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示； 所述适配体-引物的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，挂锁探针和适配体-引物的物质的量 比为3:1。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的牛血清白蛋白的浓度为0. 1%。
【专利摘要】本发明公开了一种检测大肠杆菌的生物传感器，从内到外依次为金电极、戊二醛-大肠杆菌抗体层、牛血清白蛋白封闭层、大肠杆菌层和RCA产物层，同时公开了生物传感器的制备方法，本发明提供的生物传感器的电极性能稳定，重复性好，检出限为1.6×10cfu mL-1。
【IPC分类】G01N27-327, G01N27-26
【公开号】CN104764774
【申请号】CN201510031787
【发明人】王玉, 郭玉娜, 黄加栋, 刘素, 徐伟, 王虹智, 许颖, 邱婷婷, 崔洁
【申请人】济南大学
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年1月22日