可以在用于氧化的表面的涂层剂、增粘剂或粘合剂中使用的肽的制作方法
【专利说明】可以在用于氧化的表面的涂层剂、增粘剂或粘合剂中使用 的肽
[0001] 本发明涉及用于氧化的表面的涂层剂、增粘剂或粘合剂，含肽，尤其是十二肽，涉 及含有完全或部分由十二肽组成的化合物的多层复合物或经涂覆的基质，所述化合物作为 所述复合物的至少两个相邻层之间或涂层与基质之间的增粘剂，还涉及可以用作用于氧化 的表面的涂层剂、增粘剂或粘合剂的十二肽。
[0002] 在氧化的表面的涂层或着色的领域，已知的促进粘附的方法涉及双功能的有机硅 烷化合物，例如，所述方法建立了涂料的聚合物基体和无机基质之间的化学键。这些增粘剂 的缺点之一是仅当可以与硅烷相互作用的羟基基团存在于基质的表面上，才能确保最佳粘 附。因此，许多情况下，基质的复杂预处理对于表面的硅烷化是必要的。另外，定制材料的 制造是非常复杂的，此外，并不是对于所有基质，定制材料都是已知的。
[0003] 自1940年以来，对自组装单层膜（SAM，也称为自组织单层膜）进行了研宄和描述， 但直到1983年人们才开始努力对这种组织方法的进行技术利用。
[0004] 原则上，自组装单层膜有两个不同的活性基团，在它们之间存在间隔物，例如脂肪 族间隔物。其一个基团与表面相互作用，而另一端的基团具有特定性质或连接到另一个官 能化合物。SAM形成抵抗水的侵害的化学键，同时，所述化学键能够防止所有在夹层的电化 学反应。在固体表面上的单分子层的自组织提供用于生产具有一定组成、结构以及厚度的 夹层的有效方法。选择性自组织增粘剂具有的优点是，它们保证涂料层和粘合剂层以长使 用寿命粘附到金属表面，这在汽车领域是必要的，例如防腐蚀的进一步改进。所述自组织增 粘剂还允许均匀的涂料层的一贯良好地粘附在复合材料上，其正在越来越多地使用，并且 具有不同的表面，如塑料-金属复合材料。
[0005] 自组织单层用于半导体技术，例如，对于电极的表面稳定化和定制官能化。渗透性 和电荷传送速率收到影响，取决于所用的烷基链的长度。应用自组织单层膜的领域非常广 阔。自组织单层膜的技术尤其应用于电化学扫描隧道显微镜、细胞研宄、传感器系统和纳米 电子学。然而，在现有技术中所描述的SAM的生产复杂且成本高。
[0006] 无机基质和生物学成分耦合以修饰表面特性在仿生学中是已知的。从噬菌体文库 选择的呈现短肽的噬菌体已用于，例如，沉淀和分离无机材料（W0 2003/078451)。此外，无 机基质和特异性肽配体组成的混合材料被用作改变基质表面的潜在方法。然而，鉴定与基 质匹配的生物配体（通常是肽）耗时且成本高，并且在此之前已排除具体应用。在现有技 术中提出了用于结合两个无机成分的双功能配体概念。特别地，例如，在WO 2004/035612 中描述了，通过有双功能结合性质的噬菌体，将细胞或生物分子与聚合物基质，尤其是掺杂 氧化氯的聚吡咯（PPyCI)或聚（乳酸共乙醇酸）（PLGA)结合。没有进一步描述进一步结合 到另一种物质，其不是所用噬菌体的生物学结合伴侣，例如涂层材料；这种结合同样将必须 选择性发生以及需要配体和进一步的结合成分的完全匹配。
[0007] 因此，对于提供新型化合物有很大的需求，所述化合物适合于在氧化的表面上使 用，以及避免所述的现有技术的缺点。
[0008] 已经令人惊奇地发现，某些十二肽用作用于氧化的表面的涂层剂、增粘剂或粘合 剂具有优势。
[0009] 因此，本发明的主题涉及一种定量方法，用于确定粘附的肽，尤其是十二肽在氧化 的表面上的粘附性质，其特征在于：
[0010] a)将含肽溶液施加到有氧化的表面的运载体，并使其干燥，
[0011] b)通过洗涤，从所述运载体上去除未结合的肽，并使运载体干燥，
[0012] c)用染色溶液对粘附于运载体的肽进行染色，将剩余的染色溶液洗掉，并使所述 运载体干燥，
[0013] d)用提取溶液将粘附于运载体的染色的肽从运载体上去除，含有染色的肽的上清 经过分光光度计测量。
[0014] 优选地，根据的发生通过所述肽的简单非特异性的染色，例如使用考马斯染色溶 液的染色，或者通过导致特异性结合的化学反应，与例如茚三酮的化学反应，进行本发明的 方法的步骤C)中的染色。
[0015] 尤其有利地，本发明的定量方法的步骤a)到d)如下实施：
[0016] 在步骤a)中，将2份10 yL的肽溶液，浓度为2mg/mL，溶于1XPBS，pH 7. 4来 自Gibco,施加到直径为2. 3cm的圆形H⑶钢板，其中第一个10 μ L干燥大约15分钟，第 二个10 μ L随后滴到相同的位置，干燥30分钟，接着在来自UVP Laboratory Products的 HB-1000杂交炉里，在30°C，存在200毫升水的情况下干燥。
[0017] 在步骤b)中，将板置于直径19cm的含有1升pH 7. 4的PBS的用于洗涤的结晶皿 中，并以60rpm在来自B. Braun的Certomat U水平摇床中在室温轻微摇动10分钟，并随后 在30 °C下干燥。
[0018] 在步骤c)中，将所述板转移到6孔皿中，并将150 μ L的考马斯蓝染色溶液用移 液管吸取到所述板上，所述溶液配方为含有2g考马斯亮蓝R-250、0. 5g考马斯亮蓝G-250、 50mL甲醇、425mL乙醇、IOOmL冰醋酸，加入蒸馏水到1000毫升，30秒后，将6mL lXPBS，pH 7. 4小心地加在皿的边缘以冲洗掉染色溶液，并两次将所述板移入6mL I XPBS，pH 7. 4中 以去除剩余的染色溶液，之后将所述板在30°C短暂干燥。
[0019] 在步骤d)中，将20 μ L体积比9 :1的DMS0/CH3C00H提取溶液用移液管吸取到染 色斑点上，允许所述提取溶液在室温作用5分钟，随后通过用移液管吹打直到斑点完全从 所述板上去除，将液体取出，将上清液转移到一个反应容器中，之后2 μ L的上清液在来自 PeqLab的Nanodrop 1000分光光度计中测量，选择602nm的UV VIS程序，以确定与氧化的 表面上的肽的粘附强度相关的颜色强度。
[0020] 根据本发明的适合的氧化的表面的实例是钢、玻璃、石英、金属氧化物（例如B20 3、 Al203、Si02、Fex0 y)、陶瓷、磷酸盐化的铁、岩石、砖和混凝土，尤其优选钢。角蛋白纤维和氧化 的聚合物或适当功能化的聚合物也可以形成根据本发明的适合的氧化的表面。
[0021] 有利地，根据本方明的定量方法允许客观测定氧化的表面上的肽的粘附强度，尤 其是钢表面上的十二肽。
[0022] 本发明进一步的主题涉及肽，尤其是十二肽，其在根据本发明的定量方法步骤d) 中的测量中，吸收范围为〇. 25-1，优选为0. 4-1，更优选为0. 5-1，特别优选为0. 6-1，以及非 常特别优选为〇. 7-1。
[0023] 借助于根据本发明的定量方法，已经鉴定了其氨基酸序列对应于表1中所示的序 列模式的十二肽，其中"X"代表任何氨基酸；这些十二肽代表了本发明的进一步的主题。
[0024] 根据本发明，优选的十二肽是那些在十二个位置的至少八个对应于表1中所示的 序列模式的十二肽。特别优选的十二肽是那些在十二个位置的至少十个符合表1中所示的 序列模式的十二肽。
[0025] 根据本发明非常特别优选的十二肽是表1中所列的肽8和9,以及表2中所列的肽 6和7〇
[0026] 本发明的进一步主题涉及表2中所列的肽10、13、15和17尤其是肽13和15。
[0027] 本发明的进一步主题涉及编码本发明的肽的核酸，特别是表3中所列的核酸序 列。
[0028] 在本专利申请的意义上说，肽是指由天然氨基酸组成的聚合物，具有大的线型结 构，且比天然蛋白质小。在本专利申请中，19个蛋白原的，天然存在的L-氨基酸由国际通用 的单字母和三字母代码表示。
[0029] 根据本发明的肽，尤其是十二肽，可用已知的肽合成方法化学生产，例如通过根据 Merrifield的固相合成。
[0030] 然而，优先使用重组方法生产本发明的肽，尤其是十二肽。根据本发明，这是指基 于将感兴趣的肽的基因导入适于生产