一种c-反应蛋白免疫传感器及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属免疫检测技术，具体涉及基于氨基化石墨烯和银铂纳米材料的C 一反应 蛋白免疫传感器及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 进入21世纪以来，心血管疾病已经取代过去的传染病，成为人类健康的第一杀 手，占据人类死亡率的1/3之多，而冠心病又占据了其中50%以上。对于冠心病的发病机 制，研宄认为是多种致病因素共同作用的结果。动脉粥样硬化是冠心病发生的病理基础， 而在动脉粥样硬化的发生、发展过程中，炎症反应贯穿始终，并且炎症因子充当着重要的角 色。C 一反应蛋白（C 一 reactive protein, CRP)是最新发现的冠心病相关炎性因子，在动 脉粥样硬化的发生发展过程中起重要作用。人类C反应蛋白（CRP)是在感染和组织损伤时 血浆浓度快速、急剧升高的主要急性期蛋白。近十年的研宄揭示，CRP直接参与导致了炎症 以及导致动脉粥样硬化等心血管疾病，并且是心血管疾病最强的预示因子与危险因子。目 前，CRP被广泛应用于心血管疾病的临床早期诊断及鉴别诊断，此外CRP的测定对于肿瘤的 治疗和预后也有积极意义，因此发展灵敏、准确、快速的CRP检测方法在临床上具有重要意 义。
[0003] 目前血清中CRP的检测主要基于免疫学原理；临床常用的检测方法有免疫浊度法 和比浊法，以及酶联免疫吸附、荧光、放射、化学发光等方法。由于上述方法普遍不够敏感， 耗时长，容易产生假阴性结果或者成本高，效益低，并且操作繁琐、仪器庞大、不适合于冠 心病潜在人群的现场筛查。开发简便、价廉、精确且易于推广的CRP现场快速检测方法是解 决大规模样品筛查，实现冠心病早期诊断的关键之一，意义重大。免疫传感器具有成本低， 灵活性强和高灵敏度，快速和便携等优点，最具发展前景，在临床类样品检测中应用越来越 广泛。目前报道的夹心法型酶联免疫传感器常用辣根过氧化物酶做标记物，存在易失活， 实验条件苛刻，不易保存，制备困难，成本高等缺点，无法满足现场快速检测的需要。解 决上述问题的关键在于寻求新型的抗体标记材料，实现稳定性高，易制得，分析灵敏度高 等目的。
[0004] 石墨烯由一层二维平面排列的碳原子层组成，赋予石墨烯良好的导电性。纳米复 合材料的概念是由Rey和Komarneni在20世纪80年代初提出的。由于形成复合纳米颗粒 的两种金属之间存在协同作用，复合纳米颗粒表现出多样的功能和独特性能。双金属纳米 合金粒子可以通过第二种金属的加入对复合组分的物理和化学性质加以调节，使其能广泛 应用于催化、光电子学、信息存储、生物标记等众多领域。2013年，mi等制备了哑铃形状的 Pt - Fe3O4纳米材料，用它标记鳞状细胞癌抗体，利用Pt - Fe 304纳米材料的过氧化物模拟 酶活性，催化H2O2，制备了一种超灵敏的电化学免疫传感器检测鳞状细胞癌。Niu等制备了 雪花状的Pt/Pd双金属合金，修饰丝网印刷金电极，制备过氧化氢传感器。实验表明Pt/Pd 双金属合金对过氧化氢的催化能力远远高于单独的Pt和Pd。2014年，Chang等发现Pt/Ir 复合纳米材料也具有过氧化物模拟酶活性，基于Pt/Ir复合纳米材料制备了过氧化氢传感 器。吴晓春课题组制备了不同形貌和结构的Ag/M(M = Au,、Pd、Pt)合金纳米粒子，这些纳 米粒子具有类似HRP性质的过氧化物模拟酶催化活性。至今没有基于氨基化石墨烯和银铂 纳米材料的C 一反应蛋白免疫传感器的报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种C 一反应蛋白免疫传感器及其使用方法，实现CRP的 定量检测，从而为冠心病等疾病的早期发现、鉴别诊断以及疗效监测提供可靠的技术平台。
[0006] 本发明C 一反应蛋白免疫传感器的特征是按如下方法制得：以中空银铂纳米颗粒 作为标记物标记C 一反应蛋白抗体，以氨基化石墨稀为固定基质将C 一反应蛋白抗体固定 在电极上，制成夹心型的免疫传感器。进一步的优化特征是：中空银铂纳米颗粒中银铂的质 量分数比为5:1.9~2. 1，抗体固定的质量浓度为9~11 μ g/mL。中空银铂纳米材料的合 成方法为现有技术。
[0007] 本发明C 一反应蛋白免疫传感器的工作原理：利用中空银铂纳米材料的催化活 性，通过夹心法检测C反应蛋白。具体说，就是中空银铂纳米材料模拟酶催化H 2O2的还原， 产生电流响应信号，该电流响应信号与培育的CRP抗原浓度成正比，通过这种比例关系，实 现CRP的定量检测。
[0008] 本发明传感器的使用方法：在0. 009~0.0 llmol/LPBS缓冲溶液中，用该传感器做 工作电极，在一 〇. 19~0. 21V恒电位下加入99~IOlyL lmol/L的H2O2进行计时电流的 测定，根据该传感器计时响应达到稳定时的电流值与样品中CRP浓度成正比的关系，实现 对CRP的定量测定。在最优实验条件下，该传感器的检测范围为0. 5mg/L - 140mg/L，线性 相关系数为〇. 9934,检测下限为0. 17mg/L。
[0009] 本发明的有益效果：检测的灵敏灵敏度高，准确快速，稳定性好，传感器容易制备。
【附图说明】
[0010] 图1为实施例传感器制备和检测流程示意图。
[0011] 图2为实施例不同银铂质量分数比的银铂纳米材料的透射电镜图。
[0012] 图3显示实施例不同银铂质量分数比的纳米材料修饰电极的响应电流比较.
[0013] 图4显示实施例不同修饰电极对H2O2还原电流的催化效应。
[0014] 图5为实施例传感器在不同溶液中的循环伏安曲线。
[0015] 图6显示实施例扫描速度对电极响应电流的影响。
[0016] 图7为实施例不同修饰电极在5mmol/L K3Fe(CN)/K4Fe(CN)6溶液中的交流阻抗 图。
[0017] 图8显示实施例不同固定抗体浓度对传感器响应电流的影响。
[0018] 图9显示实施例CRP抗原培育时间的影响。
[0019] 图10显示实施例标记抗体培育时间对传感器响应效应电流的影响。
[0020] 图11为实施例传感器对不同浓度的CRP响应的工作曲线。
[0021] 图12显示实施例免疫传感器的选择性。
【具体实施方式】
[0022] 见以下实验：
[0023] 1、仪器和试剂
[0024] C -反应蛋白单克隆抗体（anti - CRP)(抗体效价是L 6X KT 1VoL)、抗原 (CRP)购于上海领潮生物科技有限公司，硝酸银（AgNO3)购于上海旭达精细化工厂，氯铂酸 (H 2PtCl6)购于昆明铂锐金属材料有限公司，聚乙烯吡咯烷酮（PVP，K - 30)购于国药集团 化学试剂有限公司，硫化钠（Na2S)购于西陇化工股份有限公司，氯化钠（NaCl)购于广东 光华化学试剂有限公司，乙二醇、无水乙醇均购于天津市风船化学试剂科技有限公司，壳聚 糖（CHIT)、戊二醛（GA)、牛血清蛋白（BSA)、磷酸缓冲溶液（PBS，pH 7. 4)均购于美国Sigma 公司。四氨基修饰的氨基化石墨烯（順2-冗0)购于南京先丰纳米材料科技有限公司，实 验中所用的 eluent buffer 溶液为：20mM Na3PO4. 12H20(0.076g), 10% Sucrose(Ig), 5 % BSA(0. 5g)，0. 25% Tween20(22. 7 yL)，定容至10mL。实验中所用试剂均为分析纯，所用水 为二次蒸馏水。
[0025] CHI660D电化学工作站为中国上海辰华仪器公司产品；实验使用三电极体系，饱 和甘汞电极为参比电极，免疫传感器为工作电极，铂电极为对电极；JEM2100透射电镜为日 本电子株式会社产品；TGL16离心机为长沙湘智离心机仪器有限公司产品；CS501超级恒温 器为重庆实验设备厂产品。
[0026] 2、中空银铂纳米材料的合成
[0027] 按现有技术[例如文献：冊1?0叩，皿6皿叩一（>);[，皿]1311 - (^叩· J.Light Scattering，2012, 24 (3) :316-320 吴绒，胡冠琦，胡建强·光散射学 报，2012, 24(3) :316-320]合成了中空银铂纳米材料。首先加60mL(0. 01M)硫化钠、3mL的 乙二醇（EG)和0. 167g聚乙烯吡咯烷酮于圆底烧瓶中，并在145°C下加热五分钟，磁力搅拌。 然后将3mL的（0. 1M)的硝酸银的乙二醇溶液滴入，在160°C下反应I. 5h，待冷却到一定温 度后，将适量氯铂酸液慢慢滴加到烧瓶中，反应一定的时间，得到空心的Ag/Pt纳米材料。 在8000rpm下离心20min。取沉淀物加入饱和的NaCl溶液溶解，与之反应生成AgCl，再在 8000rpm下离心20min。取沉淀物分别用乙醇、水各洗涤3遍。最后，将沉淀物在二次蒸馏 水中超声并分散保存。
[0028] 3、中空银铂纳米材料标记C 一反应蛋白抗体
[0029] 取ImL浓缩的中空银铂纳米颗粒，用200mM Na2CO3调节pH为9。加入I. 2mg/mL抗 体10以1^每次加2以1^，分五次加完，每次间隔311^11。振摇培育211。加834(1%)约25 4 1^ 进行封闭，反应半小时。最后，低温离心15min，弃上层清液，下层沉淀物质用PBS洗涤2次， 洗完后分散在ImL eluent buffer 4°C度保存。
[0030] 4、C 一反应蛋白免疫传感器的制备
[0031] 将玻碳电极用金相砂纸打磨后，依次再用三种不同粒径的Al2O3粉打磨，然后依次 用HNO 3Q : 1)、无水乙醇和蒸馏水超声清洗lOmin。取2mg/mL的氨基化石墨稀与0. 5%的 壳聚糖按体积比1:1的比例混合，取10 μ L滴加到电极表面，4°C过夜。然后在电极上滴加 10 μ L 0· 5mg/mL的戊二醛（GA)于4°C反应0· 5h后，电极用PBS溶液冲洗3遍，自然晾干。 最后，在电极上滴加IOuL lOyg/mL的CRP抗体，4°C环境下过夜。修饰好的玻碳电极用 PBS溶液滴洗三次，自然晾干后用1% BSA(牛血清蛋白）封闭电极表面的非特异性结合位 点lh。取出后用PBS溶液冲洗干净，即可用于实验中C 一反应蛋白的测定。
[0032] 5、检测方法
[0033] 将不同浓度的CRP抗原滴加于免疫传感器上，于37°C恒温培育50min，用PBS冲 洗。然后滴加10 μ L的中空Ag/Pt标记的CRP抗体，恒温培育45min后用PBS冲洗。在 0· lmol/LPBS缓冲溶液中，用该传感器做工作电极，在一 0· 2V恒电位下加入100 yL Imol/ L的H2O2进行计时电流的测定。根据该传感器计时相应达到稳定时的电流值与样品中CRP 浓度成正比的关系，实现对CRP的定量测定。图1为上述传感器制备和检测流程示意图。
[0034] 6、结果与分析
[0035] (1)材料表征