一种检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的elisa试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的ELISA 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 猪传染性胃肠炎（transmissible gastroenteritis, TGE)是由冠状病毒科、冠状 病毒属的猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus, TGEV)引起的一 种急性、高度接触性传染病，以呕吐、严重水样腹泻、脱水和对2周龄以内仔猪高度致死率 为特征。TGE是一种世界范围内流行的疾病，国际兽疫局（OIE)将其列为B类疾病中必检的 猪传染病，因此，TGE诊断技术的研宄具有重要的意义。
[0003] 目前对于TGEV的诊断主要是依靠RT-PCR方法，该方法对实验设备和条件要求较 高，不适合临床上的大规模快速诊断。应用各种免疫血清学技术对疫病做出准确、迅速的 诊断是预防和控制该病的重要措施之一。ELISA法具有简便、快速、特异性强等优点，而且 ELISA检测抗体能够评价疫苗的免疫效果，但需要抗原纯度较高且免疫原性良好。TGEV N 蛋白分子质量为35~48kDa、磷酸化的核衣壳蛋白，N蛋白是病毒粒子内部的一种蛋白质， 主要构成病毒的核蛋白，它包绕基因组RNA，呈螺旋式结构，直径9~16nm，使其易掺入病毒 中，体外复制时，N蛋白制备的抗血清能抑制90%的基因RNA的合成。N蛋白含有蛋白水解 位点，通过蛋白水解作用和去磷酸化作用，对病毒粒子的装配起重要作用。N基因可诱导机 体产生细胞免疫，而由于核蛋白的高度保守性，对核蛋白作为诊断抗原的研宄也受到人们 的广泛重视。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种检测TGEV抗体的ELISA试剂盒及其应用。该试剂盒成 本低廉、操作简便，为TGEV的检测提供了一种快捷易用的血清学诊断方法，市场前景良好。
[0005] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0006] -种检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的ELISA试剂盒，包括以下组分：
[0007] DELISA板条：以猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白作为包被抗原，ELISA板条经 5% (M/V)脱脂乳封闭，以包装袋密封包装于4°C保存；
[0008] 2)洗涤液：含0. 05 %吐温-20的pH7. 4磷酸盐缓冲液（PBS-T);
[0009] 3)血清稀释液：5% (M/V)脱脂乳；
[0010] 4)底物显色液：已加入H2O2的TMB溶液；
[0011] 5)羊抗猪酶标二抗：已用血清稀释液稀释至工作浓度1:10000的羊抗猪酶标二 抗；
[0012] 6)终止液：2M H2SO4溶液；
[0013] 7) TGEV 阳性血清；
[0014] 8) TGEV 阴性血清。
[0015] 本发明所述的猪传染性胃肠炎病毒重组N蛋白通过以下步骤制备：
[0016] 1)以猪传染性胃肠炎病毒TGEV的RNA作为材料，通过RT-PCR方法扩增获得其N 基因，基因登录号JX827607. 1，扩增片段大小为816bp，并以pET-28a质粒作为载体构建重 组质粒pET-28a-N，N基因与pET-28a载体分别用BamH I与Sal I双酶切后，连接构建重组 质粒pET-28a-N，双酶切鉴定重组质粒；
[0017] 2)将阳性重组表达质粒pET-28a-N转化BL21 (DE3)感受态细胞，获得阳性质粒菌 单克隆pET-28a-N/BL21 ;该单克隆于37°C培养，待A600值达到0. 4~0. 6时，加入IPTG至 终浓度为〇. 8mmol/L进行诱导表达，收集诱导表达后6h的菌体，进行SDS-PAGE鉴定，取诱 导表达后6h的菌体，超声破碎，离心后分别取上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定，根据电 泳结果，取上清表达液进行Western blot鉴定，大量诱导表达N蛋白，超声破碎，取上清表 达液，使用Ni-TED柱进行纯化，收集IxElution Buffer洗脱所得纯化蛋白。
[0018] 本发明所述的ELISA试剂盒具体操作步骤如下：
[0019] 1)加入血清样品：
[0020] 用血清稀释液5 % (M/V)脱脂乳将待检血清做1:80稀释后，每孔加入100 μ L，每 一血清样品添加两孔，同时设立TGEV阴、阳性血清作为对照，各添加两孔；室温下作用30分 钟，弃去反应孔中的液体：每个孔用200 μ L洗涤液充分清洗5次，每次5分钟，每次洗涤后 将反应孔中的液体除去，最后一次除去洗涤液后，充分除去残留的液体；
[0021] 2)加入羊抗猪酶标二抗：
[0022] 每孔加入100 μ L羊抗猪酶标二抗，室温作用30分钟，按步骤（1)中方法洗涤；
[0023] 3)加入底物显色液：
[0024] 每孔加入100 μ L已加入H2O2的TMB溶液，室温下避光作用10分钟；
[0025] 4)终止反应：
[0026] 每孔加入100 μ L 2Μ H2SO4终止液，终止显色反应；
[0027] 5)用酶标仪测定OD值：
[0028] 使用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光光度（OD)值；
[0029] 6)结果判定：
[0030] 间接ELISA检测时加入阳性血清、阴性血清，用酶标仪在450nm波长下测定OD值。 试验成立的条件是：阳性对照孔0D450值均应该3 I. 0且〈3. 0,阴性对照孔0D450值均应 该兰0. 2。计算各份血清0D450与阳性对照孔0D450的比值KQ，当样品KQ值彡26. 768时 为阳性，< 26. 768时为阴性。
[0031] 本发明的有益效果为：本发明ELISA试剂盒，使用猪传染性胃肠炎病病毒（TGEV) 重组N蛋白作为包被抗原，该蛋白为TGEV N基因重组pET-28a-N表达载体的原核表达产物， 易于制备与纯化，免疫反应性良好，该蛋白纯化后作为包被抗原，其浓度易于确定与控制， 有利于该试剂盒的大量生产与成本控制；本发明试剂盒用于检测猪传染性胃肠炎病毒的抗 体，经检验，该试剂盒特异性、敏感性、重复性均良好。该试剂盒检测准确、操作简便，适合 于在临床应用中进行推广，为猪传染性胃肠炎病的快速检测提供了可靠手段。
【附图说明】
[0032] 图1是pET-28a-N/BL21表达菌阳性单克隆鉴定；M :DS 15000Marker ;1 :阳性 pET-28a-N/BL21 菌单克隆；2 :阴性 pET-28a-N/BL21 菌单克隆；
[0033] 图 2 是 TGEV N 蛋白的诱导表达；M :Prestained Peotein Ruler ;1 :诱导后 pET-28a-N/BL21菌液样品；2 :未诱导的pET-28a-N/BL21菌液样品；
[0034] 图 3 是 N 蛋白可溶性表达鉴定；M :BlueRay Prestained Peotein ladder ;1 :超声 破碎后上清液样品；2 :超声破碎后包涵体样品；
[0035] 图 4 是 Western Blot 鉴定；M :BlueRay Prestained Peotein ladder ; 1 :诱导后 pET-28a-N/BL21 菌液样品；
[0036] 图 5是N蛋白的纯化；M :BlueRay Prestained Peotein ladder ; 1 :第 ImL洗脱液； 2 :第2mL洗脱液；3 :第3mL洗脱液。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0038] 实施例1试剂盒的制备
[0039] I. TGEV N蛋白表达载体的构建
[0040] 提取猪传染性胃肠炎病毒感染病猪（江苏省洪泽鑫象猪场）肠道病料RNA，扩增 获得其N基因（登录号JX827607. 1)。N基因连接pMD19-T载体（TaKaRa)，16°C连接过夜。 连接产物转化Trans5a感受态细胞（TaKaRa)，并涂布至氨节青霉素抗性（100mg/ml)的LB 平板，37°C培养过夜。挑取单克隆，于氨苄青霉素抗性的LB培养基中振荡培养IOh后，提取 质粒，酶切鉴定。将初步鉴定为阳性的菌液进行测序。选取测序正确的PMD18-T-N质粒，与 pET-28a空质粒（Novagen)，分别使用BamH I与Sal I双酶切。酶切产物进行琼脂糖凝胶 电泳，分别切取N基因目的条带与pET-28a载体条带，切胶回收。回收产物16°C连接过夜。 连接产物转化Trans5a感受态细胞，常规化选取阳性克隆，提取菌体质粒酶切鉴定，如图1 所示，获得pET-28a-N重组质粒。
[0041] 2.重组表达质粒的诱导表达
[0042] 重组pET-28a-N质粒转化BL21 (DE3)感受态细胞（TaKaRa)，常规化选取阳性克 隆，提取菌体质粒酶切鉴定，命名为pET-28a-N/BL21。pET-28a-N/BL21表达菌活化培养，至 A600 = 0. 6,取Iml菌液保存，加入0. 1 % IPTG进