定量检测人表皮生长因子受体2的干式荧光免疫试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种测定全血、血清、血浆的干式荧光免疫试剂盒及其测试方法，尤其是涉及一种定量检测人表皮生长因子受体2的干式荧光免疫试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor,缩写 EGFR)是 ErbB 家族成员之一，具有酪氨酸激酶活性，是一种重要的跨膜受体。EGFR被配体激活后，启动胞内信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化、凋亡，且与肿瘤的形成和恶化密切相关。
[0003]目前乳腺癌已成为女性最常见的恶性肿瘤，也是常见的女性肿瘤死亡原因之一。大约有20%?30%的乳腺癌患者HER-2 / neu高表达，HER-2 / neu高表达与患者的不良预后密切相关。HER-2 / neu基因是人表皮尘长因子家族的第2位成员。定位于染色体17q21，其编码一种分子量为185ku的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，结构上分为膜外配体结合域、跨膜区和膜内酪氨酸激酶的活性域。HER-2 / neu蛋白的胞外部分可以从细胞的表面脱落至血液中，形成分子量大约为105ku的可溶性蛋白HER-ZE⑶。HER-ZE⑶的裂解启动了细胞膜上的受体磷酸化，从而激活了细胞核内her-2并导致基因转录、细胞增殖；或ECD裂解后，截短的细胞内酪氨酸激酶保持信号传导能力，相应的实验结果认为ECD的裂解会使细胞膜上的P95发尘磷酸化，从而导致肿瘤细胞的增殖。
[0004]HER-2蛋白通常只在胎儿时期表达，成年以后只在极少数组织内低水平表达。然而有研究表明30%以上的人类肿瘤中存在HER-2基因的扩增/过度表达(如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、胃癌和前列腺癌等)；其中20% -30%的原发性浸润性乳腺癌有HER2基因的扩增/过度表达。研究证实:HER_2的过度表达与肿瘤(尤其是乳腺癌)的发尘和侵袭有关，可提高转移的危险；转染的细胞和动物模型证实，其可改变肿瘤对激素和化疗药物的敏感性。
[0005]我国于2006年10月制订发布了《乳腺癌HER2检测指南》。美国临床肿瘤学会(ASCO)和美国病理家学会(CAP)于2006年12月11日联合发布了《乳腺癌HER2检测的ASCO / CAP指南共识》并在2013年再次更新了此指南，强调了检测中易出现误差的环节、内部及外部质量控制和保证程序，旨在使检测的操作程序和对结果判读的标准化，提高HER2检测的可重复性和准确性。因此，定量检测人表皮尘长因子受体2 (HER-2)具有非常重要的意义。本发明涉及干式荧光免疫检测HER-2的试剂盒其检测的在提高准确性的前提下，对于易用性方面更有利人表皮生长因子受体2 (HER-2)实际操作检测减少人为误差。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种特异性强，灵敏度高，获得检测结果的时间短，操作方式简便，检测结果准确可靠的定量检测人表皮尘长因子受体2 (HER-2)的干式荧光免疫试剂盒及检测方法。
[0007]本发明的定量检测人表皮生长因子受体2的干式荧光免疫试剂盒，定量检测人表皮尘长因子受体2的干式荧光免疫试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括HER-2试剂卡、HER-2缓冲液和HER-2标准卡；
[0008]所述的HER-2试剂卡为一种用于干式免疫层析试验的膜载体，HER-2试剂卡包括带有粘合剂的衬板，衬板上设有相互搭接的样品垫、抗体承载膜和吸水垫，其中，所述的抗体承载膜为硝酸纤维素膜；所述的抗体承载膜上涂有线状或带状的作为质控线的兔抗小鼠2抗和线状或带状的作为检测线的小鼠抗人HER-2的单克隆抗体；所述的HER-2缓冲液含有抗HER-2单克隆抗体与三羟甲基氨基甲烷(TRIS)、MAK33和甲基纤维素；所述的HER-2标准卡中存储有HER-2标准曲线。
[0009]本发明的定量检测人表皮尘长因子受体2的干式荧光免疫试剂盒，其中所述的HER-2试剂卡采用如下步骤制成:
[0010]1、称取7g三轻甲基氨基甲烧(TRIS)、lg NaN3和6g甲基纤维素于容器中，称取4g吐温20 (TWEEN-20)，加适量水使吐温20 (TWEEN-20)完全溶解后，倒入上述容器中；
[0011]2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于1ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述容器中，然后在容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；
[0012]3、加入盐酸或氢氧化钠溶液调节容器中溶液的pH，控制pH在7.95-8.05之间；
[0013]4、称取牛血清白蛋白(BSA) 3g，四环素0.04g,硫酸新霉素lg，全部倒入上述容器中，充分混匀；
[0014]5、用纯化水将容器中的溶液定容至1000ml，用0.2u μ m滤器过滤，得到免疫缓冲液，，备用；
[0015]6、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul 二甲基亚砜(DMSO)中，备用；取2mg兔抗小鼠抗体溶于PH9.5的0.1mol / L PB缓冲液中至总体积为1ml，获得一级抗体溶液，用移液枪吸取备用的溶于50ul 二甲基亚砜(DMSO)中的辛二酸二琥珀酰亚胺酯，加入到所述一级抗体溶液中，置室温90min,获得二级抗体溶液；
[0016]7、将步骤6获得的二级抗体溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机中，在3000g下离心30min,浓缩至0.5ml,获得三级抗体溶液；
[0017]8、取0.5ml荧光颗粒,加入5ml反应杯中，经静置沉淀2分钟后,吸取上清,然后向反应杯中加入1.5ml PH9.50.1mol / L PB，混匀30秒，然后向反应杯中加入步骤7获得的三级抗体溶液中，保持混匀状态，室温反应4小时，获得已经标记的荧光颗粒的保存液；
[0018]9、向步骤8所述的反应杯中加入0.3mllmol / L的TRIS溶液室温反应30分钟，然后向反应杯中加入1.5ml PH7.20.1mol / L PB清洗已经标记的荧光颗粒的保存液，混匀30秒；
[0019]10、用1ml PH7.20.1mol / L PB将步骤9获得的已经标记的荧光颗粒转入玻璃瓶；
[0020]11、将1.5mg小鼠抗人HER-2抗体溶于5ml步骤9获得的已经标记的荧光颗粒的保存液中，再将该已经标记的荧光颗粒的保存液加入到步骤10中的玻璃瓶中，混匀反应2小时，再向玻璃瓶中加入5ml PH7.20.1mol / LPB清洗已经标记的免疫荧光颗粒，并混匀30秒；
[0021]12、用50ml荧光颗粒保存液将免疫荧光颗粒转入玻璃瓶，配制得免疫荧光颗粒浓度为0.05%的标准浓度荧光颗粒使用液；
[0022]13、将步骤12获得的溶液与步骤5获得的免疫缓冲液按照1:1的体积比例混匀，即得HER-2荧光颗粒试剂(其使用浓度为0.025% )；
[0023]14、将步骤7所得的三级抗体溶液与步骤13所得的HER-2荧光颗粒试剂分别以线状或带状连接抗体承载膜上形成质控线与检测线。并在带有粘合剂的衬板上相互搭接地粘合样品垫、抗体承载膜、吸水膜，即得所述的HER-2试剂卡；
[0024]所述HER-2缓冲液采用如下步骤制成
[0025]1、取 Tris6.06g、NaC113.0g、Zncl20.05g、Proclin-3000.2ml 和 MgC120.05g 于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使其中的固体完全溶解；
[0026]2、加入盐酸或氢氧化钠溶液调烧瓶中溶液pH，控制pH在7.35-7.45范围内；
[0027]3、称取牛血清白蛋白(BSA) 3g倒入上述烧杯中；
[0028]4、用纯化水定容至1000ml,用0.2u μ m滤器过滤,得试剂I稀释液，备用；
[0029]5、取1mg抗HER-2单克隆抗体，加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM尚心20分钟,浓缩至I晕升，获得浓缩液；
[0030]6、向步骤5获得浓缩液中加入0.2ml的0.1M Na104溶液，室温下避光搅拌20分钟，然后装入透析袋中，用ImM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜，收集保留液；
[0031]7、向步骤6获得保留液中加入0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使pH升高到9.0，然后立即加入2.5mg抗HER-2单克隆抗体,搅拌2小时,再加入0.1ml的4mg / ml NaBH4溶液，混匀，置4°C下2小时；
[0032]8、将步骤7获得溶液装入透析袋中，用0.15M PH7.4PBS透析，4°C过夜，收集保留液；
[0033]9、向步骤8获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4°C I小时，然后3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0.15M pH7.4的PBS中，获得溶液；
[0034]10、将步骤9获得的溶液装入透析袋