一种用于蛋白同化激素免疫分析的酶标抗原及分析方法
【技术领域】
[0001]本发明属于小分子化合物免疫化学和多残留分析技术领域，尤其是涉及一种用于蛋白同化激素免疫分析的酶标抗原及分析方法。
【背景技术】
[0002]蛋白同化激素(anabolic steroid)亦称同化激素，是甾体类激素。其主要包括诺龙(17 β -19-nortestosterone)，群勃龙(β -trenbolone)、丙酸诺龙(19-nortestosterone prop1nate)、雄诺龙(stanolone)、美雄诺龙(mestanolone)和替勃龙(tibolone)等。
[0003]蛋白同化激素过多在人体内蓄积会对机体多方面造成不良影响。例如，在人的肝功能异常中，蛋白同化激素作用会使谷草转氨酶、碱性磷酸酶酶、胆红素、和谷丙转氨酶活性提高，对肝脏产生毒副作用，形成肝充血性囊肿，甚至癌症的。而据可靠相关报道表明，心血管病中的冠心病是由蛋白同化激素中低密度脂蛋白胆固醇过高而引起。此外，蛋白同化激素中的类固醇能够极大影响生殖系统发育。儿童或少年食用过多蛋白同化激素会出现不良发育的现行。常见的表现有身材矮小，肌肉不自主抽搐等。
[0004]然而，由于蛋白同化激素经常被非法添加到动物食用的饲料当中，用以促进动物增长，造成我国食品中此类药物残留现象大量存在，严重扰乱了食品市场，影响了食品安全。为打击这种行为，我国已经明确规定在食用动物饲养中严禁使用蛋白同化激素。同时，在动物源性食品及功能食品中不得检出。
[0005]目前，比较常见的高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)和酶联免疫吸附法(ELISA)都有被用来检测蛋白同化激素。传统仪器方法存在前处理复杂，仪器和相应配套费用昂贵，无法大规模进行平行样同时检测等缺点。而酶联免疫的最低检出限往往无法达到我国对于此类物质的检出限要求。因此迫切需要开发更加简便、快速、灵敏的分析技术。
[0006]化学发光免疫分析方法(chemiluminescence immunoassay, CLIA)结合了传统酶联免疫法在大批量样品快速检测方面和化学发光测定技术高灵敏度两方面优势，近年来在小分子有害化合物的免疫分析方法开发方面成为研宄热点。
[0007]但是与大分子不同，小分子化合物免疫分析有自身特点:
[0008](I)小分子化合物(MW ( 100dolton) 一般不具有免疫原性，不能直接免疫动物产生特异性抗体、必须合成突出分子立体结构特异性部位的半抗原，并与大分子载体连接构成接合物，才能免疫动物产生针对这一目标小分子化合物的特异性抗体。这种半抗原与大分子载体的结合物称为人工抗原。人工抗原的制备不是任意的，包括结合位点、结合方式、载体种类、以及半抗原与目标分析物任何结构上的差异如大小、形状、成份、构型、构象、极性、电子云密度等等在内的诸因素，都可能极大地影响着相应抗体的性质，因此它们是决定产生其特异性抗体和建立免疫分析方法的关键。
[0009](2)虽然小分子化合物不具有免疫原性，但具有反应原性，即具有与相应抗体发生免疫学反应的能力，并可进行体外定量，遵循质量作用定律。
[0010]免疫分析技术被引入小分子残留分折领域，成为一种最有发展和应用潜力的定量分析技术之一，受到广泛的重视。该技术研宄的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。因此，目标分析物分子免疫学特性，以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性，是该领域重要的研宄内容。这一技术目前已成为微量分析研宄的一个崭新领域，可与传统分析方法并列作为一项新的分析途径。
[0011](3)化学发光免疫分析法在免疫分析方法的基础上，根据化学发光反应在某一时间点的发光强度(例如峰值强度)或发光总量来确定反应中各组分含量。相比传统的酶联免疫分析方法，其灵敏度能够大大提高。
[0012]目前文献报道的蛋白同化激素免疫分析方法普遍广谱性差，一般能同时检测一至三种蛋白同化激素药物，而针对三种以上蛋白同化激素药物残留化学发光免疫分析方法尚未见报道。蛋白同化激素药物种类繁多，广泛应用并有一定疗效的也有几十种。如果采用现有的这些分析方法检测实际样品，往往造成一些蛋白同化激素药物无法被检出，检测结果与样品中真实的蛋白同化激素残留量差别较大的情况。因此有必要提供一种能够同时检测出多种蛋白同化激素的分析方法，解决上述问题，提高免疫检测准确度和检测效率。
【发明内容】
[0013]有鉴于此，本发明旨在提出一种用于蛋白同化激素免疫分析的酶标抗原及分析方法，以克服传统酶联免疫分析方法灵敏度低的缺点并解决当前蛋白同化激素药物多残留检测方法缺乏的问题，结合化学发光技术能够同时检测诺龙、群勃龙、丙酸诺龙、雄诺龙和美雄诺龙等五种蛋白同化激素的免疫分析方法。
[0014]为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的:
[0015]一种用于蛋白同化激素免疫分析的酶标抗原，由诺龙半抗原与辣根过氧化酶连接合成，其制备包括如下步骤；
[0016]I)诺龙半抗原的制备，称取0.5?2.0g诺龙溶于10?25mL无水四氢呋喃中，并加入0.5?2.0g 丁二酸酐、0.6?2.0mL三乙胺和0.2?1.5g4_ 二甲氨基吡啶，在62?70°C温度下持续反应8?17h，随后将溶剂旋干，生成物用体积比为1:2?5:6的石油醚与乙酸乙酯的混合液溶解；以体积比为1:2?5:6的石油醚与乙酸乙酯的混合液为展开剂，进行纯化得到白色晶体，即为诺龙半抗原；
[0017]2)通过活化酯法，以羟基CO = OH为桥梁，使诺龙人工半抗原连接到辣根过氧化酶上，即得到酶标抗原。
[0018]优选的，步骤I)中，称取1.316g诺龙溶于14.50mL无水四氢呋喃中，并加入0.960g 丁二酸酐、1.32mL三乙胺和0.584g4_ 二甲氨基吡啶，在60°C温度下持续反应12h，随后将溶剂旋干，生成物用体积比为1:1的石油醚与乙酸乙酯的混合液溶解；以体积比为1:1的石油醚与乙酸乙酯的混合液为展开剂，进行纯化得到白色晶体，即为诺龙半抗原。
[0019]优选的，步骤2)中，酶标抗原的制备包括如下步骤，
[0020]a)准确称量0.03?0.04mmol诺龙半抗原溶于250?350 μ LN-N 二甲基甲酰胺溶液中，分别加入3.5?5.5mgl-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和2?3mgN_羟基琥珀酰亚胺避光5?6°C搅拌反应8?12h，得甲液；[0021 ] b)准确称量11?12mg辣根过氧化酶，加入到3?5mL的碳酸氢钠缓冲液中，缓冲溶液的pH为6?8，待完全溶解，得乙液，在冰浴条件下将甲液缓慢加入到乙液中，待完全加入后，3?6°C避光搅拌8?12h，然后将反应液在3?6°C、pH为6?8的磷酸盐缓冲溶液中透析2?4天，即得到酶标抗原溶液。
[0022]优选的，步骤2)中，酶标抗原的制备包括如下步骤，
[0023]a)准确称量0.02mmol溶于300 μ LN-N 二甲基甲酰胺溶液中，分别加入4.78mgl-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和2.75mgN-羟基琥珀酰亚胺避光4°C搅拌反应1h左右，得甲液；
[0024]b)准确称量10.0Omg辣根过氧化酶，加入到4mL的碳酸氢钠缓冲液中，缓冲溶液的PH为7.4，待完全溶解，得乙液，在冰浴条件下将甲液缓慢地加入到乙液中，待完全加入后，4°C避光搅拌12h，然后将反应液在4°C、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，即得到酶标抗原溶液。
[0025]本发明中合成了小分子目标分析物的半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效的酶标抗原。该技术研宄